Name: in vesiculo synthesis of peptide membrane precursors for autonomous vesicle growth
Uploaded: 2019-06-28T14:10:00
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हम आभारी DFG TRR 235 के माध्यम से वित्तीय सहायता स्वीकार (जीवन की उद्भव, परियोजना P15), यूरोपीय अनुसंधान परिषद (अनुदान समझौते संख्या 694410 AEDNA), और TUM इंटरनेशनल ग्रेजुएट स्कूल के लिए विज्ञान और इंजीनियरिंग IGSSE (परियोजना सं. 9.05) . हम नमूना तैयारी के साथ उसकी मदद के लिए ई. Falgenhauer धन्यवाद. हम TX-TL प्रणाली और उपयोगी विचार विमर्श के साथ उनकी मदद के लिए ए Dupin और एम Schwarz-शिलिंग धन्यवाद. हम उपयोगी चर्चा के लिए एन बी हॉलैंड धन्यवाद.

1. इलैस्टिन की अभिव्यक्ति की तरह पॉलीपेप्टाइड्स
<ol><li>दिन 1: एक स्टार्टर संस्कृति और पेप्टाइड अभिव्यक्ति के लिए आपूर्ति की तैयारी
	<ol>
<li>तैयार करें और ऑटोक्लेव अभिव्यक्ति संस्कृति फ्लास्क (4 x 2.5 एल) और ?...

<ol>
	<li>Chen, I. A., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+kinetic+study+of+the+growth+of+fatty+acid+vesicles.">A kinetic study of the growth of fatty acid vesicles.</a> Biophysical Journal. 87 (2), 988-998 (2004).</li><li>Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggered+gene+expression+in+fed-vesicle+microreactors+with+a+multifunctional+membrane.">Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51 (13), 3114-3118 (2012).</li><li>Hardy, M. 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E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+synthesis+of+protein-based+polymers+with+precisely+specified+molecular+weight+and+sequence+by+recursive+directional+ligation:+examples+from+the+elastin-like+polypeptide+system.">Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system.</a> Biomacromolecules. 3 (2), 357-367 (2002).</li><li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology.">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).</li><li>Caschera, F., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+2.3+mg/ml+of+protein+with+an+all+Escherichia+coli+cell-free+transcription-translation+system.">Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system.</a> Biochimie. 99, 162-168 (2014).</li><li>Schwarz-Schilling, M., Aufinger, L., M&#252;ckl, A., Simmel, F. 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R., Landfester, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+and+polymersomes:+a+comparative+review+towards+cell+mimicking.">Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking.</a> Chemical Society Reviews. 47 (23), 8572-8610 (2018).</li><li>Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Broccoli Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broccoli:+Rapid+Selection+of+an+RNA+Mimic+of+Green+Fluorescent+Protein+by+Fluorescence-Based+Selection+and+Directed+Evolution.">Broccoli: Rapid Selection of an RNA Mimic of Green Fluorescent Protein by Fluorescence-Based Selection and Directed Evolution.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).</li><li>Zhang, S., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purifying+Plasmid+DNA+from+Bacterial+Colonies+Using+the+Qiagen+Miniprep+Kit.">Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), 247 (2007).</li><li>Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+light+scattering:+a+practical+guide+and+applications+in+biomedical+sciences.">Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences.</a> Biophysical Reviews. 8 (4), 409-427 (2016).</li></ol>

फिल्म पुनर्जलीकरण छोटे unilamellar vesicles के निर्माण के लिए एक आम प्रक्रिया है. विफलता का मुख्य स्रोत प्रक्रिया में प्रयुक्त सामग्री की गलत हैंडलिंग है।

प्रारंभ में, ELPs ई. को?...

सिंथेटिक रहने वाले सेलुलर सिस्टम के निर्माण आमतौर पर दो अलग अलग दिशाओं से संपर्क किया है. ऊपर से नीचे विधि में, एक जीवाणु के जीनोम अपने आवश्यक घटकों के लिए कम है, अंततः एक न्यूनतम सेल के लिए अग्रणी. नीचे-अप दृष्टिकोण में, कृत्रिम कोशिकाओं आणविक घटकों या सेलुलर उपतंत्र है, जो कार्यात्मक एक सुसंगत सेल की तरह प्रणाली में एकीकृत करने की आवश्यकता से de नोवो इकट्ठा कर रहे हैं.
डी नोवो दृष्टिकोण में, आवश्यक जैव रासायनिक घटकों के कम्पार्टलेशन को प्राय : फॉस्फोलिपिड या फैटी एसिड से बनी झिल्ली का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है1,2,3,4. इसका कारण यह है कि "आधुनिक" कोशिका झिल्ली मुख्य रूप से फॉस्फोलिपिड से मिलकर बनता है, जबकि फैटी एसिड को प्रीबायोटिक झिल्ली बाड़ों5,6 के विश्वसनीय उम्मीदवार माना जाताहै। नई झिल्ली के गठन के लिए या झिल्ली के विकास की सुविधा के लिए, उभयरागी इमारत ब्लॉकों बाहरी से प्रदान किया जाना चाहिए7 या आदर्श इसी anabolic प्रक्रियाओं का उपयोग कर एक झिल्ली डिब्बे के भीतर उत्पादन के माध्यम से4 ,8.
जबकि लिपिड संश्लेषण एक अपेक्षाकृत जटिल चयापचय प्रक्रिया है, पेप्टाइड्स काफी आसानी से सेल मुक्त जीन अभिव्यक्ति प्रतिक्रियाओं का उपयोग कर उत्पादन किया जा सकताहै 9,10. अतः उभयरागी पेप्टाइड्स द्वारा बनाई गई पेप्टाइड झिल्ली लिपिड झिल्ली के लिए कृत्रिम कोशिका नकल के लिए बाड़ों के रूप में एक दिलचस्प विकल्प का प्रतिनिधित्व करती हैं जो11विकसित करने में सक्षम हैं।
एम्फीफिलिक इलैस्टिन जैसे डाइ-ब्लॉक सहबहुलक (ईएलपीएस) पेप्टाइड्स का एक आकर्षक वर्ग है, जो ऐसी झिल्ली12के लिए बिल्डिंग ब्लॉक के रूप में काम कर सकता है। ELPs की बुनियादी एमिनो एसिड अनुक्रम आकृति है (GaGVP)n, जहां "क" proline के लिए छोड़कर किसी भी एमिनो एसिड हो सकता है और "एन" आकृति दोहराता की संख्या है13,14,15,16,17 . ईएलपी का निर्माण एक हाइड्रोफोबिक ब्लॉक के साथ किया गया है जिसमें मुख्य रूप से फेनिलएलनिन होता है , जिसमें मुख्य रूप से ग्लूटामिक एसिड11से बना एक हाइड्रोफिलिक ब्लॉक होता है . एक और समाधान मानकों पर निर्भर करता है, इस तरह के पीएच और नमक एकाग्रता के रूप में, ELPs तापमानटीपर एक तथाकथित व्युत्क्रम तापमान संक्रमण प्रदर्शन , जहां पेप्टाइड्स एक हाइड्रोफिलिक से हाइड्रोफोबिक के लिए एक पूरी तरह से प्रतिवर्ती चरण संक्रमण से गुजरना राज्य. पेप्टाइड्स के संश्लेषण आसानी से "TX-TL" जीवाणु कोशिका निकालने का उपयोग कर vesicles के अंदर लागू किया जा सकताहै 11,18,19,20,21, जो प्रदान करता है युग्मित प्रतिलेखन और अनुवाद प्रतिक्रियाओं के लिए सभी आवश्यक घटक.
TX-TL प्रणाली एक साथ encapsulated था, डीएनए टेम्पलेट ELP vesicles में ELPs एन्कोडिंग के साथ एक ठोस समर्थन के रूप में कांच मोती से निर्जलीकरण निर्जलीकरण का उपयोग. वेस्क्यूल का निर्माण मनका सतह11से सूखे पेप्टाइड्स के पुनर्जलीकरण के माध्यम से होता है . अन्य तरीकों22 vesicle गठन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो संभावित रूप से कम polydispersity और बड़ा vesicle आकार (उदाहरण के लिए, विद्युत गठन, पायस चरण हस्तांतरण, या microfluidics आधारित तरीकों) दिखा. encapsulation विधि की व्यवहार्यता का परीक्षण करने के लिए, fluorogenic aptamer dBroccoli23 के प्रतिलेखन वैकल्पिक रूप से इस्तेमाल किया जा सकता11, जो TX-TL प्रणाली के साथ जीन अभिव्यक्ति की तुलना में कम जटिल है.
वेसिकुलो में झिल्ली के निर्माण ब्लॉकों की अभिव्यक्ति और झिल्ली में उनके बाद में शामिल होने के कारण, vesicles11विकसित करने के लिए शुरू करते हैं। ELPs के झिल्ली निगमन एक FRET परख के माध्यम से प्रदर्शन किया जा सकता है. इस उद्देश्य के लिए, प्रारंभिक vesicle जनसंख्या के गठन के लिए इस्तेमाल किया ELPs बराबर शेयरों में फ्लोरोसेंट रंगों के साथ संयुग्मी हो रहे हैं एक FRET जोड़ी का गठन. वेसिकुलो में गैर-लेबल ईएलपी की अभिव्यक्ति और झिल्ली में उनके समावेश न करने पर, झिल्ली में लेबल किए गए ईएलपी पतला हो जाते हैं और परिणामस्वरूप FRET संकेत11कम हो जाता है। संयोजन के लिए एक बहुमुखी और आम विधि के रूप में, तांबे उत्प्रेरित azide-alkyne cycloaddition प्रयोग किया जाता है. ट्राइस (बेन्ज़िलट्रिजोलिलमेथिल)-एमीन जैसे स्थिर लिगन्ड के उपयोग के साथ, प्रतिक्रिया प्रतिक्रियाकर्ताओं के हाइड्रोलिसिस के बिना एक शारीरिक पीएच पर जलीय समाधान में किया जा सकता है11, जो संयोजन प्रतिक्रियाओं के लिए उपयुक्त है पेप्टाइड्स शामिल है.
निम्नलिखित प्रोटोकॉल ELP-आधारित peptidosomes बढ़ रहा है के लिए तैयारी का एक विस्तृत विवरण प्रस्तुत करता है. कांच मोती विधि का उपयोग पेप्टाइड्स और vesicle गठन की अभिव्यक्ति का वर्णन कर रहे हैं. इसके अलावा, यह कैसे fluorogenic dBroccoli aptamer और ELP vesicles के अंदर प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए प्रतिलेखन-अनुवाद प्रतिक्रिया के प्रतिलेखन को लागू करने के लिए वर्णित है. अंत में, प्रदान की फ्लोरोफोर के साथ ELPs के संयोजन के लिए एक प्रक्रिया है, जो एक FRET परख11के माध्यम से vesicle विकास साबित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2xYT</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>3012-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-PGA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5PRIME Phase Lock GelTM tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>733-2478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alkine-conjugated Cy3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>777331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alkine-conjugated Cy5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>777358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benzamidin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CN38.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 Rosetta 2 E. coli strain</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>71402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford BSA Protein Assay Kit</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>500-0201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carbenicillin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6344.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloramphenicol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3886.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4432.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>USB</td>
			<td>14121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P024.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DFHBI</td>
			<td>Lucerna Technologies</td>
			<td>410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A994.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9065.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads, acid-washed</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>USB</td>
			<td>16800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (&#946;-isopropyl thiogalactoside )</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P017.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X968.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>82.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>KK36.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg-glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Bio-Spin Chromatography Columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>732-6204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N6522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-azide linker (y-azidobutyric acid oxysuccinimide ester)</td>
			<td>Baseclick</td>
			<td>BCL-033-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-8000</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>263.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH stripes</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>549.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6367.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate-buffered saline</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76180-684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphoric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W290017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethyleneimine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>408727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAPol reaction buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor murine</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0314S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap Wipes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rNTP</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0466S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roti-Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol</td>
			<td>Carlroth</td>
			<td>A156.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTS Amino Acid Sampler</td>
			<td>5 Prime</td>
			<td>2401530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit)</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>66382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9265.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium hydroxide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8655.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile-filtered (0.22 &#181;m filter)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>XH76.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0251S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBTA (tris(benzyltriazolylmethyl)amine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>678937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP (tris(2-carboxyethyl)-phosphine hydrochloride)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>BP1521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA (from E. coli)</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>MRE600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>USB</td>
			<td>23160</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vesiculo synthesis of peptide membrane precursors for autonomous vesicle growth

जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं का Compartmentalization सिंथेटिक कोशिकाओं का एक केंद्रीय पहलू है. इस उद्देश्य के लिए, पेप्टाइड आधारित प्रतिक्रिया डिब्बों liposomes या फैटी एसिड आधारित vesicles के लिए एक आकर्षक विकल्प के रूप में सेवा करते हैं. बाह्य या vesicles के भीतर, पेप्टाइड्स आसानी से व्यक्त किया जा सकता है और झिल्ली अग्रदूतों के संश्लेषण को सरल. यहाँ प्रदान की गई $ 200 एनएम के व्यास के साथ vesicles के निर्माण के लिए एक प्रोटोकॉल है एम्फीफिलिक elastin की तरह पॉलीपेप्टाइड (ELP) कांच मोती से निर्जलीकरण-पुनर्जलीकरण का उपयोग के आधार पर. इसके अलावा प्रस्तुत उलटा तापमान साइकिल चालन के माध्यम से जीवाणु ELP अभिव्यक्ति और शुद्धि के लिए प्रोटोकॉल, साथ ही फ्लोरोसेंट रंगों के साथ उनके सहसंयोजक functionalization हैं. इसके अलावा, इस रिपोर्ट में एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए एक जैव रासायनिक प्रतिक्रिया के लिए एक कम जटिल उदाहरण के रूप में ELP vesicles के अंदर आरएनए aptamer dBroccoli के प्रतिलेखन सक्षम. अंत में, एक प्रोटोकॉल प्रदान की जाती है, जो फ्लोरोसेंट प्रोटीन और झिल्ली पेप्टाइड की vesiculo अभिव्यक्ति में अनुमति देता है, जबकि बाद के संश्लेषण vesicle विकास में परिणाम.

वेसिकल उत्पादन चित्र 1 विभिन्न सूजन समाधानों और कांच के मोतियों विधि के साथ तैयार किए गए vesiclesके संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (TEM) छवियों को दर्शाता है (यह भी Vogele एट अल 11 देखें)।...

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In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

स्वायत्त वेसिकल विकास के लिए पेप्टाइड झिल्ली precursors के Vesiculo संश्लेषण में

यहाँ प्रस्तुत पेप्टाइड आधारित छोटे unilamellar vesicles विकास में सक्षम के निर्माण के लिए प्रोटोकॉल हैं. झिल्ली पेप्टाइड के vesiculo उत्पादन में सुविधा के लिए, इन vesicles एक प्रतिलेखन अनुवाद प्रणाली और पेप्टाइड एन्कोडिंग प्लाज्मिड के साथ सुसज्जित हैं.

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an ...

हमारे प्रोटोकॉल में, हम पेप्टाइड्स से बने रिएक्शन डिब्बों को बनाने के लिए छोटे ग्लास मोतियों से फिल्म री-हाइड्रेशन का उपयोग करते हैं। प्रयोगों में, हम प्रोटोकॉल की सादगी और मजबूती से लाभान्वित होते हैं। इस तकनीक का मुख्य लाभ इस तरह के इस्तेमाल कच्चे तेल सेल निकालने के रूप में भी संवेदनशील नमूनों को शामिल करने की क्षमता है ।ऑर्गेनिक सॉल्वैंट्स के साथ संपर्क नमूने को काफी प्रभावित करेगा। इस प्रक्रिया को शुरू करने के लिए, 1.1 मिलीमोलर के लिए ईएलपी समाधान को केंद्रित करने के लिए एक अपकेंद्रित्र वैक्यूम सांद्रता का उपयोग करें। दो से एक क्लोरोफॉर्म और मेथनॉल मिश्रण के 1, 250 माइक्रोलीटर के साथ इस केंद्रित समाधान के 200 माइक्रोलीटर मिलाएं।भंवर समाधान अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए। इसके बाद, दस मिलीलीटर राउंड बॉटम फ्लास्क में 1.5 ग्राम गोलाकार ग्लास मोतियों को जोड़ें। गोल नीचे फ्लास्क के लिए ELP और क्लोरोफॉर्म मेथनॉल समाधान जोड़ें, और धीरे से मिश्रण करने के लिए हिला ।फ्लास्क को रोटरी वाष्पीकरण से जोड़ें। गति को 150 आरपीएम तक समायोजित करें और लगभग चार मिनट के लिए 20, 000 पास्कल के दबाव को विनियमित करें, जब तक कि तरल कमरे के तापमान पर सुखाया न जाए। संभावित उबलते मंदता के कारण रोटरी वाष्पीकरण का उपयोग करते समय सावधान रहना महत्वपूर्ण है।इसके बाद, कांच के मोतियों के नुकसान को रोकने के लिए गोल नीचे फ्लास्क के उद्घाटन के चारों ओर एल्यूमीनियम पन्नी को ढीला लपेटें और फ्लास्क को कम से कम एक घंटे के लिए एक डिसिकेटर में रखें, ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि शेष क्लोरोफॉर्म और मेथनॉल सुखाया गया है। एक ही प्रयोग के लिए, पेप्टाइड कवर ग्लास मोतियों के 100 मिलीग्राम को सूजन समाधान के 60 माइक्रोलीटर के साथ मिलाएं। इस नमूने को पांच मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।नमूनों को जल्दी से अपकेंद्रित्र करने और कांच के मोतियों को तलछट करने के लिए टेबल टॉप अपकेंद्रित्र का उपयोग करें। इसके बाद सुपरनेट को इकट्ठा करने के लिए एक पिपेट का इस्तेमाल करें, जिसमें वेसिकल्स होते हैं। सबसे पहले, पूर्व-शुद्ध प्लाज्मिड डीएनए के 100 माइक्रोलीटर को एक माइक्रो सेंट्रलाइज ट्यूब में रोटी-फिनोल, क्लोरोफॉर्म या आइसोमिल अल्कोहल के 100 माइक्रोलीटर के साथ मिलाएं ताकि बेहतर चरण पृथक्करण को सक्षम किया जा सके।धीरे-धीरे ट्यूब को छह बार और अपकेंद्रित्र को 16, 000 बार जी और कमरे के तापमान को पांच मिनट के लिए उलटा करें। फिर, ऊपरी चरण में क्लोरोफॉर्म के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें, और ट्यूब को छह बार तक उलटा करें। पांच मिनट के लिए 16, 000 बार जी और कमरे के तापमान पर नमूना अपकेंद्रित्र।इसके बाद, सुपरनेट को एक अलग ट्यूब में पिपेट करें और इथेनॉल वर्षा के लिए तीन मोलर सोडियम एसीटेट के 10 माइक्रोलीटर जोड़ें। 80 डिग्री सेल्सियस पर ठंड इथेनॉल का एक मिलीलीटर जोड़ें और एक घंटे के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर नमूना स्टोर करें। इसके बाद, 15 मिनट के लिए 16, 000 बार जी और चार डिग्री सेल्सियस पर नमूना अपकेंद्रित्र।सुपरनेट को डिकेंट करें और 20 डिग्री सेल्सियस पर 70% इथेनॉल की एक मिलीलीटर जोड़ें। पांच मिनट के लिए 16, 000 बार जी और चार डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रलाइज। फिर, डीएनए गोली को परेशान न करने के लिए सावधान रहें, पिपिंग करके तरल को हटा दें।शेष इथेनॉल को वाष्पित करने के लिए लगभग 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर नमूना स्टोर करें। इसके बाद, नमूना एकाग्रता को लगभग 300 नैनोमोलर में समायोजित करने के लिए नमूना में अल्ट्रा शुद्ध पानी जोड़ें, जिसे 260 नैनोमीटर पर अवशोषण द्वारा मापा जाता है। ट्रांसक्रिप्शन-ट्रांसलेशन रिएक्शन तैयार करने के लिए तैयार क्रूड सेल एक्सट्रैक्ट और बर्फ पर रिएक्शन बफर का पालन करें।एक 60 माइक्रोलीटर रिएक्शन मिश्रण के लिए, प्रतिक्रिया बफर के 37.5 माइक्रोलीटर के लिए प्लाज्मा डीएनए जोड़ें, कच्चे सेल निकालने के 28.7 माइक्रोलीटर जोड़ें और 58.8 माइक्रोलीटर की अंतिम मात्रा में अल्ट्रा शुद्ध पानी से भरें। प्रतिक्रिया शुरू होने से ठीक पहले, T7RNA पॉलीमरेज समाधान के 1.2 माइक्रोलीटर जोड़ें, और मिश्रण करने के लिए ऊपर और नीचे पिपेट करें। प्रयोग की अवधि के लिए 29 डिग्री सेल्सियस पर नमूना और सूजन समाधान को इनक्यूबेट करें, जो आमतौर पर चार से आठ घंटे होता है।वेसिकल्स की ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवियों से पता चलता है कि विभिन्न सूजन समाधान, जैसे TX/TL या यहां तक कि केवल पीबीएस का उपयोग वेसिकल्स बनाने के लिए किया जा सकता है । दोनों समाधानों के लिए, आकार निर्धारण एक सीधा आगे कदम है । गतिशील प्रकाश बिखरने से पता चलता है कि ग्लास मोतियों की विधि के बिना तैयार वेसिकल्स 134 नैनोमीटर के व्यास में परिणाम देते हैं, 25% की पॉलीडिस्पनेस के साथ जब कांच के मोतियों का उपयोग किया जाता है, तो व्यास का परिणाम 168 नैनोमीटर होता है, जिसमें 21% की पॉलीडिसेपरिटी होती है, दो फ्लोरोसेंट प्रोटीन की फ्लोरेसेस तीव्रता, जो ईएलपी वेसिकल्स के अंदर व्यक्त की जाती है, फिर फ्लोरेसेंस प्लेट रीडर का उपयोग करके मापा जाता है।यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि वेसिकल गठन के बाद, वेसिकल्स और बाहरी समाधान की सामग्री समान होती है, इस प्रकार, प्रोटीन अभिव्यक्ति को दबाने के लिए बाहरी समाधान में एंटीबायोटिक कानमाइसिन जोड़ा जाता है। नियंत्रण के रूप में, कनामाइसिन को सूजन समाधान में भी जोड़ा जाता है, जिस स्थिति में वेसिकल के अंदर प्रोटीन अभिव्यक्ति को दबा दिया जाता है। यह इंगित करता है कि कानमाइसिन झिल्ली के माध्यम से फैलाना नहीं है, और आंतरिक अभिव्यक्ति को लगातार दबाता है, हर समय।FRET परख तो झिल्ली में ELP निगमन प्रदर्शित करने के लिए किया जाता है । झिल्ली ELPs की अभिव्यक्ति पर, अतिरिक्त पेप्टाइड्स झिल्ली में शामिल हैं, जो FRET जोड़े के बीच औसत दूरी को बढ़ाता है, और जिसके परिणामस्वरूप दाता संकेत में वृद्धि होती है। प्रस्तुत तकनीक का उपयोग सरल प्रतिक्रिया कंटेनरों का उत्पादन करने या पेप्टाइड-आधारित झिल्ली के साथ कृत्रिम कोशिकाओं को बनाने के लिए किया जा सकता है।अंदर की सामग्री को आवश्यकतानुसार चुना जा सकता है। इन पेप्टाइड वेसिकल्स का उपयोग करके, अब हम उनके भीतर अधिक जटिल संश्लेषण प्रतिक्रियाओं पर आगे देख सकते हैं।

Research

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Bioengineering

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