Name: in vesiculo synthesis of peptide membrane precursors for autonomous vesicle growth
Uploaded: 2019-06-28T14:10:00
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DFG TRR 235(生命の出現、プロジェクトP15)、欧州研究評議会(交付契約第694410 AEDNA)、およびTUM国際科学技術研究科(プロジェクトNo.9.05)を通じた財政支援に感謝します。.私たちは、サンプルの準備で彼女の助けをE.ファルゲンハウアーに感謝します。我々は、TX-TLシステムと有用な議論に対する彼らの助けに対して、A.デュビンとM.シュワルツ・シリングに感謝します。我々は、有益な議論のためにN.B.オランダに感謝します。

1. エラスチン様ポリペプチドの発現
<ol><li>1日目:ペプチド発現のためのスターター培養と供給の準備
	<ol>
<li>LB培地のフラスコ(4 x 2.5L)及び3LのLB培養フラスコを調修及びオートクレーブ。LB培地の1Lの場合は、1Lの超純水に25gのLB粉末を加えます。</li>
		<li>LB培地の100 mL、無菌濾過(0.22μmフィルター)クロラムフェニコール溶液(EtOHでは25mg/mL)、50μLの滅菌フィルター(0.22μmフィルター)カ...

<ol>
	<li>Chen, I. A., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+kinetic+study+of+the+growth+of+fatty+acid+vesicles.">A kinetic study of the growth of fatty acid vesicles.</a> Biophysical Journal. 87 (2), 988-998 (2004).</li><li>Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggered+gene+expression+in+fed-vesicle+microreactors+with+a+multifunctional+membrane.">Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51 (13), 3114-3118 (2012).</li><li>Hardy, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-reproducing+catalyst+drives+repeated+phospholipid+synthesis+and+membrane+growth.">Self-reproducing catalyst drives repeated phospholipid synthesis and membrane growth.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8187-8192 (2015).</li><li>Scott, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Free+Phospholipid+Biosynthesis+by+Gene-Encoded+Enzymes+Reconstituted+in+Liposomes.">Cell-Free Phospholipid Biosynthesis by Gene-Encoded Enzymes Reconstituted in Liposomes.</a> PLoS ONE. 11 (10), e0163058 (2016).</li><li>Deamer, D. W., Barchfeld, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+of+macromolecules+by+lipid+vesicles+under+simulated+prebiotic+conditions.">Encapsulation of macromolecules by lipid vesicles under simulated prebiotic conditions.</a> Journal of Molecular Evolution. 18 (3), 203-206 (1982).</li><li>Adamala, K., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonenzymatic+Template-Directed+RNA+Synthesis+Inside+Model+Protocells.">Nonenzymatic Template-Directed RNA Synthesis Inside Model Protocells.</a> Science. 342 (6162), 1098-1100 (2013).</li><li>Zhu, T. F., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupled+growth+and+division+of+model+protocell+membranes.">Coupled growth and division of model protocell membranes.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (15), 5705-5713 (2009).</li><li>Kurihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-reproduction+of+supramolecular+giant+vesicles+combined+with+the+amplification+of+encapsulated+DNA.">Self-reproduction of supramolecular giant vesicles combined with the amplification of encapsulated DNA.</a> Nature Chemistry. 3 (10), 775-781 (2011).</li><li>Chu, H. -. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+analysis+of+an+elastin-like+polypeptide+(ELP)+in+a+cell-free+protein+synthesis+system.">Expression analysis of an elastin-like polypeptide (ELP) in a cell-free protein synthesis system.</a> Enzyme and Microbial Technology. 46 (2), 87-91 (2010).</li><li>Martino, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Expression,+Aggregation,+and+Triggered+Release+from+Polymersomes+as+Artificial+Cell-like+Structures.">Protein Expression, Aggregation, and Triggered Release from Polymersomes as Artificial Cell-like Structures.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51 (26), 6416-6420 (2012).</li><li>Vogele, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+synthetic+cells+using+peptide-based+reaction+compartments.">Towards synthetic cells using peptide-based reaction compartments.</a> Nature Communications. 9 (1), 3862 (2018).</li><li>Huber, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+amphiphilic+proteins+as+building+blocks+for+the+intracellular+formation+of+organelle-like+compartments.">Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments.</a> Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2014).</li><li>McPherson, D. T., Xu, J., Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Product+purification+by+reversible+phase+transition+following+Escherichia+coli+expression+of+genes+encoding+up+to+251+repeats+of+the+elastomeric+pentapeptide+GVGVP.">Product purification by reversible phase transition following Escherichia coli expression of genes encoding up to 251 repeats of the elastomeric pentapeptide GVGVP.</a> Protein Expression and Purification. 7 (1), 51-57 (1996).</li><li>Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+chemistry+of+biological+free+energy+transduction+as+demonstrated+by+elastic+protein-based+polymers.">Physical chemistry of biological free energy transduction as demonstrated by elastic protein-based polymers.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 101 (51), 11007-11028 (1997).</li><li>Urry, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin:+a+representative+ideal+protein+elastomer.">Elastin: a representative ideal protein elastomer.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 357 (1418), 169-184 (2002).</li><li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+recombinant+proteins+by+fusion+with+thermally-responsive+polypeptides.">Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides.</a> Nature Biotechnology. 17 (11), 1112-1115 (1999).</li><li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+synthesis+of+protein-based+polymers+with+precisely+specified+molecular+weight+and+sequence+by+recursive+directional+ligation:+examples+from+the+elastin-like+polypeptide+system.">Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system.</a> Biomacromolecules. 3 (2), 357-367 (2002).</li><li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology.">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).</li><li>Caschera, F., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+2.3+mg/ml+of+protein+with+an+all+Escherichia+coli+cell-free+transcription-translation+system.">Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system.</a> Biochimie. 99, 162-168 (2014).</li><li>Schwarz-Schilling, M., Aufinger, L., M&#252;ckl, A., Simmel, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+communication+between+bacteria+and+cell-free+gene+expression+systems+within+linear+chains+of+emulsion+droplets.">Chemical communication between bacteria and cell-free gene expression systems within linear chains of emulsion droplets.</a> Integrative Biology. 8 (4), 564-570 (2016).</li><li>Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+All+E.+coli+TX-TL+Toolbox+2.0:+A+Platform+for+Cell-Free+Synthetic+Biology.">The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology.</a> ACS Synthetic Biology. 5 (4), 344-355 (2016).</li><li>Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+and+polymersomes:+a+comparative+review+towards+cell+mimicking.">Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking.</a> Chemical Society Reviews. 47 (23), 8572-8610 (2018).</li><li>Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Broccoli Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broccoli:+Rapid+Selection+of+an+RNA+Mimic+of+Green+Fluorescent+Protein+by+Fluorescence-Based+Selection+and+Directed+Evolution.">Broccoli: Rapid Selection of an RNA Mimic of Green Fluorescent Protein by Fluorescence-Based Selection and Directed Evolution.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).</li><li>Zhang, S., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purifying+Plasmid+DNA+from+Bacterial+Colonies+Using+the+Qiagen+Miniprep+Kit.">Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), 247 (2007).</li><li>Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+light+scattering:+a+practical+guide+and+applications+in+biomedical+sciences.">Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences.</a> Biophysical Reviews. 8 (4), 409-427 (2016).</li></ol>

フィルムの水分補給は、小さなユニラメラ小胞の作成のための一般的な手順です。故障の主な原因は、手順で使用される材料の誤った取り扱いです。

当初、ELPは大腸菌細胞によって産生される。ELP精製後の収率は、重要なステップの間にプロトコルがどの程度慎重に行われるかに応じて大きく異なる場合がありま...

合成生細胞系の作成は、通常、2つの異なる方向からアプローチされます。トップダウン法では、細菌のゲノムは必須成分に還元され、最終的には最小限の細胞につながります。ボトムアップアプローチでは、人工細胞は分子成分または細胞サブシステムからde novoを組み立てられ、一貫した細胞様システムに機能的に統合される必要があります。
de novoアプローチでは、必要な生化学成分の区分化は、通常、リン脂質または脂肪酸1、2、3、4から作られた膜を使用して達成される。これは、「現代」細胞膜は主にリン脂質から成り、脂肪酸はプレバイオティクス膜エンクロージャ5、6のもっともらしい候補と考えられているからである。新しい膜の形成、または膜の成長を促進するために、両友病のビルディングブロックは、対応する同化プロセス4を使用して膜区画内の生産を通じて、外側7から、または理想的には提供されなければならない。 、8.
脂質合成は比較的複雑な代謝過程であるが、ペプチドは無細胞遺伝子発現反応9、10を用いて非常に容易に産生することができる。したがって、親質ペプチドによって形成されたペプチド膜は、11を成長させることができる人工細胞模倣のためのエンクロージャとして脂質膜に対する興味深い代替手段を表す。
親水性エラスチン様二重合体(ELP)は、このような膜12のビルディングブロックとして機能することができるペプチドの魅力的なクラスである。ELPの基本アミノ酸配列モチーフは(GaGVP)nであり、「a」はプロリンを除く任意のアミノ酸であり、「n」は繰り返されるモチーフの数13、14、15、16、17である。.ELPは、主にフェニルアラニンを含む疎水性ブロックと、グルタミン酸11からなる親水性ブロックを用いて作成されている。pHおよび塩濃度などの溶液パラメータに応じて、ELPは温度Ttでいわゆる逆温度遷移を示し、ペプチドは親水性から疎水性への完全に可逆的な相転移を受ける状態。ペプチドの合成は、細菌細胞抽出物「TX-TL」を用いて小胞内で容易に実施することができる。結合転写および翻訳反応に必要なすべてのコンポーネント。
TX-TLシステムは、ガラスビーズからの脱水水分補給を固体サポートとして利用してELP小胞にELPをコードするDNAテンプレートを併用して一緒にカプセル化しました。小胞の形成は、ビーズ表面11からの乾燥ペプチドの水分補給を通じて起こる。小胞形成のための他の方法22は、潜在的に低い多分散性およびより大きな小胞サイズ(例えば、電気形成、エマルジョン相移動、またはマイクロ流体ベースの方法)を示す。封入法の生存率を試験するために、フッ素性アプタマーdBroccoli23の転写を代わりに11を用いることができ、これはTX-TL系を用いた遺伝子発現よりも複雑ではない。
ベシキュロにおける膜ビルディングブロックの発現とその後の膜への組み込みにより、小胞は11に成長し始める。ELPの膜組み込みは、FRETアッセイを介して実証することができる。この目的のために、初期小胞集団の形成に使用されるELPは、FRET対を構成する等しい分株で蛍光色素と結合される。ベシキュロにおける非標識ELPの発現および膜への組み込み時に、膜内の標識されたELPが希釈され、その結果、FRET信号は11減少する。共役のための汎用性と一般的な方法として、銅触媒アジドアルキネシクロ添加が使用される。トリス(ベンジルトリアゾリルメチル)-アミンなどの安定化リガンドを使用すると、反応は、共振反応に適した反応剤11の加水分解なしで生理学的pHで水溶液中で行うことができる。ペプチドを含む。
以下のプロトコルは、ELPベースのペプチドソームを成長するための製剤の詳細な説明を提示する。ガラスビーズ法を用いたペプチドおよび小胞形成の発現について説明する。さらに、ELP小胞内のタンパク質発現に対するフッ素性dBroccoliアプタマーおよび転写転写転写反応の転写を実施する方法について説明する。最後に、提供されるのは、蛍風素を有するELPの結合のための手順であり、これはFRETアッセイ11を介して小胞の成長を証明するために使用することができる。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2xYT</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>3012-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-PGA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5PRIME Phase Lock GelTM tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>733-2478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alkine-conjugated Cy3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>777331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alkine-conjugated Cy5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>777358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benzamidin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CN38.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 Rosetta 2 E. coli strain</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>71402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford BSA Protein Assay Kit</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>500-0201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carbenicillin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6344.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloramphenicol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3886.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4432.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>USB</td>
			<td>14121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P024.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DFHBI</td>
			<td>Lucerna Technologies</td>
			<td>410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A994.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9065.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads, acid-washed</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>USB</td>
			<td>16800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (&#946;-isopropyl thiogalactoside )</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P017.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X968.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>82.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>KK36.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg-glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Bio-Spin Chromatography Columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>732-6204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N6522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-azide linker (y-azidobutyric acid oxysuccinimide ester)</td>
			<td>Baseclick</td>
			<td>BCL-033-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-8000</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>263.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH stripes</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>549.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6367.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate-buffered saline</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76180-684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphoric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W290017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethyleneimine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>408727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAPol reaction buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor murine</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0314S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap Wipes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rNTP</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0466S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roti-Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol</td>
			<td>Carlroth</td>
			<td>A156.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTS Amino Acid Sampler</td>
			<td>5 Prime</td>
			<td>2401530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit)</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>66382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9265.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium hydroxide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8655.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile-filtered (0.22 &#181;m filter)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>XH76.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0251S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBTA (tris(benzyltriazolylmethyl)amine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>678937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP (tris(2-carboxyethyl)-phosphine hydrochloride)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>BP1521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA (from E. coli)</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>MRE600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>USB</td>
			<td>23160</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vesiculo synthesis of peptide membrane precursors for autonomous vesicle growth

生化学反応の区分化は、合成細胞の中心的な側面である。この目的のために、ペプチドベースの反応コンパートメントは、リポソームまたは脂肪酸ベースの小胞に対する魅力的な代替手段として機能する。外部または小胞内では、ペプチドを容易に発現し、膜前駆体の合成を簡素化することができる。ここで提供されるのは、ガラスビーズからの脱水水分補給を利用した両生血球エラスチン様ポリペプチド(ELP)に基づいて、直径約200nmの小胞を作成するためのプロトコルである。また、逆温度サイクリングによる細菌ELP発現および精製のためのプロトコル、ならびに蛍光色素によるその共生機能化についても提示する。さらに、本報告では、生化学反応の非複雑な例として、ELP小胞内のRNAアプタマーdBroccoliの転写を可能にするプロトコルについて説明する。最後に、蛍光タンパク質および膜ペプチドのベシキュロ発現を可能にするプロトコルが提供され、後者の合成は小胞の増殖をもたらす。

ベシクル生産 図1は、異なる膨潤溶液およびガラスビーズ法で調製された小胞の透過電子顕微鏡(TEM)画像を示す(Vogele etal.11も参照)。図1Aの試料については、小胞の形成を証明し、その大きさを決定するために、腫脹溶液としてPBSのみを使用した。TX-TLを膨潤液(図1B)として用いた場合、小胞も形?...

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In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

自律性小胞成長のためのペプチド膜前駆体のベシキュロ合成

ここに提示されるペプチドベースの小さなユニラメラ小胞の作成のためのプロトコルは、成長することができる。膜ペプチドのベシキュロ産生を容易にするために、これらの小胞は転写翻訳システムおよびペプチドコードプラスミドが装備されている。

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an ...

私たちのプロトコルでは、小さなガラスビーズからのフィルム再水和を使用して、ペプチドで作られた反応コンパートメントを形成します。実験では、プロトコルのシンプルさと堅牢性の恩恵を受けます。この技術の主な利点は、使用された粗細胞抽出物のような敏感なサンプルを組み込む能力である。有機溶媒との接触は、サンプルに大きな影響を与えます。この手順を開始するには、遠心真空濃縮器を使用してELP溶液を1.1ミリモルに濃縮します。この濃縮液の200マイクロリットルを2~1クロロホルムとメタノール混合物の1,250マイクロリットルと混合します。溶液を完全に混合するボルテックス。次に、10ミリリットルの丸い底フラスコに球状ガラスビーズ1.5グラムを加えます。丸底フラスコにELPとクロロホルムメタノール溶液を加え、軽く振って混ぜます。フラスコをロータリーエバポレーターに接続します。速度を150 RPMに調整し、液体が室温で蒸発するまで約4分間、圧力を20,000パスカルに調整します。沸騰遅滞の可能性があるため、ロータリーエバポレーターを使用する際には注意が必要です。この後、丸底フラスコの開口部を中心にアルミ箔を緩く包み、ガラスビーズの損失を防ぎ、フラスコを少なくとも1時間デシケータに入れ、残りのクロロホルムとメタノールが蒸発することを保証する。単一の実験の場合、100ミリグラムのペプチドをガラスビーズと60マイクロリットルの膨潤液と混合する。このサンプルを摂氏25度で5分間インキュベートします。テーブルトップ遠心分離機を使用してサンプルを素早く遠心分離し、ガラスビーズを堆積させます。その後、小胞を含む上清を収集するためにピペットを使用しています。まず、予精製プラスミドDNAの100マイクロリットルを、ロティフェノール、クロロホルム、またはイソアミルアルコールの100マイクロ遠心チューブに混合して、より良い相分離を可能にします。チューブを6回まで静かに反転させ、遠心分離機を16,000 gで5分間室温にします。その後、上相に200マイクロリットルのクロロホルムを加え、チューブを6回まで反転させます。試料を16,000倍gで遠心分離し、室温を5分間処理する。この後、上清を別のチューブにピペットし、エタノール沈殿のために3モル酢酸ナトリウムの10マイクロリットルを加える。冷たいエタノールを摂氏80度で1ミリリットル加え、サンプルを摂氏80度で1時間保存します。次に、サンプルを16,000回gで遠心し、摂氏4度で15分間遠心します。上清をデカントし、摂氏20度で冷たい70%エタノールの1ミリリットルを追加します。16,000倍gで遠心分離機、摂氏4度で5分間。その後、ピペット処理により液体を除去し、DNAペレットを乱さないよう注意する。残りのエタノールを蒸発させるために、サンプルを室温で約15分間保存します。この後、サンプルに超純水を加えて、サンプル濃度を約300ナノモルに調整し、260ナノメートルで吸収して測定します。転写翻訳反応を調製するために、調製した粗細胞抽出および反応バッファーを氷上に従ってください。60マイクロリットルの反応ミックスの場合、反応バッファーの37.5マイクロリットルにプラズマDNAを追加し、粗細胞抽出物の28.7マイクロリットルを追加し、58.8マイクロリットルの最終体積に超純水で満たします。反応が始まる直前に、T7RNAポリメラーゼ溶液を1.2マイクロリットル加え、ピペットを上下に加え、混合します。実験期間中、サンプルと腫脹溶液を摂氏29度(通常は4~8時間)でインキュベートします。小胞の透過電子顕微鏡画像は、TX/TLやPBSなどの様々な膨潤液を使用して小胞を形成できることを示しています。どちらのソリューションでも、サイズ決定は簡単なステップです。動的光散乱は、ガラスビーズ法なしで調製された小胞が直径134ナノメートルをもたらし、ガラスビーズを使用すると25%の多分散性を有し、直径は168ナノメートルをもたらし、多分散性を有する21%の蛍光強度を有し、ELP小胞の内部で発現される2つの蛍光タンパク質の蛍光強度を測定し、その後、フルエンスプレートを使用して測定される。小胞形成後、小胞と外液の内容物は同じであり、したがって、抗生物質カナマイシンが外液に添加され、タンパク質発現を抑制することに注意することが重要である。コントロールとして、カナマイシンも膨潤液に添加され、その場合には小胞内部のタンパク質発現が抑制される。これは、カナマイシンが膜を通して拡散せず、常に内部発現を常に抑制することを示している。FRETアッセイは、膜へのELPの組み込みを実証するために行われます。膜Elpsの発現時に、膜内に追加のペプチドが組み込まれ、FRETペア間の平均距離が増加し、ドナーシグナルの増加をもたらす。提示された技術は、単純な反応容器を生成したり、ペプチドベースの膜を有する人工細胞を作成するために使用することができる。必要に応じて、内部のコンテンツを選択できます。これらのペプチド小胞を使用することで、我々は今、それらの中でより複雑な合成反応を楽しみにすることができます。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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