Name: in vesiculo synthesis of peptide membrane precursors for autonomous vesicle growth
Uploaded: 2019-06-28T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth at JoVE.com

Мы с благодарностью отмечаем финансовую поддержку через DFG TRR 235 (Появление жизни, проект P15), Европейский исследовательский совет (грантовое соглашение No 694410 AEDNA) и Международную высшую школу науки и инженерии TUM (проект No 9.05) . Мы благодарим Э. Фальгенгауэр за помощь в подготовке образцов. Мы благодарим А. Дупина и М. Шварца-Шиллинга за помощь в системе TX-TL и полезные дискуссии. Мы благодарим Н.Б. Холланда за полезные дискуссии.

1. Выражение эластиноподобных полипептидов
<ol><li>День 1: Подготовка стартовой культуры и принадлежностей для экспрессии пептида
	<ol>
<li>Подготовка и автоклав экспрессии культуры фляги (4 х 2,5 л) и 3 L среды LB. Для 1 L среды LB, добавить 25 г порошка LB 1 л ультрачистой воды.</li>
		<li>Подготовь?...

<ol>
	<li>Chen, I. A., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+kinetic+study+of+the+growth+of+fatty+acid+vesicles.">A kinetic study of the growth of fatty acid vesicles.</a> Biophysical Journal. 87 (2), 988-998 (2004).</li><li>Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggered+gene+expression+in+fed-vesicle+microreactors+with+a+multifunctional+membrane.">Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51 (13), 3114-3118 (2012).</li><li>Hardy, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-reproducing+catalyst+drives+repeated+phospholipid+synthesis+and+membrane+growth.">Self-reproducing catalyst drives repeated phospholipid synthesis and membrane growth.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8187-8192 (2015).</li><li>Scott, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Free+Phospholipid+Biosynthesis+by+Gene-Encoded+Enzymes+Reconstituted+in+Liposomes.">Cell-Free Phospholipid Biosynthesis by Gene-Encoded Enzymes Reconstituted in Liposomes.</a> PLoS ONE. 11 (10), e0163058 (2016).</li><li>Deamer, D. W., Barchfeld, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+of+macromolecules+by+lipid+vesicles+under+simulated+prebiotic+conditions.">Encapsulation of macromolecules by lipid vesicles under simulated prebiotic conditions.</a> Journal of Molecular Evolution. 18 (3), 203-206 (1982).</li><li>Adamala, K., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonenzymatic+Template-Directed+RNA+Synthesis+Inside+Model+Protocells.">Nonenzymatic Template-Directed RNA Synthesis Inside Model Protocells.</a> Science. 342 (6162), 1098-1100 (2013).</li><li>Zhu, T. F., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupled+growth+and+division+of+model+protocell+membranes.">Coupled growth and division of model protocell membranes.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (15), 5705-5713 (2009).</li><li>Kurihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-reproduction+of+supramolecular+giant+vesicles+combined+with+the+amplification+of+encapsulated+DNA.">Self-reproduction of supramolecular giant vesicles combined with the amplification of encapsulated DNA.</a> Nature Chemistry. 3 (10), 775-781 (2011).</li><li>Chu, H. -. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+analysis+of+an+elastin-like+polypeptide+(ELP)+in+a+cell-free+protein+synthesis+system.">Expression analysis of an elastin-like polypeptide (ELP) in a cell-free protein synthesis system.</a> Enzyme and Microbial Technology. 46 (2), 87-91 (2010).</li><li>Martino, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Expression,+Aggregation,+and+Triggered+Release+from+Polymersomes+as+Artificial+Cell-like+Structures.">Protein Expression, Aggregation, and Triggered Release from Polymersomes as Artificial Cell-like Structures.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51 (26), 6416-6420 (2012).</li><li>Vogele, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+synthetic+cells+using+peptide-based+reaction+compartments.">Towards synthetic cells using peptide-based reaction compartments.</a> Nature Communications. 9 (1), 3862 (2018).</li><li>Huber, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+amphiphilic+proteins+as+building+blocks+for+the+intracellular+formation+of+organelle-like+compartments.">Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments.</a> Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2014).</li><li>McPherson, D. T., Xu, J., Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Product+purification+by+reversible+phase+transition+following+Escherichia+coli+expression+of+genes+encoding+up+to+251+repeats+of+the+elastomeric+pentapeptide+GVGVP.">Product purification by reversible phase transition following Escherichia coli expression of genes encoding up to 251 repeats of the elastomeric pentapeptide GVGVP.</a> Protein Expression and Purification. 7 (1), 51-57 (1996).</li><li>Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+chemistry+of+biological+free+energy+transduction+as+demonstrated+by+elastic+protein-based+polymers.">Physical chemistry of biological free energy transduction as demonstrated by elastic protein-based polymers.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 101 (51), 11007-11028 (1997).</li><li>Urry, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin:+a+representative+ideal+protein+elastomer.">Elastin: a representative ideal protein elastomer.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 357 (1418), 169-184 (2002).</li><li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+recombinant+proteins+by+fusion+with+thermally-responsive+polypeptides.">Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides.</a> Nature Biotechnology. 17 (11), 1112-1115 (1999).</li><li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+synthesis+of+protein-based+polymers+with+precisely+specified+molecular+weight+and+sequence+by+recursive+directional+ligation:+examples+from+the+elastin-like+polypeptide+system.">Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system.</a> Biomacromolecules. 3 (2), 357-367 (2002).</li><li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology.">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).</li><li>Caschera, F., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+2.3+mg/ml+of+protein+with+an+all+Escherichia+coli+cell-free+transcription-translation+system.">Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system.</a> Biochimie. 99, 162-168 (2014).</li><li>Schwarz-Schilling, M., Aufinger, L., M&#252;ckl, A., Simmel, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+communication+between+bacteria+and+cell-free+gene+expression+systems+within+linear+chains+of+emulsion+droplets.">Chemical communication between bacteria and cell-free gene expression systems within linear chains of emulsion droplets.</a> Integrative Biology. 8 (4), 564-570 (2016).</li><li>Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+All+E.+coli+TX-TL+Toolbox+2.0:+A+Platform+for+Cell-Free+Synthetic+Biology.">The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology.</a> ACS Synthetic Biology. 5 (4), 344-355 (2016).</li><li>Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+and+polymersomes:+a+comparative+review+towards+cell+mimicking.">Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking.</a> Chemical Society Reviews. 47 (23), 8572-8610 (2018).</li><li>Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Broccoli Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broccoli:+Rapid+Selection+of+an+RNA+Mimic+of+Green+Fluorescent+Protein+by+Fluorescence-Based+Selection+and+Directed+Evolution.">Broccoli: Rapid Selection of an RNA Mimic of Green Fluorescent Protein by Fluorescence-Based Selection and Directed Evolution.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).</li><li>Zhang, S., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purifying+Plasmid+DNA+from+Bacterial+Colonies+Using+the+Qiagen+Miniprep+Kit.">Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), 247 (2007).</li><li>Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+light+scattering:+a+practical+guide+and+applications+in+biomedical+sciences.">Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences.</a> Biophysical Reviews. 8 (4), 409-427 (2016).</li></ol>

Регидратация пленки является общей процедурой для создания небольших униламеллярных пузырьков. Основным источником отказа является неправильное обращение с материалами, используемыми в процедуре.

Первоначально ЭЛП производятся к?...

К созданию синтетических живых клеточных систем обычно подходят с двух разных направлений. В методе «сверху вниз» геном бактерии сводится к ее основным компонентам, что в конечном итоге приводит к минимальной клетке. При подходе «снизу вверх» искусственные клетки собираются из молекулярных компонентов или клеточных подсистем, которые должны быть функционально интегрированы в последовательную клеточную систему.
При подходе de novo разобщенное необходимые биохимические компоненты обычно достигается с помощью мембран, изготовленных из фосфолипидов или жирных кислот1,2,3,4. Это потому, что "современные" клеточные мембраны в основном состоят из фосфолипидов, в то время как жирные кислоты считаются правдоподобными кандидатами пребиотических мембранных корпусов5,6. Для образования новых мембран или для облегчения роста мембраны, амфифилические строительные блоки должны быть предоставлены из внешнего7 или в идеале через производство в мембранном отсеке с использованием соответствующих анаболических процессов4 ,8.
В то время как синтез липидов является относительно сложным метаболическим процессом, пептиды могут быть произведены довольно легко с помощью клеточных реакций экспрессии генов9,10. Таким образом, пептидные мембраны, образованные амфифильных пептидов представляют собой интересную альтернативу липидных мембран в качестве корпусов для искусственных клеток мимики, которые способны расти11.
Амфифильные эластиновые диблокитеры (ELPs) являются привлекательным классом пептидов, которые могут служить строительным блоком для таких мембран12. Основной мотив аминокислотной последовательности ELPs является (GaGVP)n, где "а" может быть любой аминокислоты, за исключением пролин и "n" является число мотив повторяет13,14,15,16,17 . ELPs были созданы с гидрофобным блоком, содержащим главным образом фенилаланин для и гидрофильных блоков в основном состоит из глутаминовой кислоты11. В зависимости от параметров раствора, таких как рН и концентрация соли, ELPsдемонстрируют так называемый обратный переход температуры при температуре T t, где пептиды проходят полностью обратимый переход фазы от гидрофильной к гидрофобной Государства. Синтез пептидов может быть легко реализован внутри пузырьков с помощью экстракта бактериальных клеток "TX-TL"11,18,19,20,21, который обеспечивает все необходимые компоненты для сочетания транскрипции и переводческих реакций.
TX-TL система была инкапсулирована вместе, с шаблоном ДНК кодирования ELPs в ELP пузырьков с использованием обезвоживания-регидратации из стеклянных бусин в качестве твердой поддержки. Формирование пузырьков происходит путем регидратации высушенных пептидов с поверхности бисера11. Другие методы22 для образования везикулы могут быть использованы, которые потенциально показывают более низкую polydispersity и более большие размеры везикулы (например, электро-образование, передача участка эмульсии, или microfluidics-основанные методы). Для проверки жизнеспособности метода инкапсуляции, транскрипция флюорогенного aptamer dBroccoli23 может быть использована в качестве альтернативы11, что является менее сложным, чем экспрессия генов с системой TX-TL.
Благодаря экспрессии мембранных строительных блоков в везикуло и их последующему включению в мембрану, пузырьки начинают расти11. Мембрана включения ELPs может быть продемонстрирована с помощью исследования FRET. С этой целью, ELPs, используемые для формирования первоначальной популяции везикл, спрягаются с флуоресцентными красителями в равных долях, составляющих пару FRET. При экспрессии немаркированных ELPs в vesiculo и их вхождение в мембрану, помеченные ЭЛП в мембране разбавляются и, следовательно, сигнал FRET уменьшается11. В качестве универсального и распространенного метода спряжения используется медь катализированный азиде-алкын циклоуг. При использовании стабилизирующего лиганда, такого как трис (бензилтриазолметилметил)-амин, реакция может осуществляться в вавном растворе при физиологическом рН без гидролиза реагентов11, что подходит для спряжений реакций с пептидами.
В следующем протоколе представлено подробное описание подготовки к выращиванию пептидосом на основе ELP. Описано выражение пептидов и образование везикул с использованием метода стеклянных бусин. Кроме того, описано, как реализовать транскрипцию флюорогенного апртами dBroccoli aptamer и транскрипции-перевод реакции для экспрессии белка внутри пузырьков ELP. Наконец, при условии, что это процедура для спряжения ЭЛП с флюорофорами, которые могут быть использованы для доказательства роста везикля через FRET ассссе11.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2xYT</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>3012-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-PGA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5PRIME Phase Lock GelTM tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>733-2478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alkine-conjugated Cy3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>777331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alkine-conjugated Cy5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>777358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benzamidin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CN38.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 Rosetta 2 E. coli strain</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>71402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford BSA Protein Assay Kit</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>500-0201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carbenicillin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6344.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloramphenicol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3886.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4432.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>USB</td>
			<td>14121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P024.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DFHBI</td>
			<td>Lucerna Technologies</td>
			<td>410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A994.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9065.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads, acid-washed</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>USB</td>
			<td>16800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (&#946;-isopropyl thiogalactoside )</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P017.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X968.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>82.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>KK36.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg-glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Bio-Spin Chromatography Columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>732-6204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N6522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-azide linker (y-azidobutyric acid oxysuccinimide ester)</td>
			<td>Baseclick</td>
			<td>BCL-033-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-8000</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>263.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH stripes</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>549.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6367.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate-buffered saline</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76180-684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphoric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W290017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethyleneimine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>408727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAPol reaction buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor murine</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0314S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap Wipes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rNTP</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0466S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roti-Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol</td>
			<td>Carlroth</td>
			<td>A156.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTS Amino Acid Sampler</td>
			<td>5 Prime</td>
			<td>2401530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit)</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>66382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9265.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium hydroxide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8655.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile-filtered (0.22 &#181;m filter)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>XH76.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0251S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBTA (tris(benzyltriazolylmethyl)amine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>678937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP (tris(2-carboxyethyl)-phosphine hydrochloride)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>BP1521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA (from E. coli)</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>MRE600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>USB</td>
			<td>23160</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vesiculo synthesis of peptide membrane precursors for autonomous vesicle growth

Соизвобихация биохимических реакций является центральным аспектом синтетических клеток. Для этого реакционные отсеки на основе пептида служат привлекательной альтернативой липосом или пузырькам на основе жирных кислот. Внешне или в пределах пузырьков пептиды могут быть легко выражены и упростить синтез мембранных прекурсоров. Здесь предусмотрен протокол для создания пузырьков диаметром 200 нм на основе амфифильных эластиноподобных полипептидов (ELP), используя обезвоживание-регидратацию из стеклянных бусин. Также представлены протоколы для бактериального выражения И очищения ELP через обратную температуру цикла, а также их ковалентной функционализации с флуоресцентными красителями. Кроме того, в настоящем докладе описывается протокол, позволяющий транскрипции РНК aptamer dBroccoli внутри пузырьков ELP, как менее сложный пример для биохимической реакции. Наконец, предусмотрен протокол, который позволяет в везикуло экспрессии флуоресцентных белков и мембранного пептида, в то время как синтез последнего приводит к росту везикулы.

Везикл производства На рисунке 1 показаны изображения электрон-микроскопии передачи (TEM), подготовленные с различными растворами отеков и методом стеклянных бусин (также см. Vogele et al.11). Для выборки на рисунке 1A, только PBS был использ?...

Watch this Scientific Journal Video about In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth at JoVE.com

In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

В Vesiculo Синтез прекурсоров пептидной Мембраны для автономного роста Весикл

Здесь представлены протоколы для создания пептидных основе малых unilamellar пузырьков способны к росту. Для облегчения производства везикуло мембранного пептида эти пузырьки оснащены системой транскрипции-перевода и пептидно-кодирующей плазмидой.

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an ...

В нашем протоколе мы используем регидратацию пленки из маленьких стеклянных бусинок для формирования реакционной отсеки из пептидов. В экспериментах мы извлекаем выгоду из простоты и надежности протокола. Основным преимуществом этого метода является способность включать даже чувствительные образцы, такие как использованная экстракт сырой клетки.Контакт с органическими растворителями существенно повлияет на образец. Чтобы начать эту процедуру, используйте центробежный вакуумный концентратор, чтобы сконцентрировать раствор ELP до 1,1 миллимолара. Смешайте 200 микролитров этого концентрированного раствора с 1 250 микролитров смеси хлороформа и метанола.Vortex решение тщательно перемешать. Затем добавьте 1,5 грамма сферических стеклянных бусин в десятимильную круглую нижнюю колбу. Добавьте раствор ELP и хлороформ метанола в круглую нижнюю колбу и аккуратно встряхните, чтобы перемешать.Соедините колбу с вращающимся испарителем. Отрегулируйте скорость до 150 об/мин и отрегулируйте давление до 20 000 паскалей в течение примерно четырех минут, пока жидкость не испарится при комнатной температуре. Важно быть осторожным при использовании роторного испарителя из-за возможной задержки кипения.После этого, свободно обернуть алюминиевую фольгу вокруг открытия круглой нижней колбы, чтобы предотвратить потерю стеклянных бусин и поместить колбу в децикатор, по крайней мере один час, чтобы убедиться, что остальные хлороформ и метанол испаряются. Для одного эксперимента смешайте 100 миллиграммов покрытых пептидом стеклянных бусинок с 60 микролитров раствора отеков. Инкубировать этот образец при 25 градусах по Цельсию в течение пяти минут.Используйте центрифугу столешного верха, чтобы центрифуга образцов быстро и осадок стеклянные бусы. Затем используйте пипетку для сбора супернатанта, который содержит пузырьки. Во-первых, смешать 100 микролитров предварительно очищенной плазмидной ДНК со 100 микролитров либо роти-фенола, хлороформа, либо изоамилового спирта в микро центрифуге трубки, чтобы лучше разделения фазы.Аккуратно инвертировать трубку до шести раз и центрифугу при температуре 16 000 г и комнатной температуре в течение пяти минут. Затем добавьте 200 микролитров хлороформа в верхнюю фазу и инвертировать трубку до шести раз. Центрифуга образца в 16 000 раз г и комнатная температура в течение пяти минут.После этого пипетку супернатант в отдельную трубку и добавить 10 микролитров трех ацетат натрия молара для осадков этанола. Добавьте один миллилитр холодного этанола при 80 градусах по Цельсию и храните образец при 80 градусах Цельсия в течение одного часа. Затем центрифуга образца в 16 000 раз г и четыре градуса цельсия в течение 15 минут.Декант супернатант и добавить один миллилитр холодного 70%этанола при 20 градусах по Цельсию. Центрифуга при 16 000 раз г и четыре градуса по Цельсию в течение пяти минут. Затем удалите жидкость путем пипетки, будьте осторожны, чтобы не беспокоить гранулы ДНК.Храните образец при комнатной температуре в течение примерно 15 минут, чтобы испарить оставшийся этанол. После этого добавьте в образец ультра чистую воду, чтобы отрегулировать концентрацию образца примерно до 300 наномоляров, которые измеряются абсорбцией на 260 нанометров. Чтобы подготовить транскрипционно-переводную реакцию, следуйте подготовленной добыче сырой клетки и буферу реакции на льду.Для смеси реакции 60 микролитров добавьте ДНК плазмы в 37,5 микролитров буфера реакции, добавьте 28,7 микролитров экстракта сырой клетки и заполните ультра чистой водой до конечного объема 58,8 микролитров. Прямо перед началом реакции добавьте 1,2 микролитров раствора полимеразы T7RNA и пипетки вверх и вниз, чтобы перемешать. Инкубировать образец и отек раствор при 29 градусах по Цельсию в течение всего эксперимента, который, как правило, от четырех до восьми часов.Передача электронной микроскопии изображения пузырьков показывают, что различные отек решения, такие как TX / TL или даже только PBS могут быть использованы для формирования пузырьков. Для обоих решений определение размера является прямым шагом вперед. Динамическое рассеяние света показывает, что пузырьки, подготовленные без метода стеклянных бусин, приводят к диаметру 134 нанометров, с полидисперсностью 25%При использовании стеклянных бусин диаметр составляет 168 нанометров, с поликлюперностью 21%Интенсивность флуоресценции двух флуоресцентных белков, которые выражаются внутри пузырьков ELP, затем измеряются с помощью флуоресцентной пластины.Важно отметить, что после образования пузырьков, содержание пузырьков и внешнего раствора одинаковы, таким образом, антибиотик Канамицин добавляется к внешнему раствору для подавления экспрессии белка. В качестве контроля, Канамицин также добавляется в отек раствор, и в этом случае экспрессия белка внутри везикулы подавляется. Это указывает на то, что Канамицин не рассеивается через мембрану, и подавляет внутреннее выражение постоянно, все время.Анализ FRET затем выполняется, чтобы продемонстрировать включение ELP в мембрану. При выражении мембранных ELPs, дополнительные пептиды включают в мембрану, что увеличивает среднее расстояние между парами FRET, и что приводит к увеличению донорского сигнала. Представленный метод может быть использован для производства простых контейнеров реакции или для создания искусственных клеток с пептидными мембранами.Содержимое внутри может быть выбрано по мере необходимости. Используя эти пептидные пузырьки, мы можем теперь смотреть вперед на более сложные реакции синтеза внутри них.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

Axon Stretch Рост: механотрансдукции нейронных рост

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata ...

Gold Nanostar Synthesis with a Silver Seed Mediated Growth Method

Золото Nanostar Синтез с опосредованная Серебряный Метод роста Семени

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest ...

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

Культивирование прав нервные клетки-предшественники в 3-мерном самоорганизации пептидов Гидрогель

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Generation and Recovery of ÃƒÅ½Ã‚Â²-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Создание и восстановление β-клетки сфероидов Из Шаг рост PEG-пептида Гидрогели

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Липидов Bilayer везикул поколения Использование микрофлюидных струйное

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Analysis of Tubular Membrane Networks in Cardiac Myocytes from Atria and Ventricles

Анализ трубчатой ​​мембраны сетей в кардиомиоциты от предсердий и желудочков

In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules - the transverse-axial tubule system (TATS) - controls deep intracellular signaling functions. ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Свечение резонанс переноса энергии по изучению конформационных изменений мембранных белков выражается в клетках млекопитающих

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

Полиэлектролита Комплекс для гепаринсвязывающий домена Остеогенная фактор роста Доставка

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Synthesis of Monocyte-targeting Peptide Amphiphile Micelles for Imaging of Atherosclerosis

Синтез ориентации Моноцит пептидные Амфифильность мицелл для визуализации атеросклероза

Atherosclerosis is a major contributor to cardiovascular disease, the leading cause of death worldwide, which claims 17.3 million lives annually. ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

Культивирование клеток млекопитающих в трехмерной пептид подмости

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...