Name: in vesiculo synthesis of peptide membrane precursors for autonomous vesicle growth
Uploaded: 2019-06-28T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth at JoVE.com

אנו מכירים את התמיכה הפיננסית באמצעות DFG TRR 235 (הופעתה של החיים, פרויקט P15), מועצת המחקר האירופית (הסכם הענקת no. 694410 AEDNA), ואת הספר הבינלאומי של טום בוגרת למדעים והנדסה IGSSE (פרויקט מס ' 9.05) . אנו מודים לא פאלגנאואר על עזרתה בהכנה לדוגמא. אנו מודים לגבי א. דבין ו-M. שוורץ-שילינג על עזרתם עם מערכת TX-TL ודיונים שימושיים. אנו מודים לנ. ב. הולנד על דיונים שימושיים.

1. ביטוי של אלסטין כמו פוליפפטידים
<ol><li>יום 1: הכנת תרבות ואספקה ראשונית לביטוי פפטיד
	<ol>
<li>הכנה ואוטוקלב ביטוי התרבות מבחנות (4 x 2.5 L) ו 3 L של LB מדיום. עבור 1 L של LB בינונית, להוסיף 25 גרם של אבקת LB ל 1 ליטר של מים באולטרטהורים.</li>
		<li>הכנת תרבות המתחיל עם 100 mL של LB מדיום, 50 μl של סטרילי-מסונני?...

<ol>
	<li>Chen, I. A., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+kinetic+study+of+the+growth+of+fatty+acid+vesicles.">A kinetic study of the growth of fatty acid vesicles.</a> Biophysical Journal. 87 (2), 988-998 (2004).</li><li>Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggered+gene+expression+in+fed-vesicle+microreactors+with+a+multifunctional+membrane.">Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51 (13), 3114-3118 (2012).</li><li>Hardy, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-reproducing+catalyst+drives+repeated+phospholipid+synthesis+and+membrane+growth.">Self-reproducing catalyst drives repeated phospholipid synthesis and membrane growth.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8187-8192 (2015).</li><li>Scott, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Free+Phospholipid+Biosynthesis+by+Gene-Encoded+Enzymes+Reconstituted+in+Liposomes.">Cell-Free Phospholipid Biosynthesis by Gene-Encoded Enzymes Reconstituted in Liposomes.</a> PLoS ONE. 11 (10), e0163058 (2016).</li><li>Deamer, D. W., Barchfeld, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+of+macromolecules+by+lipid+vesicles+under+simulated+prebiotic+conditions.">Encapsulation of macromolecules by lipid vesicles under simulated prebiotic conditions.</a> Journal of Molecular Evolution. 18 (3), 203-206 (1982).</li><li>Adamala, K., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonenzymatic+Template-Directed+RNA+Synthesis+Inside+Model+Protocells.">Nonenzymatic Template-Directed RNA Synthesis Inside Model Protocells.</a> Science. 342 (6162), 1098-1100 (2013).</li><li>Zhu, T. F., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupled+growth+and+division+of+model+protocell+membranes.">Coupled growth and division of model protocell membranes.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (15), 5705-5713 (2009).</li><li>Kurihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-reproduction+of+supramolecular+giant+vesicles+combined+with+the+amplification+of+encapsulated+DNA.">Self-reproduction of supramolecular giant vesicles combined with the amplification of encapsulated DNA.</a> Nature Chemistry. 3 (10), 775-781 (2011).</li><li>Chu, H. -. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+analysis+of+an+elastin-like+polypeptide+(ELP)+in+a+cell-free+protein+synthesis+system.">Expression analysis of an elastin-like polypeptide (ELP) in a cell-free protein synthesis system.</a> Enzyme and Microbial Technology. 46 (2), 87-91 (2010).</li><li>Martino, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Expression,+Aggregation,+and+Triggered+Release+from+Polymersomes+as+Artificial+Cell-like+Structures.">Protein Expression, Aggregation, and Triggered Release from Polymersomes as Artificial Cell-like Structures.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51 (26), 6416-6420 (2012).</li><li>Vogele, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+synthetic+cells+using+peptide-based+reaction+compartments.">Towards synthetic cells using peptide-based reaction compartments.</a> Nature Communications. 9 (1), 3862 (2018).</li><li>Huber, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+amphiphilic+proteins+as+building+blocks+for+the+intracellular+formation+of+organelle-like+compartments.">Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments.</a> Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2014).</li><li>McPherson, D. T., Xu, J., Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Product+purification+by+reversible+phase+transition+following+Escherichia+coli+expression+of+genes+encoding+up+to+251+repeats+of+the+elastomeric+pentapeptide+GVGVP.">Product purification by reversible phase transition following Escherichia coli expression of genes encoding up to 251 repeats of the elastomeric pentapeptide GVGVP.</a> Protein Expression and Purification. 7 (1), 51-57 (1996).</li><li>Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+chemistry+of+biological+free+energy+transduction+as+demonstrated+by+elastic+protein-based+polymers.">Physical chemistry of biological free energy transduction as demonstrated by elastic protein-based polymers.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 101 (51), 11007-11028 (1997).</li><li>Urry, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin:+a+representative+ideal+protein+elastomer.">Elastin: a representative ideal protein elastomer.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 357 (1418), 169-184 (2002).</li><li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+recombinant+proteins+by+fusion+with+thermally-responsive+polypeptides.">Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides.</a> Nature Biotechnology. 17 (11), 1112-1115 (1999).</li><li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+synthesis+of+protein-based+polymers+with+precisely+specified+molecular+weight+and+sequence+by+recursive+directional+ligation:+examples+from+the+elastin-like+polypeptide+system.">Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system.</a> Biomacromolecules. 3 (2), 357-367 (2002).</li><li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology.">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).</li><li>Caschera, F., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+2.3+mg/ml+of+protein+with+an+all+Escherichia+coli+cell-free+transcription-translation+system.">Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system.</a> Biochimie. 99, 162-168 (2014).</li><li>Schwarz-Schilling, M., Aufinger, L., M&#252;ckl, A., Simmel, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+communication+between+bacteria+and+cell-free+gene+expression+systems+within+linear+chains+of+emulsion+droplets.">Chemical communication between bacteria and cell-free gene expression systems within linear chains of emulsion droplets.</a> Integrative Biology. 8 (4), 564-570 (2016).</li><li>Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+All+E.+coli+TX-TL+Toolbox+2.0:+A+Platform+for+Cell-Free+Synthetic+Biology.">The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology.</a> ACS Synthetic Biology. 5 (4), 344-355 (2016).</li><li>Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+and+polymersomes:+a+comparative+review+towards+cell+mimicking.">Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking.</a> Chemical Society Reviews. 47 (23), 8572-8610 (2018).</li><li>Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Broccoli Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broccoli:+Rapid+Selection+of+an+RNA+Mimic+of+Green+Fluorescent+Protein+by+Fluorescence-Based+Selection+and+Directed+Evolution.">Broccoli: Rapid Selection of an RNA Mimic of Green Fluorescent Protein by Fluorescence-Based Selection and Directed Evolution.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).</li><li>Zhang, S., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purifying+Plasmid+DNA+from+Bacterial+Colonies+Using+the+Qiagen+Miniprep+Kit.">Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), 247 (2007).</li><li>Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+light+scattering:+a+practical+guide+and+applications+in+biomedical+sciences.">Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences.</a> Biophysical Reviews. 8 (4), 409-427 (2016).</li></ol>

חידוש הסרט הוא הליך נפוץ ליצירת unilamellar שלפוחיות קטנות. המקור העיקרי לכישלון הוא טיפול שגוי של החומרים המשמשים בהליך.

בתחילה, the ELPs מיוצרים על ידי E. coli תאים. התשואה לאחר טיהור שלום יכולה להשתנות באופן משמעותי בהתאם לאופן הפעולה הקפדני...

בדרך כלל מתקרבים ליצירת מערכות סלולריות מהחי הסינתטי משני כיוונים שונים. בשיטה מלמעלה למטה, הגנום של חיידק מופחת לרכיבים החיוניים שלו, בסופו של דבר מוביל לתא מינימלי. בגישה מלמטה-למעלה, תאים מלאכותיים מורכבים דה נובו מרכיבים מולקולריים או מערכות משנה סלולרית, אשר צריך להיות משולבים באופן פונקציונלי לתוך מערכת עקבית כמו תא.
בגישה דה נובו, מידור של הרכיבים הביוכימיים הנחוצים מושגת בדרך כלל באמצעות ממברנות העשויים פוספוליפידים או חומצות שומן1,2,3,4. הסיבה לכך היא "מודרני" ממברנות תא מורכב בעיקר פוספוליפידים, בעוד חומצות שומן נחשבים מועמדים סביר של מארזים ממברנה preביוטית5,6. עבור היווצרות של ממברנות חדשים או כדי להקל על גידול ממברנה, אבני בניין אמפיפילי חייב להיות מסופק מן החיצוני7 או אידיאלי באמצעות ייצור בתוך תא קרומי באמצעות תהליכים אנבוליים המקביל4 ,8.
בעוד סינתזה השומנים הוא תהליך מטבולית יחסית מורכב, פפטידים יכולים להיות מיוצר בקלות באמצעות תא-חינם ביטוי גנים תגובות9,10. מכאן, ממברנות פפטיד הנוצר על ידי פפטידים אמפיפילי מייצגים חלופה מעניינת לממברנות שומנים כמו מארזים עבור מחקה תא מלאכותי כי הם מסוגלים לצמוח11.
אלסטין (ELPs) בצורת בלוק-בלוקים (אלפס) הם מעמד אטרקטיבי של פפטידים, אשר יכולים לשמש כאבן בניין לקרומים כגון12. המוטיב הבסיסי של חומצה אמינית של elps הוא (gagvp)n, שם "a" יכול להיות כל חומצה אמינית למעט פרולין ו-"n" הוא מספר המוטיב חוזר13,14,15,16,17 . ELPs נוצרו עם בלוק הידרופובי המכיל בעיקר פנילאלנין עבור בלוק הידרופילי מורכב בעיקר של חומצה גלוטמית11. בהתאם לפרמטרים פתרון, כגון הריכוז pH ו מלח, ELPs התערוכה שנקרא טמפרטורה הופכי מעבר בטמפרטורה Tt, שבו הפפטידים עוברים מעבר שלב הפיך לחלוטין מן הידרופילי כדי הידרופובי מדינה. סינתזה של פפטידים ניתן ליישם בקלות בתוך שלפוחיות באמצעות "TX-TL" תא חיידקי לחלץ11,18,19,20,21, אשר מספק כל הרכיבים הנחוצים לשילוב תגובות שעתוק ותרגום.
מערכת ה-TX-TL הייתה מחולקת יחד, כאשר הקידוד של תבנית ה-DNA מגיע לתוך שלפוחית הידיים באמצעות התייבשות-מחדש מחרוזי זכוכית כתמיכה מוצקה. היווצרות של שלפוחיות מתרחשת באמצעות הסבה של הפפטידים היבשים מן המשטח חרוז11. שיטות נוספות22 עבור היווצרות שלפוחית לפוחית ניתן להשתמש, אשר עשוי להראות בגודל נמוך יותר וגדלים שלפוחית גדולה יותר (למשל, אלקטרו היווצרות, אמולסיה שלב העברת, או מיקרופלואידיקה שיטות מבוססות). כדי לבדוק את הכדאיות של שיטת עטיפת הגוף, שעתוק ברוקולי הפלואורוגנטי של ה-23 ניתן לחילופין להשתמש ב-11, שהוא מורכב פחות מביטוי גנטי עם מערכת TX-TL.
בשל ביטוי של ממברנה אבני בניין ב vesiculo ואת ההתאגדות הבאים שלהם לתוך קרום, שלפוחיות להתחיל לגדול11. התאגדות ממברנה של ELPs ניתן להדגים באמצעות שיטת הסריג. לשם כך, ELPs המשמש להקמת האוכלוסייה הראשונה שלפוחית השמש מצויישים עם צבעי פלורסנט במניות שוות המהווים זוג מסוג סריג. עם ההבעה של ELPs לא מתויג ב vesiculo התאגדות שלהם לתוך הקרום, ELPs מתויג בקרום מדולל וכתוצאה מכך האות הסריג מקטין11. כשיטה מגוונת ומשותפת לקוניוגציה, משתמשים בתוספת שימוש בנחושת מזרז לשימוש. עם השימוש בליגמים ייצוב וכגון טריס (בנזיל)-אמין, התגובה יכולה להתבצע בתמיסה מימית ב-pH פיזיולוגי ללא הידרוליזה של המגיבים11, אשר מתאים לתגובות בניינים מעורבים בפפטידים
הפרוטוקול הבא מציג תיאור מפורט של ההכנות לגידול peptidosomes המבוססים על. הביטוי של פפטידים ושלפוחית היווצרות באמצעות שיטת חרוזי זכוכית מתוארים. כמו-כן, הוא מתאר כיצד ליישם שעתוק של הברוקולי הפלואורוגנטי ותגובת התרגום לביטוי חלבון בתוך שלפוחית הדיבור. לבסוף, בתנאי הוא הליך עבור הקוניוגציה של ELPs עם fluorophores, אשר ניתן להשתמש בהם כדי להוכיח צמיחה שלפוחית באמצעות שיטת סריג11.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2xYT</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>3012-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-PGA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5PRIME Phase Lock GelTM tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>733-2478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alkine-conjugated Cy3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>777331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alkine-conjugated Cy5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>777358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benzamidin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CN38.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 Rosetta 2 E. coli strain</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>71402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford BSA Protein Assay Kit</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>500-0201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carbenicillin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6344.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloramphenicol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3886.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4432.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>USB</td>
			<td>14121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P024.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DFHBI</td>
			<td>Lucerna Technologies</td>
			<td>410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A994.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9065.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads, acid-washed</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>USB</td>
			<td>16800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (&#946;-isopropyl thiogalactoside )</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P017.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X968.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>82.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>KK36.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg-glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Bio-Spin Chromatography Columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>732-6204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N6522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-azide linker (y-azidobutyric acid oxysuccinimide ester)</td>
			<td>Baseclick</td>
			<td>BCL-033-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-8000</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>263.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH stripes</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>549.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6367.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate-buffered saline</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76180-684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphoric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W290017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethyleneimine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>408727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAPol reaction buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor murine</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0314S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap Wipes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rNTP</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0466S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roti-Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol</td>
			<td>Carlroth</td>
			<td>A156.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTS Amino Acid Sampler</td>
			<td>5 Prime</td>
			<td>2401530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit)</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>66382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9265.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium hydroxide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8655.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile-filtered (0.22 &#181;m filter)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>XH76.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0251S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBTA (tris(benzyltriazolylmethyl)amine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>678937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP (tris(2-carboxyethyl)-phosphine hydrochloride)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>BP1521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA (from E. coli)</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>MRE600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>USB</td>
			<td>23160</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vesiculo synthesis of peptide membrane precursors for autonomous vesicle growth

מידור של תגובות ביוכימית הוא היבט מרכזי של תאים סינתטיים. למטרה זו, פפטיד מבוססי תאים התגובה לשמש חלופה אטרקטיבית ליפוזומים או חומצת שומן מבוססי שלפוחיות. מבחוץ או בתוך שלפוחיות, פפטידים יכולים להתבטא בקלות ולפשט את הסינתזה של ממברנה מקדים. בתנאי זה הוא פרוטוקול ליצירת ושלפוחיות עם קטרים של ~ 200 ננומטר מבוסס על לאלסטין האמפיפיפילית כמו פוליפפטידים (למשל) ניצול התייבשות-לחות מחרוזי זכוכית. כמו כן מוצגים פרוטוקולים לביטוי וטיהור בקטריאלי באמצעות הטמפרטורה ההופכית רכיבה על אופניים, כמו גם הפונקציונליזציה שלהם עם צבעי פלורסנט. יתר על כן, דו ח זה מתאר פרוטוקול כדי לאפשר את שעתוק ה-RNA aptamer אלף dBroccoli רוקולי בתוך שלפוחית הצער כדוגמה מורכבת פחות עבור תגובה ביוכימית. לבסוף, פרוטוקול מסופק, אשר מאפשר vesiculo ביטוי של חלבונים פלורסנט ואת פפטיד ממברנה, בעוד סינתזה של התוצאות האחרונות צמיחת veלפוחית.

הפקת שלפוחית איור 1 מציג שידור אלקטרוני מיקרוסקופ (TEM) תמונות של שלפוחיות מוכנות עם פתרונות נפיחות שונים ושיטת חרוזי זכוכית (גם לראות Vogele et al.11). עבור המדגם באיור 1A, רק PBS שימש כפתרון נפיחות כדי להוכיח את היווצרות של שלפוחיות ולקבוע את ג...

Watch this Scientific Journal Video about In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth at JoVE.com

In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

ב והשרירים סינתזה של ממברנות פפטיד הפרה עבור הצמיחה שלפוחית אוטונומית

הציגו כאן הם פרוטוקולים ליצירת פפטיד מבוסס unilamellar שלפוחיות קטנות מסוגל לצמיחה. כדי להקל על ייצור vesiculo של פפטיד הממברנה, אלה שלפוחיות מצוידות עם תמלול-תרגום מערכת ו-פפטיד קידוד פלמיד.

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an ...

בפרוטוקול שלנו, אנו משתמשים בהידרציה מחדש של סרטים גם כדי ליצור תאי תגובה עשויים פפטידים. בניסויים, אנו נהנים מהפשטות והחזקה של הפרוטוקול. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת לשלב אפילו דגימות רגישות, כגון תמצית תאים גולמיים בשימוש.מגע עם ממיסים אורגניים ישפיע באופן משמעותי על המדגם. כדי להתחיל בהליך זה, השתמש רכז ואקום צנטריפוגלי לרכז את פתרון ELP ל 1.1 מילימולר. מערבבים 200 מיקרוליטרים של פתרון מרוכז זה עם 1, 250 מיקרוליטרים של תערובת כלורופורם ומתנול אחת.מערבולת הפתרון לערבב ביסודיות. לאחר מכן, מוסיפים 1.5 גרם של חרוזי זכוכית כדוריים לבקבוקון תחתון עגול 10 מיליליטר. מוסיפים את תוסף ה-ELP והמתנול הכלורופורם לבקבוק התחתון העגול, ומנערים בעדינות לערבב.חבר את הבקבוק לאידוי סיבובי. כווננו את המהירות ל-150 סל"ד והוסתו את הלחץ ל-20,000 פסקלים למשך כארבע דקות, עד שהנוזל מתאדה בטמפרטורת החדר. חשוב להיות זהיר בעת שימוש באידוי סיבובי עקב פיגור רותח אפשרי.לאחר מכן, לעטוף באופן רופף רדיד אלומיניום סביב פתיחת הבקבוק התחתון העגול כדי למנוע אובדן של חסידות זכוכית ולהניח את הבקבוק לתוך desiccator לפחות שעה אחת, כדי להבטיח כי כלורופורם הנותרים מתנול התאדו. לניסוי יחיד, יש לערבב 100 מיליגרם של גם 100 מיליגרם של גם 100 מיליגרם של גם גם 100 מיליגרם של גם תותבי הזכוכית המכסים בפפטיד עם 60 מיקרוליטרים של תותב נפיחות. דגירה מדגם זה ב 25 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.השתמש צנטריפוגה העליון שולחן צנטריפוגה את הדגימות במהירות לעים גם את גם גם את גם גם את גם גם את תריסי הזכוכית. לאחר מכן השתמש פיפטה כדי לאסוף את supernatant, אשר מכיל את הווסיקים. ראשית, מערבבים 100 מיקרוליטרים של הדנ"א הפלסמיד המטוהר מראש עם 100 מיקרוליטרים של רוטי-פנול, כלורופורם או אלכוהול איסואמיל בצינור מיקרו צנטריפוגה כדי לאפשר הפרדת פאזה טובה יותר.בעדינות להפוך את הצינור עד שש פעמים צנטריפוגה ב 16, 000 פעמים גרם וטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. לאחר מכן, להוסיף 200 microliters של כלורופורם לשלב העליון, ולהפוך את הצינור עד שש פעמים. צנטריפוגה המדגם ב 16, 000 פעמים גרם וטמפרטורת החדר במשך חמש דקות.לאחר מכן, פיפטה supernatant לצינור נפרד ולהוסיף 10 microliters של שלושה אצטט נתרן טוחן עבור משקעים אתנול. מוסיפים מיליליטר אחד של אתנול קר ב 80 מעלות צלזיוס ולאחסן את המדגם ב 80 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. לאחר מכן, צנטריפוגה המדגם ב 16, 000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.תפענחו את העל-טבעי ותוסיפו מיליליטר אחד של אתנול קר של 70% ב-20 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה ב 16, 000 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לאחר מכן, להסיר את הנוזל על ידי צינורות, נזהר לא להפריע גלולת DNA.לאחסן את המדגם בטמפרטורת החדר במשך כ 15 דקות כדי להתאדות את האתנול הנותר. לאחר מכן, להוסיף מים טהורים במיוחד לדגימה כדי להתאים את ריכוז המדגם כ 300 nanomolar, אשר נמדד על ידי ספיגה ב 260 ננומטר. כדי להכין את תגובת התמלול-תרגום, בצע את חילוץ התא הגולמי מוכן ואת חיץ התגובה על הקרח.לתערובת תגובה של 60 מיקרוליטר, הוסיפו את הדנ"א של הפלזמה ל-37.5 מיקרוליטרים של מאגר התגובה, הוסיפו 28.7 מיקרוליטרים של תמצית תאים גולמיים ומלאו במים טהורים במיוחד לנפח סופי של 58.8 מיקרוליטרים. ממש לפני תחילת התגובה, להוסיף 1.2 microliters של פתרון פולימראז T7RNA, ואת פיפטה למעלה ולמטה לערבב. דגירה המדגם ותוכי נפיחות ב 29 מעלות צלזיוס למשך הניסוי, שהוא בדרך כלל ארבע עד שמונה שעות.תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים שידור של וקסיקים מראות כי פתרונות נפיחות שונים, כגון TX / TL או אפילו רק PBS יכול לשמש כדי ליצור וקסיקים. עבור שני הפתרונות, קביעת גודל היא צעד קדימה ישר. פיזור אור דינמי מראה כי וריונים שהוכנו ללא שיטת קדמת הזכוכית לגרום לקוטר של 134 ננומטר, עם פולידיספרסיות של 25% כאשר נעשה שימוש בחרוזי זכוכית, הקוטר גורם ל-168 ננומטר, עם פולידיספרסיה של 21% עוצמת הפלואורסצנטיות של שני חלבונים פלואורסצנטיים, המתבטאים בתוך ורי ELP, נמדדת לאחר מכן באמצעות קורא לוחיות פלואורסצנטיות.חשוב לציין כי לאחר היווצרות ווסקל, התוכן של הויקלים ואת הפתרון החיצוני זהים, ולכן, אנטיביוטיקה Kanamycin מתווסף לפתרון החיצוני כדי לדכא ביטוי חלבון. כשליטה, Kanamycin מתווסף גם פתרון נפיחות, במקרה זה ביטוי חלבון בתוך הווסת. הדבר מצביע על כך שקנאמיצין אינו מתפזר דרך הממברנה, ומדכא כל הזמן את הביטוי הפנימי.לאחר מכן מתבצעת ההתמדה FRET כדי להדגים שילוב ELP לתוך הממברנה. עם הביטוי של ELPs הממברנה, פפטידים נוספים לשלב לתוך הממברנה, אשר מגדיל את המרחק הממוצע בין זוגות FRET, ומביים לעלייה של אות התורם. הטכניקה המוצגת יכולה לשמש לייצור מיכלי תגובה פשוטים או ליצירת תאים מלאכותיים עם ממברנות מבוססות פפטיד.ניתן לבחור את התוכן בפנים לפי הצורך. באמצעות ורידים פפטיד אלה, עכשיו אנחנו יכולים להסתכל קדימה על תגובות סינתזה מורכבות יותר בתוכם.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

אקסון צמיחה מתיחה: Mechanotransduction הצמיחה העצבית

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata ...

Gold Nanostar Synthesis with a Silver Seed Mediated Growth Method

זהב Nanostar סינתזה עם שיטת Seed כסף מתווכת צמיחה

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest ...

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

טיפוח האדם ובתאים עצבית ב Hydrogel עצמית להרכבת 3 מימדי פפטיד

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Generation and Recovery of ÃƒÅ½Ã‚Â²-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

דור ושחזור של spheroids β-תא מהידרוג שלב צמיחת PEG-פפטיד

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

השומנים bilayer שלפוחיות דור שימוש Microfluidic jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Analysis of Tubular Membrane Networks in Cardiac Myocytes from Atria and Ventricles

ניתוח של Tubular ממברנה רשתות בלב myocytes מאטרייה וחדרי לב

In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules - the transverse-axial tubule system (TATS) - controls deep intracellular signaling functions. ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

הארה תהודת אנרגיה העבר לחקר שינויי קונפורמציה בחלבונים בממברנה שבאו לידי ביטוי בתאי יונקים

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

קומפלקס polyelectrolyte למשלוח גורם הגדילה osteogenic דומיין כריכה הפרין

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Synthesis of Monocyte-targeting Peptide Amphiphile Micelles for Imaging of Atherosclerosis

סינתזה של פילוח מונוציט פפטיד אמפיפיליות הקזאין עבור הדמיה של טרשת עורקים

Atherosclerosis is a major contributor to cardiovascular disease, the leading cause of death worldwide, which claims 17.3 million lives annually. ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

Culturing בתרבית של תאים בפפטיד תלת מימדי פיגומים

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...