Name: in vesiculo synthesis of peptide membrane precursors for autonomous vesicle growth
Uploaded: 2019-06-28T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth at JoVE.com

Vi erkänner tacksamt finansiellt stöd genom DFG TRR 235 (livets uppkomst, Project p15), Europeiska forskningsrådet (Grant Agreement nr 694410 AEDNA), och TUM internationella forskarskolan för vetenskap och teknik IGSSE (projekt nr 9,05) . Vi tackar E. Falgenhauer för hennes hjälp med provberedning. Vi tackar A. Dupin och M. Schwarz-Schilling för deras hjälp med TX-TL-systemet och nyttiga diskussioner. Vi tackar N. B. Holland för nyttiga diskussioner.

1. uttryck av elastin-liknande polypeptider
<ol><li>Dag 1: förberedelse av en förrätt kultur och tillförsel för peptid uttryck
	<ol>
<li>Förbered och autoklav uttryck kultur flaskor (4 x 2,5 L) och 3 L LB medium. För 1 l lb-medium, tillsätt 25 g lb pulver till 1 l ultrarent vatten.</li>
		<li>Förbered en förrätt kultur med 100 ml lb-medium, 50 μl sterilt filtrerat (0,22 μm filter) kloramfenikollösning (25 mg/ml i EtOH) och 50 μl av sterilt filtrerat (0,22 μm filter) carbenicillin-lösni...

<ol>
	<li>Chen, I. A., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+kinetic+study+of+the+growth+of+fatty+acid+vesicles.">A kinetic study of the growth of fatty acid vesicles.</a> Biophysical Journal. 87 (2), 988-998 (2004).</li><li>Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggered+gene+expression+in+fed-vesicle+microreactors+with+a+multifunctional+membrane.">Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51 (13), 3114-3118 (2012).</li><li>Hardy, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-reproducing+catalyst+drives+repeated+phospholipid+synthesis+and+membrane+growth.">Self-reproducing catalyst drives repeated phospholipid synthesis and membrane growth.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8187-8192 (2015).</li><li>Scott, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Free+Phospholipid+Biosynthesis+by+Gene-Encoded+Enzymes+Reconstituted+in+Liposomes.">Cell-Free Phospholipid Biosynthesis by Gene-Encoded Enzymes Reconstituted in Liposomes.</a> PLoS ONE. 11 (10), e0163058 (2016).</li><li>Deamer, D. W., Barchfeld, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+of+macromolecules+by+lipid+vesicles+under+simulated+prebiotic+conditions.">Encapsulation of macromolecules by lipid vesicles under simulated prebiotic conditions.</a> Journal of Molecular Evolution. 18 (3), 203-206 (1982).</li><li>Adamala, K., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonenzymatic+Template-Directed+RNA+Synthesis+Inside+Model+Protocells.">Nonenzymatic Template-Directed RNA Synthesis Inside Model Protocells.</a> Science. 342 (6162), 1098-1100 (2013).</li><li>Zhu, T. F., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupled+growth+and+division+of+model+protocell+membranes.">Coupled growth and division of model protocell membranes.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (15), 5705-5713 (2009).</li><li>Kurihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-reproduction+of+supramolecular+giant+vesicles+combined+with+the+amplification+of+encapsulated+DNA.">Self-reproduction of supramolecular giant vesicles combined with the amplification of encapsulated DNA.</a> Nature Chemistry. 3 (10), 775-781 (2011).</li><li>Chu, H. -. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+analysis+of+an+elastin-like+polypeptide+(ELP)+in+a+cell-free+protein+synthesis+system.">Expression analysis of an elastin-like polypeptide (ELP) in a cell-free protein synthesis system.</a> Enzyme and Microbial Technology. 46 (2), 87-91 (2010).</li><li>Martino, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Expression,+Aggregation,+and+Triggered+Release+from+Polymersomes+as+Artificial+Cell-like+Structures.">Protein Expression, Aggregation, and Triggered Release from Polymersomes as Artificial Cell-like Structures.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51 (26), 6416-6420 (2012).</li><li>Vogele, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+synthetic+cells+using+peptide-based+reaction+compartments.">Towards synthetic cells using peptide-based reaction compartments.</a> Nature Communications. 9 (1), 3862 (2018).</li><li>Huber, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+amphiphilic+proteins+as+building+blocks+for+the+intracellular+formation+of+organelle-like+compartments.">Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments.</a> Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2014).</li><li>McPherson, D. T., Xu, J., Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Product+purification+by+reversible+phase+transition+following+Escherichia+coli+expression+of+genes+encoding+up+to+251+repeats+of+the+elastomeric+pentapeptide+GVGVP.">Product purification by reversible phase transition following Escherichia coli expression of genes encoding up to 251 repeats of the elastomeric pentapeptide GVGVP.</a> Protein Expression and Purification. 7 (1), 51-57 (1996).</li><li>Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+chemistry+of+biological+free+energy+transduction+as+demonstrated+by+elastic+protein-based+polymers.">Physical chemistry of biological free energy transduction as demonstrated by elastic protein-based polymers.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 101 (51), 11007-11028 (1997).</li><li>Urry, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin:+a+representative+ideal+protein+elastomer.">Elastin: a representative ideal protein elastomer.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 357 (1418), 169-184 (2002).</li><li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+recombinant+proteins+by+fusion+with+thermally-responsive+polypeptides.">Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides.</a> Nature Biotechnology. 17 (11), 1112-1115 (1999).</li><li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+synthesis+of+protein-based+polymers+with+precisely+specified+molecular+weight+and+sequence+by+recursive+directional+ligation:+examples+from+the+elastin-like+polypeptide+system.">Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system.</a> Biomacromolecules. 3 (2), 357-367 (2002).</li><li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology.">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).</li><li>Caschera, F., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+2.3+mg/ml+of+protein+with+an+all+Escherichia+coli+cell-free+transcription-translation+system.">Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system.</a> Biochimie. 99, 162-168 (2014).</li><li>Schwarz-Schilling, M., Aufinger, L., M&#252;ckl, A., Simmel, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+communication+between+bacteria+and+cell-free+gene+expression+systems+within+linear+chains+of+emulsion+droplets.">Chemical communication between bacteria and cell-free gene expression systems within linear chains of emulsion droplets.</a> Integrative Biology. 8 (4), 564-570 (2016).</li><li>Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+All+E.+coli+TX-TL+Toolbox+2.0:+A+Platform+for+Cell-Free+Synthetic+Biology.">The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology.</a> ACS Synthetic Biology. 5 (4), 344-355 (2016).</li><li>Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+and+polymersomes:+a+comparative+review+towards+cell+mimicking.">Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking.</a> Chemical Society Reviews. 47 (23), 8572-8610 (2018).</li><li>Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Broccoli Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broccoli:+Rapid+Selection+of+an+RNA+Mimic+of+Green+Fluorescent+Protein+by+Fluorescence-Based+Selection+and+Directed+Evolution.">Broccoli: Rapid Selection of an RNA Mimic of Green Fluorescent Protein by Fluorescence-Based Selection and Directed Evolution.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).</li><li>Zhang, S., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purifying+Plasmid+DNA+from+Bacterial+Colonies+Using+the+Qiagen+Miniprep+Kit.">Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), 247 (2007).</li><li>Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+light+scattering:+a+practical+guide+and+applications+in+biomedical+sciences.">Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences.</a> Biophysical Reviews. 8 (4), 409-427 (2016).</li></ol>

Film rehydrering är ett vanligt förfarande för skapandet av små små blåsor. Den huvudsakliga källan till misslyckande är felhantering av de material som används i förfarandet.

Inledningsvis, den ELPs produceras av E. coli celler. Avkastningen efter ELP rening kan variera avsevärt beroende på hur noggrant protokollet genomförs under dess avgörande steg. Dessa är den inversa temperatur cykling (ITC) steg ...

Skapandet av syntetiska levande cellulära system är oftast närmade sig från två olika riktningar. I uppifrån-och-ner-metoden reduceras genomet hos en bakterie till dess viktiga komponenter, vilket i slutändan leder till en minimal cell. I bottom-up-metoden är konstgjorda celler monterade de Novo från molekylära komponenter eller cellulära delsystem, som måste integreras funktionellt i ett konsekvent cell-liknande system.
I de Novo-metoden uppnås vanligen uppdelning av de nödvändiga biokemiska komponenterna med hjälp av membran tillverkade av fosfolipider eller fettsyror1,2,3,4. Detta beror på att "moderna" cellmembran består huvudsakligen av fosfolipider, medan fettsyror betraktas rimliga kandidater av prebiotiska membran kapslingar5,6. För bildandet av nya membran eller för att underlätta membran tillväxt, amfifila byggstenar måste tillhandahållas från utsidan7 eller helst genom produktion i ett membranös fack med hjälp av motsvarande anabola processer4 ,8.
Medan lipid syntes är en relativt komplex metabolisk process, peptider kan produceras ganska lätt med hjälp av cell-Free genuttryck reaktioner9,10. Därav, peptid membran bildas av amfifila peptider utgör ett intressant alternativ till lipid membran som kapslingar för konstgjorda cell härmar som kan växa11.
Amphiphilic elastin-liknande di-block sampolymerer (ELPs) är en attraktiv klass av peptider, som kan fungera som byggstenen för sådana membran12. Den grundläggande aminosyran sekvens motiv av ELPs är (gagvp)n, där "a" kan vara någon aminosyra utom prolin och "n" är antalet motiv upprepas13,14,15,16,17 . ELPs har skapats med ett hydrofobiskt block som huvudsakligen innehåller fenylalanin för a och ett hydrofila block, huvudsakligen sammansatt av glutaminsyra11. Beroende på a-och lösnings parametrar, såsom pH-och saltkoncentration, uppvisar ELPs en så kallad omvänd temperatur övergång vid temperatur Tt, där peptiderna genomgår en helt reversibel fasövergång från en hydrofilt till hydrofoba Statligt. Syntesen av peptiderna kan enkelt implementeras inuti blåsor med hjälp av "TX-TL" bakteriecell extrakt11,18,19,20,21, som ger alla nödvändiga komponenter för kopplade transkription och översättnings reaktioner.
TX-TL-systemet kapslades ihop, med DNA-mallen kodning av ELPs i ELP blåsor utnyttja uttorkning-rehydrering från glaspärlor som en solid stöd. Bildandet av vesikler sker genom rehydrering av de torkade peptiderna från pärlytan11. Andra metoder22 för vesikelbildning kan användas, som potentiellt visar lägre polydispersitet och större vesikler storlekar (t. ex., Electro-formation, emulsion fas överföring, eller mikrofluidics-baserade metoder). För att testa inkapslings metodens genomförbarhet kan transkription av den fluorogena aptamer dBroccoli23 alternativt användas11, vilket är mindre komplext än genuttryck med TX-TL-systemet.
På grund av uttrycket av membran byggstenarna i vesikulobullösa och deras senare inkorporering i membranet börjar vesiklarna att växa11. Membran inkorporering av ELPs kan påvisas genom en FRET analys. För detta ändamål är de ELPs som används för bildandet av den initiala vesikeln befolkningen konjugeras med fluorescerande färgämnen i lika delar som utgör en FRET par. Vid uttryck av icke-märkta ELPs i vesikulobullösa och deras införlivande i membranet, den märkta ELPs i membranet späds ut och därmed bandet signalen minskar11. Som en mångsidig och gemensam metod för konjugering, koppar katalyseras azid-alkyne cykloaddition används. Med hjälp av en stabiliserande ligand såsom tris (benzyltriazolylmetyl)-Amin, kan reaktionen utföras i en vattenlösning vid ett Fysiologiskt pH utan hydrolys av reaktanter11, vilket är lämpligt för konjugation reaktioner med peptider.
I följande protokoll presenteras en detaljerad beskrivning av förberedelserna för odling av ELP-baserade peptidosomer. Uttrycket av peptider och vesikelbildning med hjälp av glaspärlor metoden beskrivs. Vidare beskrivs hur man genomför transkription av den fluorogena dBroccoli aptamer och transkription-översättning reaktion för proteinuttryck inuti ELP blåsor. Slutligen, förutsatt är ett förfarande för konjugering av ELPs med fluoroforer, som kan användas för att bevisa vesikler tillväxt genom en FRET analys11.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2xYT</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>3012-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-PGA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5PRIME Phase Lock GelTM tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>733-2478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alkine-conjugated Cy3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>777331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alkine-conjugated Cy5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>777358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benzamidin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CN38.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 Rosetta 2 E. coli strain</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>71402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford BSA Protein Assay Kit</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>500-0201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carbenicillin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6344.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloramphenicol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3886.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4432.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>USB</td>
			<td>14121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P024.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DFHBI</td>
			<td>Lucerna Technologies</td>
			<td>410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A994.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9065.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads, acid-washed</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>USB</td>
			<td>16800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (&#946;-isopropyl thiogalactoside )</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P017.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X968.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>82.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>KK36.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg-glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Bio-Spin Chromatography Columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>732-6204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N6522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-azide linker (y-azidobutyric acid oxysuccinimide ester)</td>
			<td>Baseclick</td>
			<td>BCL-033-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-8000</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>263.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH stripes</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>549.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6367.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate-buffered saline</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76180-684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphoric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W290017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethyleneimine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>408727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAPol reaction buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor murine</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0314S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap Wipes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rNTP</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0466S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roti-Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol</td>
			<td>Carlroth</td>
			<td>A156.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTS Amino Acid Sampler</td>
			<td>5 Prime</td>
			<td>2401530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit)</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>66382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9265.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium hydroxide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8655.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile-filtered (0.22 &#181;m filter)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>XH76.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0251S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBTA (tris(benzyltriazolylmethyl)amine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>678937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP (tris(2-carboxyethyl)-phosphine hydrochloride)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>BP1521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA (from E. coli)</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>MRE600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>USB</td>
			<td>23160</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vesiculo synthesis of peptide membrane precursors for autonomous vesicle growth

Compartmentalization av biokemiska reaktioner är en central aspekt av syntetiska celler. För detta ändamål, peptid-baserade reaktions utrymmen fungera som ett attraktivt alternativ till liposomer eller fettsyrabaserade vesikler. Externt eller inom vesiklarna, peptider kan lätt uttryckas och förenkla syntesen av membran prekursorer. Förutsatt att här är ett protokoll för skapandet av blåsor med diametrar på ~ 200 nm baserat på den amfifila elastin-liknande polypeptider (ELP) utnyttjar uttorkning-rehydrering från glaspärlor. Också presenteras är protokoll för bakteriell ELP uttryck och rening via omvänd temperatur Cykling, liksom deras kovalenta funktionalisering med fluorescerande färgämnen. Dessutom beskriver detta betänkande ett protokoll för att möjliggöra transkription av RNA aptamer dbroccoli inuti ELP blåsor som ett mindre komplext exempel för en biokemisk reaktion. Slutligen ges ett protokoll, som gör att vesikulobullösa uttryck för fluorescerande proteiner och membran peptid, medan syntesen av de senare resulterar i vesikler tillväxt.

Vesikelproduktion Bild 1 visar transmissionselektronmikroskopi (TEM)-bilder av blåsor som bereds med olika svällningslösningar och glaspärlor metoden (se även Vogele et al.11). För provet i figur 1aanvändes endast PBS som svällningslösning för att bevisa bildandet av blåsor och för att bestämma deras storlek. När TX-TL användes som svällningslösning (figur 1b), bildade ves...

Watch this Scientific Journal Video about In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth at JoVE.com

In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

I Vesiculo syntes av peptid membran prekursorer för autonoma vesikler tillväxt

Presenteras här är protokoll för skapandet av peptid-baserade små små blåsor som kan växa. För att underlätta i vesikulobullösa produktion av membran peptid, dessa blåsor är utrustade med en transkription-översättningssystem och peptid-kodning plasmid.

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an ...

I vårt protokoll använder vi film åter hydrering från små glaspärlor för att bilda reaktionsfack gjorda av peptider. I experiment drar vi nytta av protokollets enkelhet och robusthet. Den största fördelen med denna teknik är förmågan att införliva även känsliga prover, såsom den använda rå cell extrakt.Kontakt med organiska lösningsmedel kommer att avsevärt påverka provet. För att påbörja detta förfarande, använd en centrifugalvakuumkoncentrator för att koncentrera ELP-lösningen till 1,1 millimolar. Blanda 200 mikroliter av denna koncentrerade lösning med 1, 250 mikroliter av en två till en kloroform och metanolblandning.Vortex lösningen att blanda ordentligt. Därefter lägger du till 1,5 gram sfäriska glaspärlor till en tio milliliter rund bottenkolv. Tillsätt ELP- och kloroformens metanollösning i den runda bottenkolven, och skaka försiktigt för att blanda.Anslut kolven till en rotationsförångare. Justera hastigheten till 150 RPM och reglera trycket till 20, 000 pascal i ungefär fyra minuter, tills vätskan förångas i rumstemperatur. Det är viktigt att vara försiktig när du använder rotationsförångaren på grund av eventuell kokningsförbådning.Efter detta, löst linda aluminiumfolie runt öppningen av den runda bottenkolven för att förhindra förlust av glaspärlor och placera kolven i en exsiccator i minst en timme, för att säkerställa att resterande kloroform och metanol avdunstas. För ett enda experiment, blanda 100 milligram av peptid täckt glas pärlor med 60 mikroliter av en svullnad lösning. Inkubera detta prov vid 25 grader Celsius i fem minuter.Använd en bordsskiva centrifug för att centrifugera proverna snabbt och sediment glaspärlorna. Använd sedan en pipett för att samla supernatanten, som innehåller vesiklarna. Först, blanda 100 mikroliter av den förrennade plasmid DNA med 100 mikroliter av antingen Roti-Fenol, kloroform, eller isoamylalkohol i en mikro centrifug röret för att möjliggöra bättre fasseparering.Försiktigt invertera röret upp till sex gånger och centrifug vid 16, 000 gånger g och rumstemperatur i fem minuter. Tillsätt sedan 200 mikroliter kloroform till den övre fasen, och invertera röret upp till sex gånger. Centrifugera provet vid 16, 000 gånger g och rumstemperatur i fem minuter.Efter detta pipettera supernatanten till ett separat rör och tillsätt 10 mikroliter av tre molarnatriumacetat för etanolutfällning. Tillsätt en milliliter kall etanol vid 80 grader Celsius och förvara provet vid 80 grader Celsius i en timme. Därefter centrifug provet vid 16, 000 gånger g och fyra grader Celsius i 15 minuter.Dekantera supernatanten och tillsätt en milliliter kall 70%etanol vid 20 grader Celsius. Centrifugera vid 16, 000 gånger g och fyra grader Celsius i fem minuter. Ta sedan bort vätskan genom pipettering, var noga med att inte störa DNA-pelleten.Förvara provet i rumstemperatur i cirka 15 minuter för att avdunsta den återstående etanolen. Efter detta, tillsätt ultra rent vatten till provet för att justera provkoncentrationen till cirka 300 nanomolar, vilket mäts genom absorption vid 260 nanometer. För att förbereda transkriptionsöversättningsreaktionen, följ den beredda råcellsutsugen och reaktionsbufferten på is.För en 60 mikroliter reaktion mix, tillsätt plasma DNA till 37,5 mikroliter av reaktionsbufferten, tillsätt 28,7 mikroliter av råcellextrakt och fyll med ultra rent vatten till en slutlig volym av 58,8 mikroliter. Precis innan reaktionen börjar, tillsätt 1,2 mikroliter av T7RNA polymeraslösning, och pipetten upp och ner för att blanda. Inkubera provet och en svullnad lösning vid 29 grader Celsius under hela experimentet, som vanligtvis är fyra till åtta timmar.Transmissionselektronmikroskopibilder av vesiklar visar att olika svullnadslösningar, såsom TX/TL eller till och med bara PBS kan användas för att bilda vesiklar. För båda lösningarna är storleksbestämning ett rakt framåtsteg. Dynamisk ljusspridning visar att vesiklar som bereds utan glaspärlornas metod resulterar i en diameter på 134 nanometer, med en polydispersitet på 25%När glaspärlor används, resulterar diametern i 168 nanometer, med en polydispersitet på 21%Fluorescensintensen hos två fluorescerande proteiner, som uttrycks inuti ELP-vesiklarna, mäts sedan med hjälp av en fluorescensplåtsläsare.Det är viktigt att notera att efter vesikelbildning, innehållet i vesiklarna och den yttre lösningen är desamma, alltså, den antibiotiska Kanamycin läggs till den yttre lösningen för att undertrycka proteinuttryck. Som en kontroll, Kanamycin också läggas till svullnad lösningen, i vilket fall protein uttryck insidan av vesikel är undertryckt. Detta indikerar att Kanamycin inte diffusa genom membranet, och dämpar inre uttryck ständigt, hela tiden.FRET-analysen utförs sedan för att demonstrera ELP-inkorporering i membranet. Vid uttryck av membranet ELPs, ytterligare peptider införliva i membranet, vilket ökar det genomsnittliga avståndet mellan FRET par, och som resulterar i en ökning av givaren signal. Den presenterade tekniken kan användas för att producera enkla reaktionsbehållare eller för att skapa konstgjorda celler med peptidbaserade membran.Innehållet inuti kan väljas efter behov. Genom att använda dessa peptidblåsor kan vi nu se fram emot mer komplexa syntesreaktioner inom dem.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

Axon Stretch Tillväxt: Den Mechanotransduction av neuronala tillväxt

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata ...

Gold Nanostar Synthesis with a Silver Seed Mediated Growth Method

Guld Nanostar Syntes med Silver Seed medierad tillväxthämning Metod

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest ...

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

Odling av mänskliga neurala stamceller i en 3-dimensionell självorganiserande Peptide Hydrogel

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Generation and Recovery of ÃƒÅ½Ã‚Â²-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Generering och återvinning av β-cell sfäroider från steg-tillväxt PEG-peptid Hydrogeler

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Lipiddubbelskiktet Blås Generation Använda Microfluidic Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Analysis of Tubular Membrane Networks in Cardiac Myocytes from Atria and Ventricles

Analys av Tubular Membran Networks i hjärtmuskelceller från förmak och kammare

In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules - the transverse-axial tubule system (TATS) - controls deep intracellular signaling functions. ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Luminiscens Resonance Energy Transfer att studera strukturförändringar i membranproteiner i däggdjursceller

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

Polyelektrolytkomplex för Heparin Binding Domain osteogent Growth Factor Leverans

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Synthesis of Monocyte-targeting Peptide Amphiphile Micelles for Imaging of Atherosclerosis

Syntesen av monocyt-targeting peptid Amphiphile miceller för avbildning av ateroskleros

Atherosclerosis is a major contributor to cardiovascular disease, the leading cause of death worldwide, which claims 17.3 million lives annually. ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

Odling däggdjursceller i tredimensionella peptid ställningar

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...