Name: in vesiculo synthesis of peptide membrane precursors for autonomous vesicle growth
Uploaded: 2019-06-28T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth at JoVE.com

우리는 DFG TRR 235 (생명의 출현, 프로젝트 P15), 유럽 연구 위원회 (보조금 협정 번호 694410 AEDNA), 그리고 TUM 국제 과학 공학 IGSSE 대학원 (프로젝트 번호 9.05)을 통해 재정적 지원을 감사하게 인정합니다. . 샘플 준비에 도움을 주신 E. 팔겐하우어에게 감사드립니다. 우리는 TX-TL 시스템과 유용한 토론에 대한 도움에 대한 A. 듀핀과 M. 슈바르츠 쉴링에게 감사드립니다. 우리는 유용한 토론에 대한 N. B. 네덜란드 감사합니다.

1. 엘라스틴과 같은 폴리펩티드의 발현
<ol><li>1일차: 펩타이드 발현을 위한 스타터 배양 및 소모품 준비
	<ol>
<li>LB 배지의 발현 배양 플라스크(4 x 2.5 L) 및 3L을 준비하고 오토클레이브 배양한다. LB 배지 1L의 경우, 25 g의 LB 파우더를 초순수 1L에 넣으세요.</li>
		<li>LB 배지 100 mL, 멸균 여과(0.22 μm 필터) 클로람페니콜 용액(EtOH의 25 mg/mL), 50 μL의 멸균 여과(0.22 μm 필터) 카베니실린 용액(50% Et...

<ol>
	<li>Chen, I. A., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+kinetic+study+of+the+growth+of+fatty+acid+vesicles.">A kinetic study of the growth of fatty acid vesicles.</a> Biophysical Journal. 87 (2), 988-998 (2004).</li><li>Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggered+gene+expression+in+fed-vesicle+microreactors+with+a+multifunctional+membrane.">Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51 (13), 3114-3118 (2012).</li><li>Hardy, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-reproducing+catalyst+drives+repeated+phospholipid+synthesis+and+membrane+growth.">Self-reproducing catalyst drives repeated phospholipid synthesis and membrane growth.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8187-8192 (2015).</li><li>Scott, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Free+Phospholipid+Biosynthesis+by+Gene-Encoded+Enzymes+Reconstituted+in+Liposomes.">Cell-Free Phospholipid Biosynthesis by Gene-Encoded Enzymes Reconstituted in Liposomes.</a> PLoS ONE. 11 (10), e0163058 (2016).</li><li>Deamer, D. W., Barchfeld, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+of+macromolecules+by+lipid+vesicles+under+simulated+prebiotic+conditions.">Encapsulation of macromolecules by lipid vesicles under simulated prebiotic conditions.</a> Journal of Molecular Evolution. 18 (3), 203-206 (1982).</li><li>Adamala, K., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonenzymatic+Template-Directed+RNA+Synthesis+Inside+Model+Protocells.">Nonenzymatic Template-Directed RNA Synthesis Inside Model Protocells.</a> Science. 342 (6162), 1098-1100 (2013).</li><li>Zhu, T. F., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupled+growth+and+division+of+model+protocell+membranes.">Coupled growth and division of model protocell membranes.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (15), 5705-5713 (2009).</li><li>Kurihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-reproduction+of+supramolecular+giant+vesicles+combined+with+the+amplification+of+encapsulated+DNA.">Self-reproduction of supramolecular giant vesicles combined with the amplification of encapsulated DNA.</a> Nature Chemistry. 3 (10), 775-781 (2011).</li><li>Chu, H. -. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+analysis+of+an+elastin-like+polypeptide+(ELP)+in+a+cell-free+protein+synthesis+system.">Expression analysis of an elastin-like polypeptide (ELP) in a cell-free protein synthesis system.</a> Enzyme and Microbial Technology. 46 (2), 87-91 (2010).</li><li>Martino, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Expression,+Aggregation,+and+Triggered+Release+from+Polymersomes+as+Artificial+Cell-like+Structures.">Protein Expression, Aggregation, and Triggered Release from Polymersomes as Artificial Cell-like Structures.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51 (26), 6416-6420 (2012).</li><li>Vogele, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+synthetic+cells+using+peptide-based+reaction+compartments.">Towards synthetic cells using peptide-based reaction compartments.</a> Nature Communications. 9 (1), 3862 (2018).</li><li>Huber, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+amphiphilic+proteins+as+building+blocks+for+the+intracellular+formation+of+organelle-like+compartments.">Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments.</a> Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2014).</li><li>McPherson, D. T., Xu, J., Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Product+purification+by+reversible+phase+transition+following+Escherichia+coli+expression+of+genes+encoding+up+to+251+repeats+of+the+elastomeric+pentapeptide+GVGVP.">Product purification by reversible phase transition following Escherichia coli expression of genes encoding up to 251 repeats of the elastomeric pentapeptide GVGVP.</a> Protein Expression and Purification. 7 (1), 51-57 (1996).</li><li>Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+chemistry+of+biological+free+energy+transduction+as+demonstrated+by+elastic+protein-based+polymers.">Physical chemistry of biological free energy transduction as demonstrated by elastic protein-based polymers.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 101 (51), 11007-11028 (1997).</li><li>Urry, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin:+a+representative+ideal+protein+elastomer.">Elastin: a representative ideal protein elastomer.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 357 (1418), 169-184 (2002).</li><li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+recombinant+proteins+by+fusion+with+thermally-responsive+polypeptides.">Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides.</a> Nature Biotechnology. 17 (11), 1112-1115 (1999).</li><li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+synthesis+of+protein-based+polymers+with+precisely+specified+molecular+weight+and+sequence+by+recursive+directional+ligation:+examples+from+the+elastin-like+polypeptide+system.">Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system.</a> Biomacromolecules. 3 (2), 357-367 (2002).</li><li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology.">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).</li><li>Caschera, F., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+2.3+mg/ml+of+protein+with+an+all+Escherichia+coli+cell-free+transcription-translation+system.">Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system.</a> Biochimie. 99, 162-168 (2014).</li><li>Schwarz-Schilling, M., Aufinger, L., M&#252;ckl, A., Simmel, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+communication+between+bacteria+and+cell-free+gene+expression+systems+within+linear+chains+of+emulsion+droplets.">Chemical communication between bacteria and cell-free gene expression systems within linear chains of emulsion droplets.</a> Integrative Biology. 8 (4), 564-570 (2016).</li><li>Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+All+E.+coli+TX-TL+Toolbox+2.0:+A+Platform+for+Cell-Free+Synthetic+Biology.">The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology.</a> ACS Synthetic Biology. 5 (4), 344-355 (2016).</li><li>Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+and+polymersomes:+a+comparative+review+towards+cell+mimicking.">Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking.</a> Chemical Society Reviews. 47 (23), 8572-8610 (2018).</li><li>Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Broccoli Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broccoli:+Rapid+Selection+of+an+RNA+Mimic+of+Green+Fluorescent+Protein+by+Fluorescence-Based+Selection+and+Directed+Evolution.">Broccoli: Rapid Selection of an RNA Mimic of Green Fluorescent Protein by Fluorescence-Based Selection and Directed Evolution.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).</li><li>Zhang, S., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purifying+Plasmid+DNA+from+Bacterial+Colonies+Using+the+Qiagen+Miniprep+Kit.">Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), 247 (2007).</li><li>Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+light+scattering:+a+practical+guide+and+applications+in+biomedical+sciences.">Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences.</a> Biophysical Reviews. 8 (4), 409-427 (2016).</li></ol>

필름 재수화는 작은 unilamellar 소포의 생성을위한 일반적인 절차입니다. 고장의 주요 원인은 절차에 사용되는 재료의 잘못된 취급입니다.

처음에, ELPs는 대장균 세포에 의해 생성됩니다. ELP 정제 후 의제는 중요한 단계에서 프로토콜이 얼마나 신중하게 수행되는지에 따라 크게 달라질 수 있습니다. 이들은 강수 후 반온?...

합성 생활 셀룰러 시스템의 창조는 일반적으로 두 개의 다른 방향에서 접근. 하향식 방법에서는, 박테리아의 게놈은 그것의 필수적인 분대로 감소되고, 궁극적으로 최소한의 세포로 이끌어 냅니다. 상향식 접근법에서 인공 세포는 일관된 세포와 같은 시스템으로 기능적으로 통합되어야 하는 분자 성분 또는 세포 하위 시스템에서 조립된 de novo입니다.
de novo 접근법에서, 필요한 생화학 적 성분의 구획화는 일반적으로 인지질 또는 지방산1,2,3,4로만든 멤브레인을 사용하여 달성된다. 이는 "현대적" 세포막이 주로 인지질로 구성되기 때문이며, 지방산은 프리바이오틱 멤브레인인클로저 5,6의그럴듯한 후보로 간주되기 때문이다. 새로운 멤브레인의 형성을 위해 또는 멤브레인 성장을 촉진하기 위해, 양과 성 빌딩 블록은 외부에서 제공되어야7 이상적으로 해당 근육 과정을 사용하여 membranous 구획 내에서 생산을 통해4 ,8.
지질 합성은 비교적 복잡한 대사 과정이지만, 펩타이드는 세포없는 유전자 발현 반응을이용하여 매우 쉽게 생성될 수 있다 9,10. 따라서, 양과성 펩티드에 의해 형성된 펩티드 막은11을성장시킬 수 있는 인공 세포 모방을 위한 인클로저로서 지질막에 대한 흥미로운 대안을 나타낸다.
양과성 엘라스틴 과 같은 디블록 공중합체(ELPs)는 펩티드의 매력적인 부류이며, 이는 이러한멤브레인(12)에 대한 빌딩 블록으로서 작용할 수 있다. ELPs의 기본 아미노산 서열 모티프는 (GaGVP) n이며, 여기서 "a"는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이 될 수 있고 "n"은 모티프 반복 횟수13,14,15,16,17입니다. . ELP는 주로 글루탐산(11)으로 구성된 친수성 블록에 대해 주로 페닐알라닌을 함유하는 소수성 블록으로 생성되었다. pH 및 염 농도와 같은 용액 파라미터 및 용액 파라미터에 따라,ELPs는 펩티드가 친수성에서 소수성으로 완전히 가역적 위상 전이를 겪는 온도 Tt에서 소위 역온도 전환을 나타낸다. 상태. 펩타이드의 합성은 "TX-TL" 세균 세포 추출물11,18,19,20,21을사용하여 소포 내부에서 쉽게 구현될 수 있다. 결합 된 전사 및 번역 반응에 필요한 모든 구성 요소.
TX-TL 시스템은 ELP를 ELP 소포로 인코딩하는 DNA 템플릿과 함께 캡슐화되었으며, 유리 구슬에서 탈수-재수화를 견고한 지지체로 활용합니다. 소포의 형성은 비드 표면(11)으로부터 건조된 펩티드의재수화를 통해 발생한다. 소포 형성을 위한 다른 방법(22)은 잠재적으로 더 낮은 다분산성 및 더 큰 소포 크기(예를 들어, 전기 형성, 에멀젼 상 전달, 또는 미세 유체학 기반 방법)를 나타내는 데 사용될 수 있다. 캡슐화 방법의 생존가능성을 시험하기 위해, 형광 압타머 dBroccoli23의 전사는 대안적으로 TX-TL 시스템으로 유전자 발현보다 덜 복잡한11을사용할 수 있다.
vesiculo에서 막 빌딩 블록의 발현과 그 이후의 멤브레인으로의 통합으로 인해 소포는11을 성장하기 시작합니다. ELP의 멤브레인 혼입은 FRET 분석을 통해 입증될 수 있다. 이를 위해, 초기 소포 집단의 형성에 사용되는 ELP는 FRET 쌍을 구성하는 동등한 공유에서 형광 염료와 결합된다. vesiculo에 있는 비 표지된 ELPs의 발현 및 막으로 의 한 그 혼입, 막에 있는 표지된 ELPs는 희석되고 그 결과로 FRET 신호는11감소합니다. 활용에 대한 다재다능하고 일반적인 방법으로, 구리 촉매 아지드 알키네 사이클로추가가 사용된다. 트리스(benzyltriazolylmethyl)-아민과 같은 안정화 리간드를 사용하여, 반응은 반응물(11)의 가수분해 없이 생리학적 pH에서 수성 용액으로 수행될 수 있으며, 이는 응축 반응에 적합합니다. 펩티드를 포함.
다음 프로토콜은 ELP 기반 펩티도솜 성장에 대한 준비에 대한 자세한 설명을 제시한다. 유리 비드 방법을 이용한 펩티드 및 소포 형성의 발현이 설명된다. 더욱이, ELP 소포 내부의 단백질 발현을 위한 형광 성 dBroccoli aptamer 및 전사 번역 반응의 전사를 구현하는 방법에 대해 설명된다. 마지막으로, 제공된 FLUP를 플루오로포어로 컨쥬게이션하는 절차이며, 이는 FRET 분석(11)을통해 소포 성장을 입증하는데 사용될 수 있다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2xYT</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>3012-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-PGA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5PRIME Phase Lock GelTM tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>733-2478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alkine-conjugated Cy3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>777331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alkine-conjugated Cy5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>777358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benzamidin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CN38.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 Rosetta 2 E. coli strain</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>71402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford BSA Protein Assay Kit</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>500-0201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carbenicillin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6344.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloramphenicol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3886.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4432.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>USB</td>
			<td>14121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P024.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DFHBI</td>
			<td>Lucerna Technologies</td>
			<td>410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A994.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9065.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads, acid-washed</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>USB</td>
			<td>16800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (&#946;-isopropyl thiogalactoside )</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P017.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X968.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>82.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>KK36.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg-glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Bio-Spin Chromatography Columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>732-6204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N6522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-azide linker (y-azidobutyric acid oxysuccinimide ester)</td>
			<td>Baseclick</td>
			<td>BCL-033-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-8000</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>263.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH stripes</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>549.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6367.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate-buffered saline</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76180-684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphoric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W290017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethyleneimine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>408727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAPol reaction buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor murine</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0314S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap Wipes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rNTP</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0466S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roti-Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol</td>
			<td>Carlroth</td>
			<td>A156.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTS Amino Acid Sampler</td>
			<td>5 Prime</td>
			<td>2401530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit)</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>66382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9265.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium hydroxide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8655.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile-filtered (0.22 &#181;m filter)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>XH76.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0251S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBTA (tris(benzyltriazolylmethyl)amine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>678937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP (tris(2-carboxyethyl)-phosphine hydrochloride)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>BP1521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA (from E. coli)</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>MRE600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>USB</td>
			<td>23160</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vesiculo synthesis of peptide membrane precursors for autonomous vesicle growth

생화확적인 반응의 구획화는 합성 세포의 중앙 양상입니다. 이러한 목적을 위해, 펩티드 기반 반응 구획은 리포좀 또는 지방산 계 소포에 대한 매력적인 대안으로 작용한다. 외부 또는 소포 내에서 펩티드는 쉽게 발현되고 막 전구체의 합성을 단순화 할 수 있습니다. 여기에 제공된 것은 유리 비드로부터탈수화-재수화를 활용하는 양친애 엘라스틴 유사 폴리펩티드(ELP)에 기초하여 ~200 nm의 직경을 가진 소포의 생성을 위한 프로토콜이다. 또한 역온도 사이클링을 통한 세균 ELP 발현 및 정제프로토콜뿐만 아니라 형광 염료를 통한 공유 기능화에 대한 프로토콜도 제시되어 있다. 더욱이, 본 보고서는 생화학반응에 대한 덜 복잡한 예로서 ELP 소포 내부의 RNA aptamer dBroccoli의 전사를 가능하게 하는 프로토콜을 기술한다. 마지막으로, 프로토콜이 제공되어 형광 단백질과 막 펩티드의 베시큘로 발현이 허용되는 반면, 후자의 합성은 소포 성장을 초래합니다.

소포 생산 도 1은 상이한 부종 용액 및 유리 비드 방법으로 제조된 소포의 투과 전자 현미경(TEM) 영상을 나타낸다(또한 Vogele et al.11참조). 도 1A의샘플에 대해, 소포의 형성을 증명하고 그들의 크기를 결정하기 위해 부종 용액으로 만 PBS를 사용했다. TX-TL이 팽윤용액(도1B)으로사용되었을 때, 소포도 ?...

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In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

자율 적인 소포 성장을 위한 펩티드 멤브레인 전구체의 베시큘로 합성

여기에 제시된 펩티드 계의 작은 unilamellar 소포의 생성을 위한 프로토콜은 성장할 수 있다. 막 펩티드의 vesiculo 생산을 용이하게하기 위해, 이들 소포는 전사 번역 시스템 및 펩티드 인코딩 플라스미드를 구비한다.

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an ...

우리의 프로토콜에서, 우리는 펩티드로 만든 반응 구획을 형성하기 위해 작은 유리 구슬에서 필름 재 수화를 사용합니다. 실험에서 우리는 프로토콜의 단순성과 견고성의 이점을 누릴 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 사용된 조세포 추출물과 같은 민감한 샘플을 통합하는 기능입니다.유기 용매와의 접촉은 시료에 크게 영향을 미칩니다. 이 절차를 시작하려면 원심 진공 농축기를 사용하여 ELP 용액을 1.1 밀리몰러에 집중합니다. 이 농축 용액의 마이크로리터 200개를 2~1개의 클로로폼 및 메탄올 혼합물의 1, 250 마이크로리터와 혼합합니다.철저하게 혼합하는 용액을 소용돌이. 다음으로 1.5그램의 구형 유리 구슬을 10밀리리터 라운드 하단 플라스크에 넣습니다. ELP와 클로로폼 메탄올 용액을 둥근 바닥 플라스크에 넣고 부드럽게 흔들어 섞습니다.플라스크를 회전 증발기에 연결합니다. 속도를 150 RPM으로 조정하고 액체가 실온에서 증발 될 때까지 약 4 분 동안 20, 000 파스칼로 압력을 조절합니다. 끓는 지연으로 인해 회전 증발기를 사용할 때주의하는 것이 중요합니다.그 후, 유리 구슬의 손실을 방지하기 위해 둥근 바닥 플라스크의 개구부 주위에 알루미늄 호일을 느슨하게 감싸고 플라스크를 적어도 한 시간 동안 건조기로 배치하여 남은 클로로폼과 메탄올이 증발되도록 합니다. 단일 실험을 위해, 혼합 100 펩티드 덮여 유리 구슬의 밀리그램 과 혼합 60 붓기 용액의 마이크로 리터. 이 샘플을 섭씨 25도에서 5분간 배양합니다.테이블 상단 원심분리기를 사용하여 샘플을 신속하게 원심분리하고 유리 구슬을 퇴적시합니다. 그런 다음 파이펫을 사용하여 소포가 들어있는 상체를 수집합니다. 첫째, 미리 정제된 플라스미드 DNA의 100마이크로리터를 마이크로 원심분리기 튜브에 로티-페놀, 클로로폼 또는 이소하밀 알코올100마이크로리터를 혼합하여 더 나은 위상 분리를 가능하게 한다.튜브를 최대 6회, 원심분리기를 16배, 000배, 실온으로 5분간 부드럽게 반전시면 됩니다. 그런 다음 상상에 200 마이크로리터를 추가하고 튜브를 최대 6회 반전시한다. 원심 분리는 샘플을 16, 000 배 g 및 실온에서 5 분 동안 분리합니다.그 후, 상체피는 별도의 튜브에 피펫과 에탄올 강수량에 대한 3개의 어금니 나트륨 아세테이트의 10 마이크로리터를 추가합니다. 섭씨 80도에 차가운 에탄올 1밀리리터를 넣고 샘플을 섭씨 80도에서 1시간 동안 보관합니다. 다음으로, 16, 000배, 섭씨 4도에서 15분간 원심분리합니다.상체를 데칭하고 섭씨 20도에서 차가운 70 %의 에탄올 1 밀리리터를 추가하십시오. 원심분리기는 16, 000배, 섭씨 4도에서 5분간. 그런 다음, 피펫팅에 의해 액체를 제거하고 DNA 펠릿을 방해하지 않도록 주의하십시오.샘플을 실온에 약 15분간 저장하여 나머지 에탄올을 증발시다. 그 후, 샘플 농도를 약 300 나노몰러로 조정하기 위해 시료에 초순수수를 첨가하여 260나노미터의 흡수로 측정한다. 전사 번역 반응을 준비하려면 준비된 원유 세포 추출 및 얼음에 대한 반응 버퍼를 따르십시오.60 마이크로리터 반응 믹스의 경우, 혈장 DNA를 반응 완충제의 37.5 마이크로리터에 추가하고, 28.7 마이크로리터의 조세포 추출물을 추가하고, 58.8 마이크로리터의 최종 부피에 초순수수를 채웁니다. 반응이 시작되기 직전에 T7RNA 폴리머라제 용액의 1.2 마이크로리터를 넣고 파이펫을 위아래로 섞어 넣습니다. 일반적으로 4 ~8 시간 인 실험 기간 동안 29섭씨에서 샘플 및 붓기 용액을 배양합니다.소포의 전송 전자 현미경 이미지는 TX / TL 또는 심지어 PBS와 같은 다양한 붓기 용액이 소포를 형성하는 데 사용될 수 있음을 보여줍니다. 두 솔루션 모두 크기 측정은 직선 전진 단계입니다. 다이나믹 라이트 산란은 유리 구슬 없이 제조된 소포가 직경 134나노미터의 결과이며, 유리 구슬을 사용할 때 25%의 다각형으로, 직경은 168나노미터로 생성되며, 직경은 21%의 다각성 도형성 단백질을 21%로 생성하며, 이는 2개의 형광 단백질의 형광 강도가 ELP를 이용하여 측정된다.소포 형성 후, 소포와 외부 용액의 내용이 동일하므로 항생제 가나마이신이 단백질 발현을 억제하기 위해 외부 용액에 첨가된다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 조절제로서, 카나마이신은 또한 베종 용액에 첨가되며, 이 경우 소포 내부의 단백질 발현이 억제된다. 이것은 카나마이신이 멤브레인을 통해 확산되지 않으며 항상 내부 표현을 지속적으로 억제한다는 것을 나타냅니다.그런 다음 FRET 분석이 ELP가 멤브레인으로 통합된 것을 시연하기 위해 수행됩니다. 멤브레인 ELP의 발현시, 추가 펩타이드는 막에 통합되어 FRET 쌍 사이의 평균 거리를 증가시키고 기증자 신호의 증가를 초래합니다. 제시된 기술은 간단한 반응 용기를 생성하거나 펩티드 기반 멤브레인을 가진 인공 세포를 만드는 데 사용될 수 있다.내부의 콘텐츠는 필요에 따라 선택할 수 있습니다. 이러한 펩티드 소포를 사용 하 여, 우리는 지금 그들 내에서 더 복잡 한 합성 반응에 기대할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

액슨 스트레치 성장의 연결을 성장의 Mechanotransduction

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata ...

연구

생체공학

Gold Nanostar Synthesis with a Silver Seed Mediated Growth Method

실버 씨앗 중재 성장 방법과 골드 Nanostar 합성

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest ...

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

3 차원 자기 조립 펩티드 히드로겔에서 인간 신경 전구 세포의 배양

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Generation and Recovery of ÃƒÅ½Ã‚Â²-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

단계 성장 PEG-펩타이드 Hydrogels에서 β-세포 Spheroids의 생성 및 복구

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

미세 유체 제트를 사용하여 지질 이중층 소포 세대

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Analysis of Tubular Membrane Networks in Cardiac Myocytes from Atria and Ventricles

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In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules - the transverse-axial tubule system (TATS) - controls deep intracellular signaling functions. ...

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발광 공명 에너지는 포유 동물 세포에 표현 막 단백질의 구조 변화를 연구에 전송

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

헤파린 결합 도메인 골 형성 성장 인자 전달을위한 고분자 전해질 복합

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Synthesis of Monocyte-targeting Peptide Amphiphile Micelles for Imaging of Atherosclerosis

동맥 경화 증의 영상에 대 한 펩 티 드 Amphiphile Micelles Monocyte 타겟팅의 합성

Atherosclerosis is a major contributor to cardiovascular disease, the leading cause of death worldwide, which claims 17.3 million lives annually. ...

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3 차원 펩 티 드 건설 기계에 포유류 세포 배양

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...