Name: in vesiculo synthesis of peptide membrane precursors for autonomous vesicle growth
Uploaded: 2019-06-28T14:10:00
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Reconhecemos com gratidão o apoio financeiro através do DFG TRR 235 (emergence da vida, projeto P15), o Conselho Europeu de investigação (acordo de subvenção n º 694410 AEDNA), e a TUM International Graduate School for Science and Engineering IGSSE (projeto n º 9, 5) . Agradecemos a E. Falgenhauer por sua ajuda com a preparação da amostra. Agradecemos a. Dupin e M. Schwarz-Schilling por sua ajuda com o sistema TX-TL e discussões úteis. Agradecemos a N. B. Holland por discussões úteis.

1. expressão de polipeptídeos semelhantes à elastina
<ol><li>Dia 1: preparação de uma cultura inicial e suprimentos para a expressão peptídica
	<ol>
<li>Preparar e autoclave expressão frascos de cultura (4 x 2,5 L) e 3 L de LB médio. Para 1 L de meio LB, adicione 25 g de pó LB a 1 L de água ultrapura.</li>
		<li>Prepare uma cultura inicial com 100 mL de meio LB, 50 μL de solução de cloranfenicol (filtro de 0,22 μm) estéril-filtrada (25 mg/mL em EtOH) e 50 μL de solução de carbenicili...

<ol>
	<li>Chen, I. A., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+kinetic+study+of+the+growth+of+fatty+acid+vesicles.">A kinetic study of the growth of fatty acid vesicles.</a> Biophysical Journal. 87 (2), 988-998 (2004).</li><li>Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggered+gene+expression+in+fed-vesicle+microreactors+with+a+multifunctional+membrane.">Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51 (13), 3114-3118 (2012).</li><li>Hardy, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-reproducing+catalyst+drives+repeated+phospholipid+synthesis+and+membrane+growth.">Self-reproducing catalyst drives repeated phospholipid synthesis and membrane growth.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8187-8192 (2015).</li><li>Scott, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Free+Phospholipid+Biosynthesis+by+Gene-Encoded+Enzymes+Reconstituted+in+Liposomes.">Cell-Free Phospholipid Biosynthesis by Gene-Encoded Enzymes Reconstituted in Liposomes.</a> PLoS ONE. 11 (10), e0163058 (2016).</li><li>Deamer, D. W., Barchfeld, G. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+analysis+of+an+elastin-like+polypeptide+(ELP)+in+a+cell-free+protein+synthesis+system.">Expression analysis of an elastin-like polypeptide (ELP) in a cell-free protein synthesis system.</a> Enzyme and Microbial Technology. 46 (2), 87-91 (2010).</li><li>Martino, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Expression,+Aggregation,+and+Triggered+Release+from+Polymersomes+as+Artificial+Cell-like+Structures.">Protein Expression, Aggregation, and Triggered Release from Polymersomes as Artificial Cell-like Structures.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51 (26), 6416-6420 (2012).</li><li>Vogele, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+synthetic+cells+using+peptide-based+reaction+compartments.">Towards synthetic cells using peptide-based reaction compartments.</a> Nature Communications. 9 (1), 3862 (2018).</li><li>Huber, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+amphiphilic+proteins+as+building+blocks+for+the+intracellular+formation+of+organelle-like+compartments.">Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments.</a> Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2014).</li><li>McPherson, D. T., Xu, J., Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Product+purification+by+reversible+phase+transition+following+Escherichia+coli+expression+of+genes+encoding+up+to+251+repeats+of+the+elastomeric+pentapeptide+GVGVP.">Product purification by reversible phase transition following Escherichia coli expression of genes encoding up to 251 repeats of the elastomeric pentapeptide GVGVP.</a> Protein Expression and Purification. 7 (1), 51-57 (1996).</li><li>Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+chemistry+of+biological+free+energy+transduction+as+demonstrated+by+elastic+protein-based+polymers.">Physical chemistry of biological free energy transduction as demonstrated by elastic protein-based polymers.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 101 (51), 11007-11028 (1997).</li><li>Urry, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin:+a+representative+ideal+protein+elastomer.">Elastin: a representative ideal protein elastomer.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 357 (1418), 169-184 (2002).</li><li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+recombinant+proteins+by+fusion+with+thermally-responsive+polypeptides.">Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides.</a> Nature Biotechnology. 17 (11), 1112-1115 (1999).</li><li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+synthesis+of+protein-based+polymers+with+precisely+specified+molecular+weight+and+sequence+by+recursive+directional+ligation:+examples+from+the+elastin-like+polypeptide+system.">Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system.</a> Biomacromolecules. 3 (2), 357-367 (2002).</li><li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology.">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).</li><li>Caschera, F., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+2.3+mg/ml+of+protein+with+an+all+Escherichia+coli+cell-free+transcription-translation+system.">Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system.</a> Biochimie. 99, 162-168 (2014).</li><li>Schwarz-Schilling, M., Aufinger, L., M&#252;ckl, A., Simmel, F. 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R., Landfester, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+and+polymersomes:+a+comparative+review+towards+cell+mimicking.">Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking.</a> Chemical Society Reviews. 47 (23), 8572-8610 (2018).</li><li>Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Broccoli Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broccoli:+Rapid+Selection+of+an+RNA+Mimic+of+Green+Fluorescent+Protein+by+Fluorescence-Based+Selection+and+Directed+Evolution.">Broccoli: Rapid Selection of an RNA Mimic of Green Fluorescent Protein by Fluorescence-Based Selection and Directed Evolution.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).</li><li>Zhang, S., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purifying+Plasmid+DNA+from+Bacterial+Colonies+Using+the+Qiagen+Miniprep+Kit.">Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), 247 (2007).</li><li>Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+light+scattering:+a+practical+guide+and+applications+in+biomedical+sciences.">Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences.</a> Biophysical Reviews. 8 (4), 409-427 (2016).</li></ol>

A reidratação do filme é um procedimento comum para a criação de pequenas vesículas unilamelares. A principal fonte de falha é o manuseio incorreto dos materiais utilizados no procedimento.

Inicialmente, os ELPs são produzidos por células de E. coli . O rendimento após a purificação de ELP pode variar significativamente dependendo de como o protocolo é conduzido com cuidado durante suas etapas cruciais. E...

A criação de sistemas celulares vivos sintéticos é geralmente abordada a partir de duas direções diferentes. No método de cima para baixo, o genoma de uma bactéria é reduzido aos seus componentes essenciais, em última análise, levando a uma célula mínima. Na aproximação bottom-up, as pilhas artificiais são montadas de novo dos componentes moleculars ou dos subsistemas celulares, que precisam de ser integrados funcionalmente em um sistema cell-like consistente.
Na abordagem de de novo, a compartimentação dos componentes bioquímicos necessários é geralmente alcançada usando membranas feitas de fosfolipídios ou ácidos graxos1,2,3,4. Isso porque as membranas celulares "modernas" consistem principalmente de fosfolipídios, enquanto os ácidos graxos são considerados candidatos plausíveis de gabinetes de membrana prebiótica5,6. Para a formação de membranas novas ou para facilitar o crescimento da membrana, os blocos de construção anfifílico devem ser fornecidos do exterior7 ou idealmente com a produção dentro de um compartimento membranous usando os processos anabólicos correspondentes4 ,8.
Enquanto a síntese lipídica é um processo metabólico relativamente complexo, os peptídeos podem ser produzidos bastante prontamente usando reações de expressão gênica sem células9,10. Assim, as membranas peptídicas formadas por peptídeos anfífilos representam uma alternativa interessante para as membranas lipídicas como compartimentos para mímica de células artificiais que são capazes de crescer11.
Os copolímeros de di-bloco de elastina (ELPs) anfífilos são uma classe atrativa de peptídeos, que pode servir como o bloco de construção para tais membranas12. O motivo básico da sequência de aminoácidos de ELPS é (gagvp) n, onde "a" pode ser qualquer aminoácido, exceto prolina e "n" é o número de repetições de motivo13,14,15,16,17 . Os ELPs foram criados com um bloco hidrofóbico contendo principalmente fenilalanina para um e um bloco hidrófilo composto principalmente de ácido glutâmico11. Dependendo de um e parâmetros de solução, como pH e concentração de sal, ELPs exibem uma transição de temperatura inversa chamada na temperatura Tt, onde os peptídeos passam por uma transição de fase totalmente reversível de um hidrofílico para hidrofóbico Estado. A síntese dos peptídeos pode ser facilmente implementada dentro de vesículas usando o extrato de células bacterianas "TX-TL"11,18,19,20,21, que fornece todos os componentes necessários para a transcrição acoplada e reações de tradução.
O sistema TX-TL foi encapsulado em conjunto, com o modelo de DNA codificando os ELPs em vesículas ELP utilizando desidratação-reidratação de grânulos de vidro como suporte sólido. A formação de vesículas ocorre por meio da reidratação dos peptídeos secos da superfície do cordão11. Outros métodos22 para a formação de vesículas podem ser usados, que potencialmente apresentam menor polidispersão e tamanhos maiores de vesículas (por exemplo, electro-formação, transferência de fase de emulsão ou métodos baseados em microfluínicos). Para testar a viabilidade do método de encapsulamento, a transcrição do aptâmeros fluorogênico dbrócolos23 pode alternativamente ser usada11, que é menos complexa do que a expressão gênica com o sistema TX-TL.
Devido à expressão dos blocos de construção da membrana no vesicobolhosas e sua incorporação subseqüente na membrana, as vesículas começam a crescer11. A incorporação da membrana dos ELPs pode ser demonstrada através de um ensaio do FRET. Para este fim, os ELPs utilizados para a formação da população de vesículas iniciais são conjugados com corantes fluorescentes em partes iguais constituindo um par FRET. Em cima da expressão de ELPS não-etiquetados no vesicobolhosas e de sua incorporação na membrana, os ELPS etiquetados na membrana são diluídos e consequentemente o sinal do fret diminui11. Como um método versátil e comum para a conjugação, o cicloadição catalisado cobre da azida-alkyne é usado. Com o uso de um ligante estabilizante como a Tris (benzyltriazolylmethyl)-Amine, a reação pode ser realizada em uma solução aquosa em um pH fisiológico sem a hidrólise de reagentes11, que é apropriado para reações de conjugação envolvendo peptídeos.
O protocolo a seguir apresenta uma descrição detalhada da preparação para o cultivo de peptidosomas baseados em ELP. A expressão dos peptídeos e a formação de vesículas utilizando o método de grânulos de vidro são descritas. Além disso, descreve-se como implementar a transcrição do apdomador fluorogênico de Dbrócolos e a reação de transcrição-tradução para expressão protéica dentro das vesículas do ELP. Finalmente, fornecido é um procedimento para a conjugação de ELPs com fluoróforos, que pode ser usado para provar o crescimento da vesícula através de um ensaio FRET11.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2xYT</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>3012-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-PGA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5PRIME Phase Lock GelTM tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>733-2478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alkine-conjugated Cy3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>777331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alkine-conjugated Cy5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>777358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benzamidin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CN38.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 Rosetta 2 E. coli strain</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>71402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford BSA Protein Assay Kit</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>500-0201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carbenicillin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6344.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloramphenicol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3886.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4432.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>USB</td>
			<td>14121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P024.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DFHBI</td>
			<td>Lucerna Technologies</td>
			<td>410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A994.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9065.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads, acid-washed</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>USB</td>
			<td>16800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (&#946;-isopropyl thiogalactoside )</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P017.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X968.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>82.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>KK36.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg-glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Bio-Spin Chromatography Columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>732-6204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N6522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-azide linker (y-azidobutyric acid oxysuccinimide ester)</td>
			<td>Baseclick</td>
			<td>BCL-033-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-8000</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>263.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH stripes</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>549.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6367.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate-buffered saline</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76180-684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphoric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W290017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethyleneimine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>408727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAPol reaction buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor murine</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0314S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap Wipes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rNTP</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0466S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roti-Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol</td>
			<td>Carlroth</td>
			<td>A156.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTS Amino Acid Sampler</td>
			<td>5 Prime</td>
			<td>2401530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit)</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>66382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9265.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium hydroxide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8655.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile-filtered (0.22 &#181;m filter)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>XH76.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0251S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBTA (tris(benzyltriazolylmethyl)amine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>678937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP (tris(2-carboxyethyl)-phosphine hydrochloride)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>BP1521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA (from E. coli)</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>MRE600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>USB</td>
			<td>23160</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vesiculo synthesis of peptide membrane precursors for autonomous vesicle growth

A compartimentação das reações bioquímicas é um aspecto central das células sintéticas. Para esta finalidade, os compartimentos peptídicos da reação servem como uma alternativa atrativa aos lipossomas ou aos vesicles ácidos gordos-baseados. Externamente ou dentro das vesículas, os peptídeos podem ser facilmente expressos e simplificar a síntese de precursores de membrana. Fornecido aqui é um protocolo para a criação de vesículas com diâmetros de ~ 200 nm com base no anfífilo elastina-como polipeptídeos (ELP) utilizando desidratação-reidratação de grânulos de vidro. Também são apresentados protocolos para a expressão e purificação de ELP bacteriana através de ciclagem de temperatura inversa, bem como a sua funcionalização covalente com corantes fluorescentes. Além disso, este relatório descreve um protocolo para permitir a transcrição de dbrócolos do aptâmeros do RNA dentro dos vesículas de ELP como um exemplo menos complexo para uma reação bioquímica. Finalmente, um protocolo é fornecido, que permite na expressão do vesicobolhosas de proteínas fluorescentes e do peptide da membrana, visto que a síntese do último conduz ao crescimento do vesícula.

Produção de vesículas A Figura 1 mostra imagens de microscopia eletrônica de transmissão (Met) de vesículas preparadas com diferentes soluções de inchaço e o método de grânulos de vidro (ver também VOGELE et al.11). Para a amostra na Figura 1a, apenas a PBS foi utilizada como solução de inchaço para comprovar a formação de vesículas e determinar seu tamanho. Quando a TX-TL foi utilizada como solução...

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In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

Na síntese de Vesiculo de precursores de membrana peptídica para crescimento de vesículas autônomas

Apresentamos aqui os protocolos para a criação de pequenas vesículas unilamelares à base de peptídeos capazes de crescimento. Para facilitar na produção do vesicobolhosas do peptide da membrana, estas vesículas são equipadas com um sistema da transcrição-Tradução e o plasmídeo da peptide-codificação.

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an ...

Em nosso protocolo, usamos re-hidratação de filme de pequenas contas de vidro para formar compartimentos de reação feitos de peptídeos. Em experimentos, beneficiamos da simplicidade e robustez do protocolo. A principal vantagem dessa técnica é a capacidade de incorporar até mesmo amostras sensíveis, como o extrato de célula bruta usada.O contato com solventes orgânicos afetará significativamente a amostra. Para iniciar este procedimento, use um concentrador de vácuo centrífugo para concentrar a solução ELP a 1,1 mililitro. Misture 200 microliters desta solução concentrada com 1.250 microliters de uma mistura de clorofórmio e metanol de dois a um.Vórtice a solução para misturar completamente. Em seguida, adicione 1,5 gramas de contas de vidro esférica a um frasco fundo redondo de dez mililitros. Adicione a solução de metanol ELP e clorofórmio ao frasco fundo redondo e agite suavemente para misturar.Conecte o frasco a um evaporador rotativo. Ajuste a velocidade para 150 RPM e regular a pressão para 20.000 pascals por aproximadamente quatro minutos, até que o líquido seja evaporado à temperatura ambiente. É importante ter cuidado ao usar o evaporador rotativo devido a um possível retardo de ebulição.Depois disso, enrole vagamente a folha de alumínio em torno da abertura do frasco fundo redondo para evitar a perda de contas de vidro e coloque o frasco em um dessecador por pelo menos uma hora, para garantir que o clorofórmio restante e o metanol sejam evaporados. Para um único experimento, misture 100 miligramas das contas de vidro cobertas de peptídeos com 60 microliters de uma solução de inchaço. Incubar esta amostra a 25 graus Celsius por cinco minutos.Use uma centrífuga de mesa para centrifugar as amostras rapidamente e sedimentar as contas de vidro. Em seguida, use uma pipeta para coletar o supernatante, que contém as vesículas. Primeiro, misture 100 microlitadores do DNA plasmídeo pré-purificado com 100 microlitres de roti-phenol, clorofórmio ou álcool isoamílico em um tubo de micro centrífugas para permitir uma melhor separação de fase.Inverta suavemente o tubo até seis vezes e centrífuga a 16.000 vezes g e temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, adicione 200 microliters de clorofórmio à fase superior, e inverta o tubo até seis vezes. Centrifugar a amostra a 16.000 vezes g e temperatura ambiente por cinco minutos.Depois disso, pipete o supernascer a um tubo separado e adicione 10 microliters de três acetato de sódio molar para precipitação de etanol. Adicione um mililitro de etanol frio a 80 graus Celsius e armazene a amostra a 80 graus Celsius por uma hora. Em seguida, centrifugar a amostra a 16.000 vezes g e quatro graus Celsius por 15 minutos.Decante o supernascido e adicione um mililitro de etanol frio de 70% a 20 graus Celsius. Centrifugar a 16.000 vezes g e quatro graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, remova o líquido por pipetação, tomando cuidado para não perturbar a pelota de DNA.Armazene a amostra à temperatura ambiente por aproximadamente 15 minutos para evaporar o etanol restante. Depois disso, adicione água ultra pura à amostra para ajustar a concentração amostral a aproximadamente 300 nanomolar, que é medida por absorção em 260 nanômetros. Para preparar a reação de transcrição-tradução, siga a extração celular bruta preparada e o tampão de reação no gelo.Para uma mistura de reação de 60 microliteres, adicione o DNA de plasma a 37,5 microliters do buffer de reação, adicione 28,7 microliters de extrato celular bruto e preencha com água ultra pura a um volume final de 58,8 microliters. Logo antes da reação começar, adicione 1,2 microliters da solução de polimerase T7RNA e pipeta para cima e para baixo para misturar. Incubar a amostra e uma solução de inchaço a 29 graus Celsius durante a duração do experimento, que normalmente é de quatro a oito horas.Imagens de microscopia eletrônica de transmissão de vesículas mostram que várias soluções de inchaço, como TX/TL ou mesmo apenas PBS, podem ser usadas para formar vesículas. Para ambas as soluções, a determinação do tamanho é um passo direto. A dispersão dinâmica da luz mostra que as vesículas preparadas sem o método de contas de vidro resultam em um diâmetro de 134 nanômetros, com uma polidispersidade de 25% Quando as contas de vidro são usadas, o diâmetro resulta em 168 nanômetros, com uma polidispersidade de 21%A intensidade de fluorescência de duas proteínas fluorescentes, que são expressas dentro das vesículas ELP, são então medidas usando um leitor de placas de fluorescência.É importante notar que após a formação da vesícula, o conteúdo das vesículas e da solução externa são os mesmos, assim, o antibiótico Kanamycin é adicionado à solução externa para suprimir a expressão proteica. Como controle, a kanamicina também é adicionada à solução de inchaço, nesse caso a expressão proteica dentro da vesícula é suprimida. Isso indica que a Kanamicina não se difunde através da membrana, e suprime a expressão interna constantemente, o tempo todo.O ensaio FRET é então realizado para demonstrar a incorporação de ELP na membrana. Após a expressão dos ELPs de membrana, peptídeos adicionais se incorporam à membrana, o que aumenta a distância média entre os pares DE FRET, e o que resulta em um aumento do sinal de doador. A técnica apresentada pode ser usada para produzir recipientes de reação simples ou para criar células artificiais com membranas à base de peptídeos.O conteúdo interno pode ser escolhido conforme necessário. Usando essas vesículas de peptídeos, agora podemos olhar para a frente em reações de síntese mais complexas dentro delas.

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