Name: in vesiculo synthesis of peptide membrane precursors for autonomous vesicle growth
Uploaded: 2019-06-28T14:10:00
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Riconosciamo con gratitudine il sostegno finanziario attraverso il DFG TRR 235 (Emergence of Life, progetto P15), il Consiglio europeo della ricerca (accordo di sovvenzione n. 694410 AEDNA) e la TUM International Graduate School for Science and Engineering IGSSE (progetto n. 9.05) . Ringraziamo E. Falgenhauer per il suo aiuto con la preparazione del campione. Ringraziamo A. Dupin e M. Schwarz-Schilling per il loro aiuto con il sistema TX-TL e discussioni utili. Ringraziamo N. B. Holland per discussioni utili.

1. Espressione di Polipeptidi simili a Elastin
<ol><li>Giorno 1: Preparazione di una coltura di avviamento e forniture per l'espressione peptide
	<ol>
<li>Preparare e autoclave espressione coltura flaastri (4 x 2.5 L) e 3 L di lB medio. Per 1 L di LB medio, aggiungere 25 g di LB in polvere a 1 L di acqua ultrapura.</li>
		<li>Preparare una coltura di avviamento con una soluzione di clorramphenico di 100 mL di un lB medio, 50 -L di filtro sterile (filtro 0,22 m) (25 mg/mL in EtOH) e 50 lun di filtro ste...

<ol>
	<li>Chen, I. A., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+kinetic+study+of+the+growth+of+fatty+acid+vesicles.">A kinetic study of the growth of fatty acid vesicles.</a> Biophysical Journal. 87 (2), 988-998 (2004).</li><li>Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggered+gene+expression+in+fed-vesicle+microreactors+with+a+multifunctional+membrane.">Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51 (13), 3114-3118 (2012).</li><li>Hardy, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-reproducing+catalyst+drives+repeated+phospholipid+synthesis+and+membrane+growth.">Self-reproducing catalyst drives repeated phospholipid synthesis and membrane growth.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8187-8192 (2015).</li><li>Scott, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Free+Phospholipid+Biosynthesis+by+Gene-Encoded+Enzymes+Reconstituted+in+Liposomes.">Cell-Free Phospholipid Biosynthesis by Gene-Encoded Enzymes Reconstituted in Liposomes.</a> PLoS ONE. 11 (10), e0163058 (2016).</li><li>Deamer, D. W., Barchfeld, G. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+analysis+of+an+elastin-like+polypeptide+(ELP)+in+a+cell-free+protein+synthesis+system.">Expression analysis of an elastin-like polypeptide (ELP) in a cell-free protein synthesis system.</a> Enzyme and Microbial Technology. 46 (2), 87-91 (2010).</li><li>Martino, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Expression,+Aggregation,+and+Triggered+Release+from+Polymersomes+as+Artificial+Cell-like+Structures.">Protein Expression, Aggregation, and Triggered Release from Polymersomes as Artificial Cell-like Structures.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51 (26), 6416-6420 (2012).</li><li>Vogele, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+synthetic+cells+using+peptide-based+reaction+compartments.">Towards synthetic cells using peptide-based reaction compartments.</a> Nature Communications. 9 (1), 3862 (2018).</li><li>Huber, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+amphiphilic+proteins+as+building+blocks+for+the+intracellular+formation+of+organelle-like+compartments.">Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments.</a> Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2014).</li><li>McPherson, D. T., Xu, J., Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Product+purification+by+reversible+phase+transition+following+Escherichia+coli+expression+of+genes+encoding+up+to+251+repeats+of+the+elastomeric+pentapeptide+GVGVP.">Product purification by reversible phase transition following Escherichia coli expression of genes encoding up to 251 repeats of the elastomeric pentapeptide GVGVP.</a> Protein Expression and Purification. 7 (1), 51-57 (1996).</li><li>Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+chemistry+of+biological+free+energy+transduction+as+demonstrated+by+elastic+protein-based+polymers.">Physical chemistry of biological free energy transduction as demonstrated by elastic protein-based polymers.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 101 (51), 11007-11028 (1997).</li><li>Urry, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin:+a+representative+ideal+protein+elastomer.">Elastin: a representative ideal protein elastomer.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 357 (1418), 169-184 (2002).</li><li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+recombinant+proteins+by+fusion+with+thermally-responsive+polypeptides.">Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides.</a> Nature Biotechnology. 17 (11), 1112-1115 (1999).</li><li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+synthesis+of+protein-based+polymers+with+precisely+specified+molecular+weight+and+sequence+by+recursive+directional+ligation:+examples+from+the+elastin-like+polypeptide+system.">Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system.</a> Biomacromolecules. 3 (2), 357-367 (2002).</li><li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology.">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).</li><li>Caschera, F., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+2.3+mg/ml+of+protein+with+an+all+Escherichia+coli+cell-free+transcription-translation+system.">Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system.</a> Biochimie. 99, 162-168 (2014).</li><li>Schwarz-Schilling, M., Aufinger, L., M&#252;ckl, A., Simmel, F. 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R., Landfester, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+and+polymersomes:+a+comparative+review+towards+cell+mimicking.">Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking.</a> Chemical Society Reviews. 47 (23), 8572-8610 (2018).</li><li>Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Broccoli Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broccoli:+Rapid+Selection+of+an+RNA+Mimic+of+Green+Fluorescent+Protein+by+Fluorescence-Based+Selection+and+Directed+Evolution.">Broccoli: Rapid Selection of an RNA Mimic of Green Fluorescent Protein by Fluorescence-Based Selection and Directed Evolution.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).</li><li>Zhang, S., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purifying+Plasmid+DNA+from+Bacterial+Colonies+Using+the+Qiagen+Miniprep+Kit.">Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), 247 (2007).</li><li>Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+light+scattering:+a+practical+guide+and+applications+in+biomedical+sciences.">Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences.</a> Biophysical Reviews. 8 (4), 409-427 (2016).</li></ol>

La reidratazione delle pellicole è una procedura comune per la creazione di piccole vesciche unilamellar. La principale fonte di guasto è la gestione errata dei materiali utilizzati nella procedura.

Inizialmente, gli ELP sono prodotti dalle cellule E. coli. La resa dopo la purificazione dell'ELP può variare in modo significativo a seconda di quanto attentamente il protocollo viene condotto durante i suoi passi cruc...

La creazione di sistemi cellulari viventi sintetici è di solito avvicinata da due direzioni diverse. Nel metodo top-down, il genoma di un batterio è ridotto ai suoi componenti essenziali, portando in ultima analisi ad una cellula minima. Nell'approccio bottom-up, le cellule artificiali sono assemblate de novo da componenti molecolari o sottosistemi cellulari, che devono essere integrati funzionalmente in un sistema coerente simile a una cellula.
Nell'approccio de novo, la compartimentazione dei componenti biochimici necessari è solitamente ottenuta utilizzando membrane a base di fosfolipidi o acidi grassi1,2,3,4. Questo perché le membrane cellulari "moderne" sono costituite principalmente da fosfolipidi, mentre gli acidi grassi sono considerati candidati plausibili di recinti di membrana prebiotica5,6. Per la formazione di nuove membrane o per facilitare la crescita della membrana, gli elementi costitutivi anfilici devono essere forniti dall'esterno7 o idealmente attraverso la produzione all'interno di un vano membranoutilizzando utilizzando i corrispondenti processi anabolizzanti4 ,8.
Mentre la sintesi dei lipidi è un processo metabolico relativamente complesso, i peptidi possono essere prodotti abbastanza facilmente utilizzando reazioni di espressione genica prive di cellule9,10. Quindi, le membrane peptidiche formate da peptidi anfifile rappresentano un'interessante alternativa alle membrane lipidiche come recinti per imitazioni cellulari artificiali che sono in grado di crescere11.
I copolimeri anfifici simili all'elastina (ELP) sono una classe attraente di peptidi, che può fungere da elemento costitutivo per tali membrane12. Il motivo di base della sequenza di amminoacidi di ELPs è (GaGVP)n, dove "a" può essere qualsiasi aminoacido ad eccezione della prolina e "n" è il numero di ripetizioni motif13,14,15,16,17 . ELP sono stati creati con un blocco idrofobico contenente principalmente fenilalanina per un e un blocco idrofilo composto principalmente da acido glutammico11. A seconda dei parametri di una e soluzione, come la concentrazione di pH e sale, gli ELP presentano una cosiddetta transizione di temperatura inversa alla temperatura Tt, dove i peptidi subiscono una transizione di fase completamente reversibile da un idrofilo all'idrofobico stato. La sintesi dei peptidi può essere facilmente implementata all'interno di vesciche utilizzando l'estratto di cellule batteriche "TX-TL"11,18,19,20,21, che fornisce tutti i componenti necessari per le reazioni di trascrizione e traduzione accoppiate.
Il sistema TX-TL è stato incapsulato insieme, con il modello di DNA che codifica gli ELP nelle vescicoli ELP utilizzando la reidratazione-reidratazione dalle perline di vetro come supporto solido. La formazione di vescicle avviene attraverso la reidratazione dei peptidi secchi dalla superficie del tallone11. Possono essere utilizzati altri metodi22 per la formazione di vescicoli, che potenzialmente mostrano una minore polidispersione e dimensioni vesciche più grandi (ad esempio, elettro-formazione, trasferimento di fase di emulsione o metodi basati sulla microfluidica). Per testare la fattibilità del metodo di incapsulamento, la trascrizione dell'aptamer fluorogenico dBroccoli23 può essere utilizzata in alternativa11, che è meno complessa dell'espressione genica con il sistema TX-TL.
A causa dell'espressione dei mattoni della membrana in vesiculo e la loro successiva incorporazione nella membrana, le vesciche iniziano a crescere11. L'incorporazione di membrane degli ELP può essere dimostrata attraverso un saggio FRET. A tal fine, gli ELP utilizzati per la formazione della popolazione vescicana iniziale sono coniugati con coloranti fluorescenti in parti uguali che costizzano una coppia FRET. Dopo l'espressione di ELP non etichettati in vesiculo e la loro incorporazione nella membrana, gli ELP etichettati nella membrana vengono diluiti e di conseguenza il segnale FRET diminuiscedi 11. Come metodo versatile e comune per la coniugazione, viene utilizzato la cicloaddition azide-alkyne catalizzata in rame. Con l'uso di un legamento stabilizzante come tris(benzyltriazolylmethyl)-ammine, la reazione può essere effettuata in una soluzione acquosa a un pH fisiologico senza l'idrolisi dei reanti11, che è appropriato per le reazioni di coniugazione peptidi.
Il seguente protocollo presenta una descrizione dettagliata della preparazione per i peptidosos a base di ELP. Viene descritta l'espressione dei peptidi e della formazione di velecle utilizzando il metodo delle perline di vetro. Inoltre, viene descritto come implementare la trascrizione dell'aptamer fluorogenico dBroccoli e la reazione trascrizione-traduzione per l'espressione proteica all'interno delle vesciche ELP. Infine, è fornita una procedura per la coniugazione di ELP con fluorofori, che può essere utilizzato per dimostrare la crescita vescicale attraverso un analisi FRET11.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2xYT</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>3012-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-PGA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5PRIME Phase Lock GelTM tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>733-2478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alkine-conjugated Cy3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>777331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alkine-conjugated Cy5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>777358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benzamidin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CN38.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 Rosetta 2 E. coli strain</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>71402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford BSA Protein Assay Kit</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>500-0201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carbenicillin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6344.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloramphenicol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3886.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4432.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>USB</td>
			<td>14121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P024.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DFHBI</td>
			<td>Lucerna Technologies</td>
			<td>410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A994.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9065.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads, acid-washed</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>USB</td>
			<td>16800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (&#946;-isopropyl thiogalactoside )</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P017.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X968.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>82.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>KK36.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg-glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Bio-Spin Chromatography Columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>732-6204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N6522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-azide linker (y-azidobutyric acid oxysuccinimide ester)</td>
			<td>Baseclick</td>
			<td>BCL-033-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-8000</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>263.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH stripes</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>549.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6367.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate-buffered saline</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76180-684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphoric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W290017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethyleneimine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>408727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAPol reaction buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor murine</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0314S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap Wipes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rNTP</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0466S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roti-Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol</td>
			<td>Carlroth</td>
			<td>A156.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTS Amino Acid Sampler</td>
			<td>5 Prime</td>
			<td>2401530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit)</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>66382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9265.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium hydroxide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8655.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile-filtered (0.22 &#181;m filter)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>XH76.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0251S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBTA (tris(benzyltriazolylmethyl)amine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>678937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP (tris(2-carboxyethyl)-phosphine hydrochloride)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>BP1521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA (from E. coli)</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>MRE600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>USB</td>
			<td>23160</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vesiculo synthesis of peptide membrane precursors for autonomous vesicle growth

La compartimentazione delle reazioni biochimiche è un aspetto centrale delle cellule sintetiche. A questo scopo, i compartimenti di reazione basati su peptidi servono come alternativa attraente ai liposomi o alle vesciche a base di acidi grassi. Esternamente o all'interno delle vesciche, i peptidi possono essere facilmente espressi e semplificare la sintesi dei precursori della membrana. Fornito qui è un protocollo per la creazione di vesciche con diametri di 200 nm sulla base dei polipeptidi elastina-come anfilici (ELP) utilizzando la disidratazione-reidratazione da perline di vetro. Sono inoltre presentati protocolli per l'espressione e la purificazione batterica degli ELP attraverso il ciclo della temperatura inversa, nonché la loro funzionalizzazione covalente con coloranti fluorescenti. Inoltre, questo rapporto descrive un protocollo per consentire la trascrizione dell'RNA aptamer dBroccoli all'interno delle vescicle ELP come esempio meno complesso per una reazione biochimica. Infine, viene fornito un protocollo, che consente in vesiculo espressione delle proteine fluorescenti e del peptide della membrana, mentre la sintesi di quest'ultimo si traduce nella crescita vescicale.

Produzione di vescicle La figura 1 mostra immagini di microscopia elettronica a trasmissione (TEM) di vesciche preparate con diverse soluzioni di gonfiore e il metodo delle perline di vetro (vedi anche Vogele et al.11). Per il campione nella figura 1A,solo PBS è stato utilizzato come soluzione di gonfiore per dimostrare la formazione di vesciche e per determinarne le dimensioni. Quando TX-TL è stato utilizzato come s...

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In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursori per la crescita autonoma della vescicola

Qui sono presentati protocolli per la creazione di piccole vescibole unilamellar a base di peptidi in grado di crescere. Per facilitare la produzione vesiculo del peptide della membrana, queste vesciche sono dotate di un sistema di traduzione della trascrizione e del plasmide di codifica dei peptidi.

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an ...

Nel nostro protocollo, usiamo la reidratazione della pellicola da piccole perline di vetro per formare compartimenti di reazione fatti di peptidi. Negli esperimenti, beneficiamo della semplicità e della robustezza del protocollo. Il principale vantaggio di questa tecnica è la capacità di incorporare anche campioni sensibili, come l'estratto di cellule grezze usato.Il contatto con solventi organici influenzerà significativamente il campione. Per iniziare questa procedura, utilizzare un concentratore a vuoto centrifugo per concentrare la soluzione ELP a 1,1 millimolare. Mescolare 200 microlitri di questa soluzione concentrata con 1.250 microlitri di una miscela cloroformio e metanolo due a uno.Vortice la soluzione per mescolare accuratamente. Quindi, aggiungere 1,5 grammi di perline di vetro sferiche a un pallone inferiore rotondo da dieci millilitri. Aggiungere la soluzione di metanolo ELP e cloroformio al pallone inferiore rotondo e agitare delicatamente per mescolare.Collegare il pallone a un evaporatore rotante. Regolare la velocità a 150 giri/min e regolare la pressione a 20.000 pascal per circa quattro minuti, fino a quando il liquido non viene evaporato a temperatura ambiente. È importante fare attenzione quando si utilizza l'evaporatore rotante a causa di un possibile ritardo dell'ebollizione.Successivamente, avvolgere liberamente il foglio di alluminio intorno all'apertura del pallone inferiore rotondo per evitare la perdita di perline di vetro e posizionare il pallone in un essiccatore per almeno un'ora, per garantire che il cloroformio e il metanolo rimanenti vengano evaporati. Per un singolo esperimento, mescolare 100 milligrammi delle perline di vetro coperte di peptide con 60 microlitri di una soluzione di gonfiore. Incubare questo campione a 25 gradi Celsius per cinque minuti.Utilizzare una centrifuga da tavolo per centrifugare rapidamente i campioni e sedimentare le perline di vetro. Quindi utilizzare una pipetta per raccogliere il supernatante, che contiene le vescicole. In primo luogo, mescolare 100 microlitri del DNA plasmide predepurato con 100 microlitri di Roti-Fenolo, cloroformio o alcol isoammil in un tubo di microfuga per consentire una migliore separazione di fase.Invertire delicatamente il tubo fino a sei volte e centrifugare a 16.000 volte g e temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi, aggiungere 200 microlitri di cloroformio alla fase superiore e invertire il tubo fino a sei volte. Centrifugare il campione a 16.000 volte g e la temperatura ambiente per cinque minuti.Successivamente, pipettare il supernatante in un tubo separato e aggiungere 10 microlitri di tre acetati di sodio molare per la precipitazione dell'etanolo. Aggiungere un millilitro di etanolo freddo a 80 gradi Celsius e conservare il campione a 80 gradi Celsius per un'ora. Quindi, centrifuga il campione a 16.000 volte g e quattro gradi Celsius per 15 minuti.Decantare il supernatante e aggiungere un millilitro di etanolo freddo al 70% a 20 gradi Celsius. Centrifuga a 16.000 volte g e quattro gradi Celsius per cinque minuti. Quindi, rimuovere il liquido pipettando, facendo attenzione a non disturbare il pellet di DNA.Conservare il campione a temperatura ambiente per circa 15 minuti per evaporare l'etanolo rimanente. Successivamente, aggiungere acqua ultra pura al campione per regolare la concentrazione del campione a circa 300 nanomolari, che viene misurata per assorbimento a 260 nanometri. Per preparare la reazione trascritto-traslazione, seguire l'estrazione di cellule grezze preparate e il tampone di reazione sul ghiaccio.Per una miscela di reazione di 60 microlitri, aggiungere il DNA plasmatico a 37,5 microlitri del tampone di reazione, aggiungere 28,7 microlitri di estratto di cellule grezze e riempire con acqua ultra pura ad un volume finale di 58,8 microlitri. Poco prima dell'inizio della reazione, aggiungere 1,2 microlitri della soluzione di polimerasi T7RNA e pipettare su e giù per mescolare. Incubare il campione e una soluzione di gonfiore a 29 gradi Celsius per tutta la durata dell'esperimento, che in genere è da quattro a otto ore.Le immagini della microscopia elettronica a trasmissione delle vescicole mostrano che varie soluzioni di gonfiore, come TX/TL o anche solo PBS possono essere utilizzate per formare vescicole. Per entrambe le soluzioni, la determinazione delle dimensioni è un passo avanti. La diffusione dinamica della luce mostra che le vescicole preparate senza il metodo delle perline di vetro si traducono in un diametro di 134 nanometri, con una polidispersità del 25%Quando si utilizzano perline di vetro, il diametro si traduce in 168 nanometri, con una polidispersità del 21%L'intensità di fluorescenza di due proteine fluorescenti, che si esprimono all'interno delle vescicole ELP, viene quindi misurata utilizzando un lettore di piastre di fluorescenza.È importante notare che dopo la formazione di vescicole, il contenuto delle vescicole e la soluzione esterna sono gli stessi, quindi l'antibiotico Kanamicina viene aggiunto alla soluzione esterna per sopprimere l'espressione proteica. Come controllo, la kanamicina viene anche aggiunta alla soluzione di gonfiore, nel qual caso l'espressione proteica all'interno del vescicola viene soppressa. Ciò indica che la kanamicina non si diffonde attraverso la membrana e sopprime costantemente l'espressione interna, tutto il tempo.Il saggio FRET viene quindi eseguito per dimostrare l'incorporazione ELP nella membrana. All'espressione degli ETP di membrana, peptidi aggiuntivi incorporano nella membrana, il che aumenta la distanza media tra le coppie FRET e che si traduce in un aumento del segnale del donatore. La tecnica presentata può essere utilizzata per produrre semplici contenitori di reazione o per creare cellule artificiali con membrane a base peptidica.Il contenuto all'interno può essere scelto in base alle esigenze. Usando queste vescicole peptidiche, ora possiamo guardare avanti a reazioni di sintesi più complesse al loro interno.

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