Name: in vesiculo synthesis of peptide membrane precursors for autonomous vesicle growth
Uploaded: 2019-06-28T14:10:00
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Agradecemos el apoyo financiero a través de la DFG TRR 235 (Emergence of Life, proyecto P15), el Consejo Europeo de Investigación (acuerdo de subvención no 694410 AEDNA) y la TUM International Graduate School for Science and Engineering IGSSE (proyecto no 9.05) . Agradecemos a E. Falgenhauer por su ayuda con la preparación de muestras. Agradecemos a A. Dupin y M. Schwarz-Schilling por su ayuda con el sistema TX-TL y discusiones útiles. Agradecemos a N. B. Holland por sus útiles discusiones.

1. Expresión de polipéptidos similares a la elastrina
<ol><li>Día 1: Preparación de un cultivo inicial y suministros para la expresión de péptidos
	<ol>
<li>Preparación y autoclave de matraces de cultivo de expresión (4 x 2,5 L) y 3 L de medio LB. Para 1 L de medio LB, añadir 25 g de polvo LB a 1 L de agua ultrapura.</li>
		<li>Preparar un cultivo de arranque con 100 ml de medio LB, 50 ml de solución de cloramphenicol filtrada estérilmente (filtro de 0,22 m) (25 mg/ml en EtOH) y 50 ml de sol...

<ol>
	<li>Chen, I. A., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+kinetic+study+of+the+growth+of+fatty+acid+vesicles.">A kinetic study of the growth of fatty acid vesicles.</a> Biophysical Journal. 87 (2), 988-998 (2004).</li><li>Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggered+gene+expression+in+fed-vesicle+microreactors+with+a+multifunctional+membrane.">Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51 (13), 3114-3118 (2012).</li><li>Hardy, M. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+amphiphilic+proteins+as+building+blocks+for+the+intracellular+formation+of+organelle-like+compartments.">Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments.</a> Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2014).</li><li>McPherson, D. T., Xu, J., Urry, D. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+chemistry+of+biological+free+energy+transduction+as+demonstrated+by+elastic+protein-based+polymers.">Physical chemistry of biological free energy transduction as demonstrated by elastic protein-based polymers.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 101 (51), 11007-11028 (1997).</li><li>Urry, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin:+a+representative+ideal+protein+elastomer.">Elastin: a representative ideal protein elastomer.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 357 (1418), 169-184 (2002).</li><li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+recombinant+proteins+by+fusion+with+thermally-responsive+polypeptides.">Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides.</a> Nature Biotechnology. 17 (11), 1112-1115 (1999).</li><li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+synthesis+of+protein-based+polymers+with+precisely+specified+molecular+weight+and+sequence+by+recursive+directional+ligation:+examples+from+the+elastin-like+polypeptide+system.">Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system.</a> Biomacromolecules. 3 (2), 357-367 (2002).</li><li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology.">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).</li><li>Caschera, F., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+2.3+mg/ml+of+protein+with+an+all+Escherichia+coli+cell-free+transcription-translation+system.">Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system.</a> Biochimie. 99, 162-168 (2014).</li><li>Schwarz-Schilling, M., Aufinger, L., M&#252;ckl, A., Simmel, F. 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R., Landfester, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+and+polymersomes:+a+comparative+review+towards+cell+mimicking.">Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking.</a> Chemical Society Reviews. 47 (23), 8572-8610 (2018).</li><li>Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Broccoli Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broccoli:+Rapid+Selection+of+an+RNA+Mimic+of+Green+Fluorescent+Protein+by+Fluorescence-Based+Selection+and+Directed+Evolution.">Broccoli: Rapid Selection of an RNA Mimic of Green Fluorescent Protein by Fluorescence-Based Selection and Directed Evolution.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).</li><li>Zhang, S., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purifying+Plasmid+DNA+from+Bacterial+Colonies+Using+the+Qiagen+Miniprep+Kit.">Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), 247 (2007).</li><li>Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+light+scattering:+a+practical+guide+and+applications+in+biomedical+sciences.">Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences.</a> Biophysical Reviews. 8 (4), 409-427 (2016).</li></ol>

La rehidratación cinematográfica es un procedimiento común para la creación de pequeñas vesículas unilamellares. La principal fuente de fallo es el manejo incorrecto de los materiales utilizados en el procedimiento.

Inicialmente, los ELP son producidos por células de E. coli. El rendimiento después de la purificación de ELP puede variar significativamente dependiendo de la cuidadosa realización del protocolo...

La creación de sistemas celulares sintéticos vivos se aborda generalmente desde dos direcciones diferentes. En el método de arriba hacia abajo, el genoma de una bacteria se reduce a sus componentes esenciales, lo que en última instancia conduce a una célula mínima. En el enfoque ascendente, las células artificiales se ensamblan de novo a partir de componentes moleculares o subsistemas celulares, que necesitan integrarse funcionalmente en un sistema similar a una célula consistente.
En el enfoque de novo, la compartimentación de los componentes bioquímicos necesarios se logra generalmente utilizando membranas hechas de fosfolípidos o ácidos grasos1,2,3,4. Esto se debe a que las membranas celulares "modernas" consisten principalmente en fosfolípidos, mientras que los ácidos grasos se consideran candidatos plausibles de recintos de membrana prebióticos5,6. Para la formación de nuevas membranas o para facilitar el crecimiento de la membrana, los bloques de construcción anfifílicos deben proporcionarse desde el exterior7 o idealmente a través de la producción dentro de un compartimento membranoso utilizando los procesos anabólicos correspondientes4 ,8.
Mientras que la síntesis de lípidos es un proceso metabólico relativamente complejo, los péptidos se pueden producir con bastante facilidad utilizando reacciones de expresión génica libre de células9,10. Por lo tanto, las membranas peptídicas formadas por péptidos anfifílicos representan una alternativa interesante a las membranas lipídicas como recintos para imitaciones celulares artificiales que son capaces de crecer11.
Los copolímeros dibloquealinas anfifílicas similares a dibloques (ELP) son una atractiva clase de péptidos, que pueden servir como bloque de construcción para tales membranas12. El motivo básico de secuencia de aminoácidos de ELPs es (GaGVP)n, donde "a" puede ser cualquier aminoácido excepto prolina y "n" es el número de repeticiones de motivo13,14,15,16,17 . Los ELP se han creado con un bloque hidrófobo que contiene principalmente fenilalanina para un y un bloque hidrófilo compuesto principalmente de ácido glutámico11. Dependiendo de los parámetros de una y solución, como el pH y la concentración de sal, los ELP presentan una llamada transición inversa de la temperatura a temperatura Tt, donde los péptidos se someten a una transición de fase totalmente reversible de un hidrófilo a un hidrofóbico Estado. La síntesis de los péptidos se puede implementar fácilmente dentro de las vesículas utilizando el extracto de células bacterianas "TX-TL"11,18,19,20,21, que proporciona todos los componentes necesarios para la transcripción acoplada y las reacciones de traducción.
El sistema TX-TL fue encapsulado juntos, con la plantilla de ADN que codifica los ELP en vesículas ELP utilizando la deshidratación-rehidratación de cuentas de vidrio como un soporte sólido. La formación de vesículas se produce a través de la rehidratación de los péptidos secos de la superficie del cordón11. Se pueden utilizar otros métodos22 para la formación de vesículas, que potencialmente muestran una polidispersidad más baja y tamaños de vesícula más grandes (por ejemplo, electroformación, transferencia de fase de emulsión o métodos basados en microfluídicos). Para probar la viabilidad del método de encapsulación, la transcripción del aptámero fluorogénico dBroccoli23 se puede utilizar alternativamente11,que es menos compleja que la expresión génica con el sistema TX-TL.
Debido a la expresión de los bloques de construcción de membrana en vesiculo y su posterior incorporación a la membrana, las vesículas comienzan a crecer11. La incorporación de membrana de los ELP se puede demostrar a través de un ensayo FRET. Con este fin, los ELP utilizados para la formación de la población inicial de vesículas se conjugan con colorantes fluorescentes en partes iguales que constituyen un par FRET. Tras la expresión de ELP no etiquetados en vesiculo y su incorporación a la membrana, los ELP etiquetados en la membrana se diluyen y, en consecuencia, la señal FRET disminuye11. Como método versátil y común para la conjugación, se utiliza la cicloadición de azide-alquino catalizada en cobre. Con el uso de un ligando estabilizador como tris(benzyltriazolylmethyl)-amine, la reacción se puede llevar a cabo en una solución acuosa a un pH fisiológico sin la hidrólisis de los reactivos11,que es apropiado para reacciones de conjugación péptidos.
El siguiente protocolo presenta una descripción detallada de la preparación para el cultivo de peptidosomas basados en ELP. Se describe la expresión de los péptidos y la formación de vesículas utilizando el método de cuentas de vidrio. Además, se describe cómo implementar la transcripción del aptámero fluorogénico de dBroccoli y la reacción de transcripción-traducción para la expresión de proteínas dentro de las vesículas ELP. Por último, se proporciona un procedimiento para la conjugación de ELP con fluoróforos, que se puede utilizar para probar el crecimiento de la vesícula a través de un ensayo FRET11.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2xYT</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>3012-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-PGA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5PRIME Phase Lock GelTM tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>733-2478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alkine-conjugated Cy3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>777331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alkine-conjugated Cy5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>777358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benzamidin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CN38.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 Rosetta 2 E. coli strain</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>71402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford BSA Protein Assay Kit</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>500-0201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carbenicillin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6344.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloramphenicol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3886.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4432.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>USB</td>
			<td>14121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P024.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DFHBI</td>
			<td>Lucerna Technologies</td>
			<td>410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A994.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9065.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads, acid-washed</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>USB</td>
			<td>16800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (&#946;-isopropyl thiogalactoside )</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P017.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X968.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>82.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>KK36.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg-glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Bio-Spin Chromatography Columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>732-6204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N6522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-azide linker (y-azidobutyric acid oxysuccinimide ester)</td>
			<td>Baseclick</td>
			<td>BCL-033-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-8000</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>263.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH stripes</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>549.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6367.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate-buffered saline</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76180-684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphoric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W290017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethyleneimine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>408727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAPol reaction buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor murine</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0314S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap Wipes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rNTP</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0466S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roti-Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol</td>
			<td>Carlroth</td>
			<td>A156.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTS Amino Acid Sampler</td>
			<td>5 Prime</td>
			<td>2401530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit)</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>66382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9265.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium hydroxide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8655.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile-filtered (0.22 &#181;m filter)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>XH76.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0251S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBTA (tris(benzyltriazolylmethyl)amine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>678937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP (tris(2-carboxyethyl)-phosphine hydrochloride)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>BP1521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA (from E. coli)</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>MRE600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>USB</td>
			<td>23160</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vesiculo synthesis of peptide membrane precursors for autonomous vesicle growth

La compartimentación de las reacciones bioquímicas es un aspecto central de las células sintéticas. Para este propósito, los compartimentos de reacción basados en péptidos sirven como una alternativa atractiva a los liposomas o vesículas a base de ácidos grasos. Externamente o dentro de las vesículas, los péptidos se pueden expresar fácilmente y simplificar la síntesis de precursores de membrana. Aquí se proporciona un protocolo para la creación de vesículas con diámetros de 200 nm basados en los polipéptidos anfifílicos similares a la elastina (ELP) utilizando la deshidratación-rehidratación de cuentas de vidrio. También se presentan los protocolos para la expresión y purificación de ELP bacteriana a través del ciclo de temperatura inversa, así como su funcionalización covalente con colorantes fluorescentes. Además, este informe describe un protocolo para permitir la transcripción del ARN aptamer dBroccoli dentro de las vesículas ELP como un ejemplo menos complejo para una reacción bioquímica. Por último, se proporciona un protocolo, que permite la expresión vesiculo de proteínas fluorescentes y el péptido de membrana, mientras que la síntesis de este último da lugar al crecimiento de la vesícula.

Producción de vesículas La Figura 1 muestra imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM) de vesículas preparadas con diferentes soluciones de hinchazón y el método de cuentas de vidrio (véase también Vogele et al.11). Para la muestra de la Figura 1A,sólo PBS se utilizó como solución de hinchazón para probar la formación de vesículas y determinar su tamaño. Cuando TX-TL se utilizó como sol...

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In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

En Vesiculo Síntesis de Precursores de Membrana De péptido para crecimiento de la vesícula Autónoma

Aquí se presentan protocolos para la creación de pequeñas vesículas unilamelares basadas en péptidos capaces de crecer. Para facilitar la producción vesiculo del péptido de membrana, estas vesículas están equipadas con un sistema de transcripción-traducción y el plásmido codificante de péptidos.

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an ...

En nuestro protocolo, utilizamos la rehidratación de película a partir de pequeñas cuentas de vidrio para formar compartimentos de reacción hechos de péptidos. En los experimentos, nos beneficiamos de la simplicidad y robustez del protocolo. La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de incorporar incluso muestras sensibles, como el extracto de célula bruta utilizado.El contacto con disolventes orgánicos afectará significativamente a la muestra. Para comenzar este procedimiento, utilice un concentrador de vacío centrífugo para concentrar la solución ELP a 1,1 mililitros. Mezclar 200 microlitros de esta solución concentrada con 1,250 microlitros de una mezcla de cloroformo y metanol de dos a uno.Vortex la solución para mezclar a fondo. A continuación, agregue 1,5 gramos de cuentas de vidrio esférico a un matraz inferior redondo de diez mililitros. Agregue la solución elP y el metanol cloroformo al matraz inferior redondo, y agite suavemente para mezclar.Conecte el matraz a un evaporador rotatorio. Ajuste la velocidad a 150 RPM y regule la presión a 20.000 pascales durante aproximadamente cuatro minutos, hasta que el líquido se evapore a temperatura ambiente. Es importante tener cuidado al usar el evaporador rotatorio debido a un posible retraso en ebullición.Después de esto, envuelva libremente la lámina de aluminio alrededor de la abertura del matraz inferior redondo para evitar la pérdida de cuentas de vidrio y coloque el matraz en un desecador durante al menos una hora, para asegurarse de que el cloroformo restante y el metanol se evaporan. Para un solo experimento, mezcle 100 miligramos de las cuentas de vidrio cubiertas por péptidos con 60 microlitros de una solución de hinchazón. Incubar esta muestra a 25 grados centígrados durante cinco minutos.Utilice una centrífuga de mesa para centrifugar las muestras rápidamente y sedimentar las cuentas de vidrio. A continuación, utilice una pipeta para recoger el sobrenadante, que contiene las vesículas. En primer lugar, mezclar 100 microlitros del ADN plásmido pre purificado con 100 microlitros de Roti-Phenol, cloroformo o alcohol isoamilo en un tubo de micro centrífuga para permitir una mejor separación de fase.Invierta suavemente el tubo hasta seis veces y centrifugar a 16.000 veces g y temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, agregue 200 microlitros de cloroformo a la fase superior e invierta el tubo hasta seis veces. Centrifugar la muestra a 16.000 veces g y a temperatura ambiente durante cinco minutos.Después de esto, pipetear el sobrenadante a un tubo separado y añadir 10 microlitros de tres molares de acetato de sodio para la precipitación de etanol. Agregue un mililitro de etanol frío a 80 grados Centígrados y guárdelo a 80 grados Celsius durante una hora. A continuación, centrifugar la muestra a 16.000 veces g y cuatro grados centígrados durante 15 minutos.Decantar el sobrenadante y añadir un mililitro de frío 70%etanol a 20 grados Celsius. Centrifugar a 16.000 veces g y cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Luego, retire el líquido pipeteando, teniendo cuidado de no molestar el pellet de ADN.Conservar la muestra a temperatura ambiente durante aproximadamente 15 minutos para evaporar el etanol restante. Después de esto, añadir agua ultra pura a la muestra para ajustar la concentración de la muestra a aproximadamente 300 nanomolares, que se mide por absorción a 260 nanómetros. Para preparar la reacción de transcripción-traducción, siga la extracción de células brutas preparadas y el búfer de reacción en el hielo.Para una mezcla de reacción de 60 microlitros, agregue el ADN plasmático a 37,5 microlitros del tampón de reacción, agregue 28,7 microlitros de extracto de células brutas y llene con agua ultra pura a un volumen final de 58,8 microlitros. Justo antes de que comience la reacción, agregue 1,2 microlitros de la solución de polimerasa T7RNA, y pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar. Incubar la muestra y una solución de hinchazón a 29 grados centígrados durante la duración del experimento, que suele ser de cuatro a ocho horas.Las imágenes de microscopía electrónica de transmisión de vesículas muestran que se pueden utilizar varias soluciones de hinchazón, como TX/TL o incluso sólo PBS para formar vesículas. Para ambas soluciones, la determinación del tamaño es un paso directo. La dispersión dinámica de la luz muestra que las vesículas preparadas sin el método de las perlas de vidrio dan como resultado un diámetro de 134 nanómetros, con una polidispersidad del 25% Cuando se utilizan cuentas de vidrio, el diámetro da como resultado 168 nanómetros, con una polidispersidad del 21%La intensidad de fluorescencia de dos proteínas fluorescentes, que se expresan dentro de las vesículas ELP, se miden entonces utilizando un lector de placas de fluorescencia.Es importante tener en cuenta que después de la formación de vesículas, el contenido de las vesículas y la solución externa son los mismos, por lo tanto, el antibiótico Kanamicina se añade a la solución exterior para suprimir la expresión de proteínas. Como control, la kanamicina también se añade a la solución de hinchazón, en cuyo caso se suprime la expresión proteica dentro de la vesícula. Esto indica que la kanamicina no se difunde a través de la membrana, y suprime la expresión interna constantemente, todo el tiempo.A continuación, se realiza el ensayo FRET para demostrar la incorporación de ELP en la membrana. Tras la expresión de los ELP de membrana, los péptidos adicionales se incorporan a la membrana, lo que aumenta la distancia media entre los pares fret, y que resulta en un aumento de la señal del donante. La técnica presentada se puede utilizar para producir recipientes de reacción simples o para crear células artificiales con membranas basadas en péptidos.El contenido interior se puede elegir según sea necesario. Mediante el uso de estas vesículas péptidos, ahora podemos mirar hacia adelante en reacciones de síntesis más complejas dentro de ellos.

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