Name: in vesiculo synthesis of peptide membrane precursors for autonomous vesicle growth
Uploaded: 2019-06-28T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth at JoVE.com

Vi takker takknemlig finansiell støtte gjennom DFG TRR 235 (fremveksten av Life, prosjekt P15), European Research Council (Grant avtalen nr. 694410 AEDNA), og TUM International Graduate School for Science and Engineering IGSSE (prosjekt nr. 9,05) . Vi takker E. Falgenhauer for hennes hjelp med prøven forberedelse. Vi takker A. Dupin og M. Schwarz-Schilling for deres hjelp med TX-TL-systemet og nyttige diskusjoner. Vi takker N. B. Holland for nyttige diskusjoner.

1. uttrykk for elastin-lignende Polypeptider
<ol><li>Dag 1: utarbeidelse av en for rett kultur og forsyninger for peptid uttrykk
	<ol>
<li>Forbered og autoklav uttrykk kultur flasker (4 x 2,5 L) og 3 L av LB medium. For 1 L av LB medium, tilsett 25 g LB pulver til 1 L av ultrarent vann.</li>
		<li>Forbered en startkultur med 100 mL LB medium, 50 μL av steril-filtrert (0,22 μm filter) kloramfenikol oppløsning (25 mg/mL i EtOH), og 50 μL av steril-filtrert (0,22 μm filter) carbenicillin oppløsning ...

<ol>
	<li>Chen, I. A., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+kinetic+study+of+the+growth+of+fatty+acid+vesicles.">A kinetic study of the growth of fatty acid vesicles.</a> Biophysical Journal. 87 (2), 988-998 (2004).</li><li>Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggered+gene+expression+in+fed-vesicle+microreactors+with+a+multifunctional+membrane.">Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51 (13), 3114-3118 (2012).</li><li>Hardy, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-reproducing+catalyst+drives+repeated+phospholipid+synthesis+and+membrane+growth.">Self-reproducing catalyst drives repeated phospholipid synthesis and membrane growth.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8187-8192 (2015).</li><li>Scott, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Free+Phospholipid+Biosynthesis+by+Gene-Encoded+Enzymes+Reconstituted+in+Liposomes.">Cell-Free Phospholipid Biosynthesis by Gene-Encoded Enzymes Reconstituted in Liposomes.</a> PLoS ONE. 11 (10), e0163058 (2016).</li><li>Deamer, D. W., Barchfeld, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+of+macromolecules+by+lipid+vesicles+under+simulated+prebiotic+conditions.">Encapsulation of macromolecules by lipid vesicles under simulated prebiotic conditions.</a> Journal of Molecular Evolution. 18 (3), 203-206 (1982).</li><li>Adamala, K., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonenzymatic+Template-Directed+RNA+Synthesis+Inside+Model+Protocells.">Nonenzymatic Template-Directed RNA Synthesis Inside Model Protocells.</a> Science. 342 (6162), 1098-1100 (2013).</li><li>Zhu, T. F., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupled+growth+and+division+of+model+protocell+membranes.">Coupled growth and division of model protocell membranes.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (15), 5705-5713 (2009).</li><li>Kurihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-reproduction+of+supramolecular+giant+vesicles+combined+with+the+amplification+of+encapsulated+DNA.">Self-reproduction of supramolecular giant vesicles combined with the amplification of encapsulated DNA.</a> Nature Chemistry. 3 (10), 775-781 (2011).</li><li>Chu, H. -. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+analysis+of+an+elastin-like+polypeptide+(ELP)+in+a+cell-free+protein+synthesis+system.">Expression analysis of an elastin-like polypeptide (ELP) in a cell-free protein synthesis system.</a> Enzyme and Microbial Technology. 46 (2), 87-91 (2010).</li><li>Martino, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Expression,+Aggregation,+and+Triggered+Release+from+Polymersomes+as+Artificial+Cell-like+Structures.">Protein Expression, Aggregation, and Triggered Release from Polymersomes as Artificial Cell-like Structures.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51 (26), 6416-6420 (2012).</li><li>Vogele, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+synthetic+cells+using+peptide-based+reaction+compartments.">Towards synthetic cells using peptide-based reaction compartments.</a> Nature Communications. 9 (1), 3862 (2018).</li><li>Huber, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+amphiphilic+proteins+as+building+blocks+for+the+intracellular+formation+of+organelle-like+compartments.">Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments.</a> Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2014).</li><li>McPherson, D. T., Xu, J., Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Product+purification+by+reversible+phase+transition+following+Escherichia+coli+expression+of+genes+encoding+up+to+251+repeats+of+the+elastomeric+pentapeptide+GVGVP.">Product purification by reversible phase transition following Escherichia coli expression of genes encoding up to 251 repeats of the elastomeric pentapeptide GVGVP.</a> Protein Expression and Purification. 7 (1), 51-57 (1996).</li><li>Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+chemistry+of+biological+free+energy+transduction+as+demonstrated+by+elastic+protein-based+polymers.">Physical chemistry of biological free energy transduction as demonstrated by elastic protein-based polymers.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 101 (51), 11007-11028 (1997).</li><li>Urry, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin:+a+representative+ideal+protein+elastomer.">Elastin: a representative ideal protein elastomer.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 357 (1418), 169-184 (2002).</li><li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+recombinant+proteins+by+fusion+with+thermally-responsive+polypeptides.">Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides.</a> Nature Biotechnology. 17 (11), 1112-1115 (1999).</li><li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+synthesis+of+protein-based+polymers+with+precisely+specified+molecular+weight+and+sequence+by+recursive+directional+ligation:+examples+from+the+elastin-like+polypeptide+system.">Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system.</a> Biomacromolecules. 3 (2), 357-367 (2002).</li><li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology.">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).</li><li>Caschera, F., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+2.3+mg/ml+of+protein+with+an+all+Escherichia+coli+cell-free+transcription-translation+system.">Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system.</a> Biochimie. 99, 162-168 (2014).</li><li>Schwarz-Schilling, M., Aufinger, L., M&#252;ckl, A., Simmel, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+communication+between+bacteria+and+cell-free+gene+expression+systems+within+linear+chains+of+emulsion+droplets.">Chemical communication between bacteria and cell-free gene expression systems within linear chains of emulsion droplets.</a> Integrative Biology. 8 (4), 564-570 (2016).</li><li>Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+All+E.+coli+TX-TL+Toolbox+2.0:+A+Platform+for+Cell-Free+Synthetic+Biology.">The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology.</a> ACS Synthetic Biology. 5 (4), 344-355 (2016).</li><li>Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+and+polymersomes:+a+comparative+review+towards+cell+mimicking.">Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking.</a> Chemical Society Reviews. 47 (23), 8572-8610 (2018).</li><li>Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Broccoli Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broccoli:+Rapid+Selection+of+an+RNA+Mimic+of+Green+Fluorescent+Protein+by+Fluorescence-Based+Selection+and+Directed+Evolution.">Broccoli: Rapid Selection of an RNA Mimic of Green Fluorescent Protein by Fluorescence-Based Selection and Directed Evolution.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).</li><li>Zhang, S., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purifying+Plasmid+DNA+from+Bacterial+Colonies+Using+the+Qiagen+Miniprep+Kit.">Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), 247 (2007).</li><li>Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+light+scattering:+a+practical+guide+and+applications+in+biomedical+sciences.">Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences.</a> Biophysical Reviews. 8 (4), 409-427 (2016).</li></ol>

Film rehydrering er en vanlig prosedyre for etablering av små unilamellære blemmer. Den viktigste kilden til svikt er feil håndtering av materialene som brukes i prosedyren.

I utgangspunktet er ELPs produsert av E. coli celler. Avkastningen etter at ELP rensing kan variere betydelig avhengig av hvor nøye protokollen er gjennomført i løpet av sin avgjørende trinn. Dette er den inverse temperatur sykling (ITC) tr...

Opprettelsen av syntetiske levende cellulære systemer er vanligvis nærmet seg fra to forskjellige retninger. I top-down metoden, er det Genova av en bakterie redusert til sine essensielle komponenter, til slutt fører til en minimal celle. I nedenfra og opp tilnærming, er kunstige celler montert de Novo fra molekylære komponenter eller cellulære delsystemer, som må være funksjonelt integrert i en konsistent celle-lignende system.
I de Novo tilnærming, compartmentalization av de nødvendige biokjemiske komponentene er vanligvis oppnås ved hjelp av membraner laget av fosfolipider eller fettsyrer1,2,3,4. Dette er fordi "moderne" cellemembraner hovedsakelig består av fosfolipider, mens fettsyrer anses sannsynlig kandidater av prebiotiske membran vedlegg5,6. For dannelsen av nye membraner eller for å lette membran vekst, amfifile byggesteinene må gis fra utsiden7 eller ideelt gjennom produksjon i en membranous kupé med tilsvarende anabole prosesser4 ,8.
Mens lipid syntese er en relativt komplisert metabolske prosessen, kan peptider produseres ganske lett ved hjelp av Cell-Free genuttrykk reaksjoner9,10. Derav, peptid membraner dannet av amfifile peptider representerer et interessant alternativ til lipid membraner som kabinetter for kunstig celle etterligner som er i stand til å vokse11.
Amfifile elastin-lignende di-Block kopolymerer (ELPs) er en attraktiv klasse av peptider, som kan tjene som byggekloss for slike membraner12. Den grunnleggende aminosyren sekvens motiv av ELPs er (GaGVP)n, der "a" kan være noen aminosyre unntatt proline og "n" er antall motiv gjentar13,14, 15,16,17 . ELPs har blitt opprettet med en hydrofobe blokk som inneholder hovedsakelig fenylalanin for en og en hydrofile blokk hovedsakelig sammensatt av Glutaminsyre acid11. Avhengig av en og løsnings parametere, for eksempel pH-og saltkonsentrasjon, viser ELPs en såkalt invers temperatur overgang ved temperatur Tt, der peptider gjennomgår en fullstendig reversibel faseovergang fra en hydrofile til hydrofobe Staten. Syntesen av peptider kan enkelt implementeres inne blemmer ved hjelp av "TX-TL" bakteriell Cell Extract11,18, 19,20,21, som gir alle nødvendige komponenter for kombinert transkripsjon og oversettelse reaksjoner.
TX-TL-systemet ble innkapslet sammen, med DNA-mal kodingen ELPs i ELP blemmer utnytte dehydrering-rehydrering fra glassperler som en solid støtte. Dannelsen av blemmer oppstår gjennom rehydrering av tørkede peptider fra perle overflaten11. Andre metoder22 for vesicle formasjon kan brukes, som potensielt viser lavere polydispersitet og større vesicle størrelser (for eksempel elektro-formasjon, emulsjon faseoverføring, eller materialer-baserte metoder). For å teste levedyktigheten til innkapsling metoden, transkripsjon av fluorogenic aptamer dBroccoli23 kan alternativt brukes11, som er mindre komplisert enn genuttrykk med TX-TL-systemet.
På grunn av uttrykket av membranen byggesteinene i vesiculo og deres påfølgende innlemmelse i membranen, begynner blemmer å vokse11. Membran innlemmelse av ELPs kan påvises gjennom et bånd analysen. For dette formål, ELPs brukes til dannelsen av den opprinnelige vesicle befolkningen blir bøyd med fluorescerende fargestoffer i like deler utgjør et bånd par. Ved uttrykk for ikke-merket ELPs i vesiculo og deres innlemmelse i membranen, er merket ELPs i membranen fortynnet og følgelig bånd signalet synker11. Som en allsidig og vanlig metode for Bøyning, brukes kobber katalysert Natriumazid-alkyne sykloaddisjonsreaksjoner. Med bruk av en stabiliserende ligand som Tris (benzyltriazolylmethyl)-Amin, kan reaksjonen utføres i en vandig løsning på en fysiologisk pH uten hydrolyse av reaktantene11, som er hensiktsmessig for Bøyning reaksjoner som involverer peptider.
Følgende protokoll presenterer en detaljert beskrivelse av forberedelsene til voksende ELP-baserte peptidosomes. Uttrykket av peptider og vesicle formasjon ved hjelp av glassperler metoden er beskrevet. Videre er det beskrevet hvordan du implementerer transkripsjon av fluorogenic dBroccoli aptamer og transkripsjon-oversettelse reaksjon for protein uttrykk inne i ELP blemmer. Til slutt, forutsatt er en prosedyre for Bøyning av ELPs med fluorophores, som kan brukes til å bevise vesicle vekst gjennom et bånd analysen11.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2xYT</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>3012-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-PGA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5PRIME Phase Lock GelTM tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>733-2478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alkine-conjugated Cy3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>777331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alkine-conjugated Cy5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>777358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benzamidin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CN38.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 Rosetta 2 E. coli strain</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>71402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford BSA Protein Assay Kit</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>500-0201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carbenicillin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6344.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloramphenicol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3886.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4432.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>USB</td>
			<td>14121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P024.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DFHBI</td>
			<td>Lucerna Technologies</td>
			<td>410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A994.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9065.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads, acid-washed</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>USB</td>
			<td>16800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (&#946;-isopropyl thiogalactoside )</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P017.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X968.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>82.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>KK36.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg-glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Bio-Spin Chromatography Columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>732-6204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N6522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-azide linker (y-azidobutyric acid oxysuccinimide ester)</td>
			<td>Baseclick</td>
			<td>BCL-033-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-8000</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>263.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH stripes</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>549.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6367.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate-buffered saline</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76180-684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphoric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W290017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethyleneimine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>408727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAPol reaction buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor murine</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0314S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap Wipes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rNTP</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0466S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roti-Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol</td>
			<td>Carlroth</td>
			<td>A156.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTS Amino Acid Sampler</td>
			<td>5 Prime</td>
			<td>2401530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit)</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>66382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9265.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium hydroxide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8655.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile-filtered (0.22 &#181;m filter)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>XH76.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0251S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBTA (tris(benzyltriazolylmethyl)amine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>678937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP (tris(2-carboxyethyl)-phosphine hydrochloride)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>BP1521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA (from E. coli)</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>MRE600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>USB</td>
			<td>23160</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vesiculo synthesis of peptide membrane precursors for autonomous vesicle growth

Compartmentalization av biokjemiske reaksjoner er et sentralt aspekt av syntetiske celler. For dette formålet, peptid-baserte reaksjons rom fungerer som et attraktivt alternativ til liposomer eller fatty acid-baserte blemmer. Eksternt eller innenfor blemmer, kan peptider enkelt uttrykkes og forenkle syntesen av membran forløpere. Forutsatt her er en protokoll for etablering av blemmer med diametere på ~ 200 nm basert på amfifile elastin-lignende polypeptider (ELP) utnytte dehydrering-rehydrering fra glassperler. Også presentert er protokoller for bakteriell ELP uttrykk og rensing via inverse temperatur sykling, samt deres kovalente funksjonalisering med fluorescerende fargestoffer. Videre beskriver denne rapporten en protokoll for å muliggjøre transkripsjon av RNA aptamer dBroccoli innsiden ELP blemmer som et mindre komplekst eksempel for en biokjemiske reaksjon. Til slutt, en protokoll er gitt, som tillater i vesiculo uttrykk for fluorescerende proteiner og membranen peptid, mens syntese av sistnevnte resulterer i vesicle vekst.

Vesicle produksjon Figur 1 viser overføring elektron MIKROSKOPI (TEM) bilder av blemmer tilberedt med ulike hevelse løsninger og glassperler metoden (også se Vogele et al.11). For prøven i figur 1a, bare PBS ble brukt som hevelse løsning for å bevise dannelsen av blemmer og å bestemme størrelsen. Når TX-TL ble brukt som hevelse løsning (figur 1B), den blemmer også dannet. Dynami...

Watch this Scientific Journal Video about In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth at JoVE.com

In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

I Vesiculo syntese av peptid membran forløpere for autonome vesicle vekst

Presentert her er protokoller for etablering av peptid-baserte små unilamellære blemmer i stand til vekst. For å lette i vesiculo produksjon av membranen peptid, disse blemmer er utstyrt med en transkripsjon-oversettelse system og peptid-koding plasmider.

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an ...

I vår protokoll bruker vi filmrehydrering fra små glassperler for å danne reaksjonsrom laget av peptider. I eksperimenter drar vi nytte av protokollens enkelhet og robusthet. Den største fordelen med denne teknikken er evnen til å innlemme selv sensitive prøver, for eksempel det brukte råoljecelleekstraktet.Kontakt med organiske løsemidler vil påvirke prøven betydelig. For å starte denne prosedyren, bruk en sentrifugalvakuumkonsentrator for å konsentrere ELP-løsningen til 1,1 millimolar. Bland 200 mikroliter av denne konsentrerte oppløsningen med 1250 mikroliter av en to til en kloroform- og metanolblanding.Vortex oppløsningen for å blande grundig. Deretter legger du til 1,5 gram sfæriske glassperler til en ti milliliter rund bunnkolbe. Tilsett ELP og kloroform metanol løsning til den runde bunnen kolbe, og forsiktig riste å blande.Koble kolben til en roterende fordamper. Juster hastigheten til 150 RPM og regulere trykket til 20.000 pascals i ca fire minutter, til væsken fordampes ved romtemperatur. Det er viktig å være forsiktig når du bruker den roterende fordamperen på grunn av mulig kokende retardasjon.Etter dette, pakk løst aluminiumsfolie rundt åpningen av den runde bunnkolben for å forhindre tap av glassperler og legg kolben i en desiccator i minst en time, for å sikre at den gjenværende kloroformen og metanol fordampes. For et enkelt eksperiment, bland 100 milligram peptid dekket glassperler med 60 mikroliter av en hevelse løsning. Inkuber denne prøven ved 25 grader Celsius i fem minutter.Bruk en bordplate sentrifuge for å sentrifugere prøvene raskt og sediment glassperlene. Bruk deretter en pipette til å samle supernatant, som inneholder vesikler. Bland først 100 mikroliter av det forhåndsrensede plasmid-DNA-et med 100 mikroliter enten Roti-Fenol, kloroform eller isoamylalkohol i et mikrosentridrifugerør for å muliggjøre bedre faseseparasjon.Snu forsiktig røret opptil seks ganger og sentrifuge ved 16.000 ganger g og romtemperatur i fem minutter. Deretter legger du til 200 mikroliter kloroform i den øvre fasen, og inverterer røret opptil seks ganger. Sentrifuger prøven ved 16.000 ganger g og romtemperatur i fem minutter.Etter dette pipetter du supernatanten til et eget rør og legger til 10 mikroliter tre molarnatriumacetat for etanolnedbør. Tilsett en milliliter kaldt etanol ved 80 grader Celsius og lagre prøven på 80 grader Celsius i en time. Deretter sentrifuger prøven på 16, 000 ganger g og fire grader Celsius i 15 minutter.Dekanter supernatant og tilsett en milliliter kald 70% etanol ved 20 grader Celsius. Sentrifuge på 16, 000 ganger g og fire grader Celsius i fem minutter. Fjern deretter væsken ved å pipettering, vær forsiktig med å ikke forstyrre DNA-pelleten.Oppbevar prøven ved romtemperatur i ca. 15 minutter for å fordampe det gjenværende etanol. Etter dette legger du ultra rent vann til prøven for å justere prøvekonsentrasjonen til ca. 300 nanomolar, som måles ved absorpsjon ved 260 nanometer. For å forberede transkripsjon-oversettelsereaksjonen, følg den forberedte råoljecelleutvinningen og reaksjonsbufferen på is.For en 60 mikroliter reaksjonsblanding, tilsett plasma-DNA til 37,5 mikroliter av reaksjonsbufferen, tilsett 28,7 mikroliter råoljecelleekstrakt og fyll med ultra rent vann til et endelig volum på 58,8 mikroliter. Rett før reaksjonen starter, tilsett 1,2 mikroliter av T7RNA polymeraseløsningen, og pipette opp og ned for å blande. Inkuber prøven og en hevelse løsning på 29 grader Celsius for varigheten av eksperimentet, som vanligvis er fire til åtte timer.Transmisjonselektronmikroskopibilder av vesikler viser at ulike hevelsesløsninger, for eksempel TX/TL eller til og med bare PBS, kan brukes til å danne vesikler. For begge løsningene er størrelsesbestemmelse et rett frem trinn. Dynamisk lysspupping viser at vesikler tilberedt uten glassperler-metoden resulterer i en diameter på 134 nanometer, med en polydisperitet på 25%Når glassperler brukes, resulterer diameteren i 168 nanometer, med en polydisperitet på 21%Fluorescensintensiteten til to fluorescerende proteiner, som uttrykkes inne i ELP-vesikler, måles deretter ved hjelp av en fluorescensplateleser.Det er viktig å merke seg at etter vesikkeldannelse er innholdet i vesikler og den ytre løsningen de samme, og dermed legges antibiotika Kanamycin til den ytre løsningen for å undertrykke proteinuttrykk. Som en kontroll blir Kanamycin også lagt til hevelsesløsningen, i så fall undertrykkes proteinuttrykk inne i vesikkelen. Dette indikerer at Kanamycin ikke sprer seg gjennom membranen, og undertrykker internt uttrykk hele tiden.FRET-analysen utføres deretter for å demonstrere ELP-inkorporering i membranen. Ved uttrykk for membran ELPs, ytterligere peptider innlemme i membranen, noe som øker den gjennomsnittlige avstanden mellom FRET parene, og som resulterer i en økning av donor signal. Den presenterte teknikken kan brukes til å produsere enkle reaksjonsbeholdere eller for å lage kunstige celler med peptidbaserte membraner.Innholdet inni kan velges etter behov. Ved å bruke disse peptid vesikler, kan vi nå se fremover på mer komplekse syntese reaksjoner i dem.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata ...

Gold Nanostar Synthesis with a Silver Seed Mediated Growth Method

Gull Nanostar Synthesis med en Silver Seed Mediated Growth Method

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest ...

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

Dyrking av Human Neural stamceller i en 3-dimensjonal Self-montering Peptid Hydrogel

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Generation and Recovery of ÃƒÅ½Ã‚Â²-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Produksjon og gjenoppretting av β-celle sfæroider Fra Step-vekst PEG-peptid Hydrogeler

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Lipidbllag Vesikkel Generation Bruke Microfluidic Spyling

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Analysis of Tubular Membrane Networks in Cardiac Myocytes from Atria and Ventricles

Analyse av Tubular Membran Networks i hjertemuskelceller fra Atria og ventriklene

In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules - the transverse-axial tubule system (TATS) - controls deep intracellular signaling functions. ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Luminescence Resonance Energy Transfer til Studer konformasjonsendringer i membran proteiner uttrykt i pattedyrceller

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

Polyelektrolytkompleks for Heparin Binding Domain osteogene Growth Factor Levering

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Synthesis of Monocyte-targeting Peptide Amphiphile Micelles for Imaging of Atherosclerosis

Syntese av Monocyte målretting peptid Amphiphile Micelles for Imaging for åreforkalkning

Atherosclerosis is a major contributor to cardiovascular disease, the leading cause of death worldwide, which claims 17.3 million lives annually. ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

Dyrking pattedyrceller i tredimensjonale peptid stillaser

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...