Name: in vesiculo synthesis of peptide membrane precursors for autonomous vesicle growth
Uploaded: 2019-06-28T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth at JoVE.com

Biz minnetle DFG TRR 235 (yaşam doğuşu, proje P15), Avrupa Araştırma Konseyi (Grant anlaşması No. 694410 AEDNA) ve TUM Uluslararası Enstitüsü bilim ve mühendislik ıGSSE (Proje No. 9,05) aracılığıyla mali destek kabul . Biz örnek hazırlama ile onun yardımı için E. Falgenhauer teşekkür ederiz. TX-TL sistemi ve yararlı tartışmalar konusunda yardım almak için A. Dupin ve M. Schwarz-Schilling ' e teşekkür ederiz. Biz yararlı tartışmalar için N. B. Holland teşekkür ederiz.

1. elastin-benzeri polipeptitlerin ifadesi
<ol><li>1. gün: başlangıç kültürünün hazırlanması ve peptit ifadesi için sarf malzemeleri
	<ol>
<li>Hazırlamak ve otoklav ifade kültürü şişeler (4 x 2,5 l) ve 3 L lb orta. 1 l lb orta için 1 l ultra saf su lb toz 25 gr ekleyin.</li>
		<li>100 ml lb orta, 50 μL steril filtre (0,22 μm filtre) kloramfenikol çözeltisi (EtOH 'da 25 mg/ml) ve 50 μL steril filtreli (0,22 μm filtre) karbenikilin çözeltisi (100 mg/ml,% 50 EtOH ve% 50 ultra saf...

<ol>
	<li>Chen, I. A., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+kinetic+study+of+the+growth+of+fatty+acid+vesicles.">A kinetic study of the growth of fatty acid vesicles.</a> Biophysical Journal. 87 (2), 988-998 (2004).</li><li>Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggered+gene+expression+in+fed-vesicle+microreactors+with+a+multifunctional+membrane.">Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51 (13), 3114-3118 (2012).</li><li>Hardy, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-reproducing+catalyst+drives+repeated+phospholipid+synthesis+and+membrane+growth.">Self-reproducing catalyst drives repeated phospholipid synthesis and membrane growth.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8187-8192 (2015).</li><li>Scott, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Free+Phospholipid+Biosynthesis+by+Gene-Encoded+Enzymes+Reconstituted+in+Liposomes.">Cell-Free Phospholipid Biosynthesis by Gene-Encoded Enzymes Reconstituted in Liposomes.</a> PLoS ONE. 11 (10), e0163058 (2016).</li><li>Deamer, D. W., Barchfeld, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+of+macromolecules+by+lipid+vesicles+under+simulated+prebiotic+conditions.">Encapsulation of macromolecules by lipid vesicles under simulated prebiotic conditions.</a> Journal of Molecular Evolution. 18 (3), 203-206 (1982).</li><li>Adamala, K., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonenzymatic+Template-Directed+RNA+Synthesis+Inside+Model+Protocells.">Nonenzymatic Template-Directed RNA Synthesis Inside Model Protocells.</a> Science. 342 (6162), 1098-1100 (2013).</li><li>Zhu, T. F., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupled+growth+and+division+of+model+protocell+membranes.">Coupled growth and division of model protocell membranes.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (15), 5705-5713 (2009).</li><li>Kurihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-reproduction+of+supramolecular+giant+vesicles+combined+with+the+amplification+of+encapsulated+DNA.">Self-reproduction of supramolecular giant vesicles combined with the amplification of encapsulated DNA.</a> Nature Chemistry. 3 (10), 775-781 (2011).</li><li>Chu, H. -. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+analysis+of+an+elastin-like+polypeptide+(ELP)+in+a+cell-free+protein+synthesis+system.">Expression analysis of an elastin-like polypeptide (ELP) in a cell-free protein synthesis system.</a> Enzyme and Microbial Technology. 46 (2), 87-91 (2010).</li><li>Martino, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Expression,+Aggregation,+and+Triggered+Release+from+Polymersomes+as+Artificial+Cell-like+Structures.">Protein Expression, Aggregation, and Triggered Release from Polymersomes as Artificial Cell-like Structures.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51 (26), 6416-6420 (2012).</li><li>Vogele, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+synthetic+cells+using+peptide-based+reaction+compartments.">Towards synthetic cells using peptide-based reaction compartments.</a> Nature Communications. 9 (1), 3862 (2018).</li><li>Huber, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+amphiphilic+proteins+as+building+blocks+for+the+intracellular+formation+of+organelle-like+compartments.">Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments.</a> Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2014).</li><li>McPherson, D. T., Xu, J., Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Product+purification+by+reversible+phase+transition+following+Escherichia+coli+expression+of+genes+encoding+up+to+251+repeats+of+the+elastomeric+pentapeptide+GVGVP.">Product purification by reversible phase transition following Escherichia coli expression of genes encoding up to 251 repeats of the elastomeric pentapeptide GVGVP.</a> Protein Expression and Purification. 7 (1), 51-57 (1996).</li><li>Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+chemistry+of+biological+free+energy+transduction+as+demonstrated+by+elastic+protein-based+polymers.">Physical chemistry of biological free energy transduction as demonstrated by elastic protein-based polymers.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 101 (51), 11007-11028 (1997).</li><li>Urry, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin:+a+representative+ideal+protein+elastomer.">Elastin: a representative ideal protein elastomer.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 357 (1418), 169-184 (2002).</li><li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+recombinant+proteins+by+fusion+with+thermally-responsive+polypeptides.">Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides.</a> Nature Biotechnology. 17 (11), 1112-1115 (1999).</li><li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+synthesis+of+protein-based+polymers+with+precisely+specified+molecular+weight+and+sequence+by+recursive+directional+ligation:+examples+from+the+elastin-like+polypeptide+system.">Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system.</a> Biomacromolecules. 3 (2), 357-367 (2002).</li><li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology.">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).</li><li>Caschera, F., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+2.3+mg/ml+of+protein+with+an+all+Escherichia+coli+cell-free+transcription-translation+system.">Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system.</a> Biochimie. 99, 162-168 (2014).</li><li>Schwarz-Schilling, M., Aufinger, L., M&#252;ckl, A., Simmel, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+communication+between+bacteria+and+cell-free+gene+expression+systems+within+linear+chains+of+emulsion+droplets.">Chemical communication between bacteria and cell-free gene expression systems within linear chains of emulsion droplets.</a> Integrative Biology. 8 (4), 564-570 (2016).</li><li>Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+All+E.+coli+TX-TL+Toolbox+2.0:+A+Platform+for+Cell-Free+Synthetic+Biology.">The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology.</a> ACS Synthetic Biology. 5 (4), 344-355 (2016).</li><li>Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+and+polymersomes:+a+comparative+review+towards+cell+mimicking.">Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking.</a> Chemical Society Reviews. 47 (23), 8572-8610 (2018).</li><li>Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Broccoli Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broccoli:+Rapid+Selection+of+an+RNA+Mimic+of+Green+Fluorescent+Protein+by+Fluorescence-Based+Selection+and+Directed+Evolution.">Broccoli: Rapid Selection of an RNA Mimic of Green Fluorescent Protein by Fluorescence-Based Selection and Directed Evolution.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).</li><li>Zhang, S., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purifying+Plasmid+DNA+from+Bacterial+Colonies+Using+the+Qiagen+Miniprep+Kit.">Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), 247 (2007).</li><li>Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+light+scattering:+a+practical+guide+and+applications+in+biomedical+sciences.">Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences.</a> Biophysical Reviews. 8 (4), 409-427 (2016).</li></ol>

Film rehidrasyon Küçük unilamellar veziküller oluşturulması için ortak bir işlemdir. Başarısızlık ana kaynağı prosedürde kullanılan malzemelerin yanlış işleme olduğunu.

Başlangıçta, ELPs E. coli hücreleri tarafından üretilmektedir. ELP arıtma sonrası verim önemli adımlarla protokolün ne kadar dikkatle gerçekleştirileceğinden bağlı olarak farklılık gösterebilir. Bunlar ters sıcak...

Sentetik canlı hücresel sistemlerin oluşturulması genellikle iki farklı yöne yaklaştı. Yukarıdan aşağı yöntemle, bir bakterinin genomu temel bileşenlerine düşer, sonuçta minimal bir hücreye yol açılır. Aşağıdan yukarı yaklaşımda, yapay hücreler, fonksiyonel olarak tutarlı bir hücre benzeri sisteme entegre edilmesi gereken moleküler bileşenlerden veya hücresel alt sistemlerinden de Novo monte edilir.
De Novo yaklaşımı, gerekli biyokimyasal bileşenlerin bölümlendirme genellikle fosfolipidler veya yağ asitleri1,2,3,4yapılan membranların kullanılarak elde edilir. Çünkü "modern" hücre membranlarının ağırlıklı olarak fosfolipidler oluşur, yağ asitleri prebiyotik membran muhafazaları makul adaylar kabul edilir ise5,6. Yeni membranların oluşumu veya membran büyümesini kolaylaştırmak için, amphiphilik yapı taşları dış7 veya ideal bir membranlı bölme içinde üretim ile ilgili anabolik süreçleri kullanarak sağlanmalıdır4 ,8.
Lipid sentezi nispeten karmaşık bir metabolik süreçtir iken, peptidler hücre içermeyen gen ifade reaksiyonları kullanarak oldukça kolay üretilebilmektedir9,10. Bu nedenle, amphiphilik peptidler tarafından oluşturulan peptid membranların büyüme edebiliyoruz yapay hücre taklit için muhafazaları olarak lipid membranlara ilginç bir alternatif temsil11.
Amphiphilik elastin-gibi di-blok kopolimerler (ELPs) peptidler, bu tür membranların için yapı taşı olarak hizmet verebilir çekici bir sınıftır12. ELPS temel amino asit sırası motif (gagvp)n, burada "a" prolin ve "n" dışında herhangi bir amino asit olabilir motifi tekrarı sayısı13,14,15,16,17 . ELPs esas olarak glutamik asit11oluşan bir hidrofilik blok ve ağırlıklı olarak fenilalanin içeren bir hidrofobik blok ile oluşturulmuştur. PH ve tuz konsantrasyonu gibi bir ve çözüm parametrelerine bağlı olarak, ELPS sıcaklık tt'de sözde ters sıcaklık geçişi sergiler, peptidler hidrofilik bir hidrofobik tamamen geri dönüşümlü faz geçişi geçmesi Durum. Peptidler sentezini kullanarak veziküller içinde kolayca uygulanabilir "TX-TL" bakteriyel hücre ekstresi11,18,19,20,21, hangi sağlar birleştirilmiş transkripsiyon ve çeviri reaksiyonları için gerekli tüm bileşenleri.
TX-TL sistemi birlikte kapsüllenmiş, DNA şablonu ile ELP 'Ler, cam boncuklardan su kaybı-rehidrasyon kullanan ELPS veziküllerine sağlam bir destek olarak kodlanıyor. Veziküllerin oluşumu, boncuk yüzeyinden kuru peptitlerin rehidrasyon yoluyla oluşur11. Vezikül oluşumu için22 diğer yöntemler, potansiyel olarak daha düşük polydispersity ve daha büyük vezikül boyutlarını (örn. Elektro-oluşum, emülsiyon faz transferi veya mikrofluidik tabanlı Yöntemler) gösterebilir. Kapsülleme yönteminin canlığını sınamak için, fluorogenic aptamer dBroccoli23 ' ün TRANSKRIPSIYONU, TX-TL sistemi ile gen ifadesinden daha az karmaşık olan11' i alternatif olarak kullanılabilir.
Vesiculo membran yapı taşları ve membran içine daha sonra birleşmesi ifadesi nedeniyle, veziküller büyümeye başlar11. ELPs membran birleşme bir FRET tahlil aracılığıyla gösterilebilir. Bu amaçla, ilk vezikül nüfusun oluşumu için kullanılan ELPs bir FRET çifti oluşturan eşit hisseler floresan boyalar ile konjuated edilmelidir. Vesiculo 'da etiketli olmayan ELPs 'in ve membranın içine birleşmesi üzerine, membran içinde etiketli ELPs seyreltilir ve dolayısıyla FRET sinyali11' i düşürür. Konjugasyon için çok yönlü ve ortak bir yöntem olarak, bakır katalizlü Azide-alkyne halkakatılma kullanılır. Tris (benzyltriazolylmethyl)-Amin gibi bir stabilizasyon ligand kullanımı ile, reaksiyon reaksiyonlarının hidroliz olmadan bir fizyolojik pH 'da sulu bir çözelti yapılabilir11, hangi konjugasyon reaksiyonlar için uygun olan peptidler dahil.
Aşağıdaki protokol büyüyen ELP tabanlı peptidosomes için hazırlık ayrıntılı bir açıklamasını sunar. Cam boncuk metodunu kullanarak peptidler ve vezikül oluşumunun ifadesi açıklanmıştır. Ayrıca, flororojenik dBroccoli aptamer ve ELP veziküller içinde protein ifadesi için transkripsiyon-çeviri reaksiyonu transkripsiyon nasıl uygulanacağı açıklanmıştır. Son olarak, sağlanan bir FRET tahlil ile vezikül büyümesini kanıtlamak için kullanılabilecek fluorophores ile ELPs konjugasyon için bir işlemdir11.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2xYT</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>3012-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-PGA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5PRIME Phase Lock GelTM tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>733-2478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alkine-conjugated Cy3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>777331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alkine-conjugated Cy5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>777358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benzamidin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CN38.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 Rosetta 2 E. coli strain</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>71402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford BSA Protein Assay Kit</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>500-0201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carbenicillin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6344.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloramphenicol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3886.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4432.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>USB</td>
			<td>14121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P024.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DFHBI</td>
			<td>Lucerna Technologies</td>
			<td>410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A994.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9065.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads, acid-washed</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>USB</td>
			<td>16800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (&#946;-isopropyl thiogalactoside )</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P017.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X968.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>82.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>KK36.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg-glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Bio-Spin Chromatography Columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>732-6204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N6522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-azide linker (y-azidobutyric acid oxysuccinimide ester)</td>
			<td>Baseclick</td>
			<td>BCL-033-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-8000</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>263.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH stripes</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>549.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6367.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate-buffered saline</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76180-684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphoric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W290017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethyleneimine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>408727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAPol reaction buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor murine</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0314S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap Wipes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rNTP</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0466S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roti-Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol</td>
			<td>Carlroth</td>
			<td>A156.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTS Amino Acid Sampler</td>
			<td>5 Prime</td>
			<td>2401530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit)</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>66382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9265.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium hydroxide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8655.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile-filtered (0.22 &#181;m filter)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>XH76.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0251S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBTA (tris(benzyltriazolylmethyl)amine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>678937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP (tris(2-carboxyethyl)-phosphine hydrochloride)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>BP1521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA (from E. coli)</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>MRE600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>USB</td>
			<td>23160</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vesiculo synthesis of peptide membrane precursors for autonomous vesicle growth

Biyokimyasal reaksiyonlar bölümlendirme sentetik hücrelerin merkezi bir yönüdür. Bu amaçla, peptid tabanlı reaksiyon bölmeleri lipozomlar veya yağlı asit bazlı veziküller için cazip bir alternatif olarak hizmet vermektedir. Dıştan veya veziküller içinde, peptidler kolayca ifade ve membran öncüleri sentezini basitleştirebilirsiniz. Burada sağlanan, cam boncuklardan su kaybı-rehidrasyon kullanan amphiphilik elastin benzeri polipeptidler (ELP) temelinde ~ 200 Nm çapları ile veziküllerin oluşturulması için bir protokoldür. Ayrıca sunulan bakteriyel ELP ifadesi ve ters sıcaklık Bisiklet yoluyla arıtma için protokoller, hem de floresan boyalar ile onların kovalent functionalization. Ayrıca, bu raporda bir biyokimyasal reaksiyon için daha az karmaşık bir örnek olarak ELP veziküller içinde RNA aptamer dBroccoli transkripsiyon etkinleştirmek için bir protokol açıklanmaktadır. Son olarak, bir protokol sağlanır, hangi floratik proteinleri ve membran peptid vesiculo ifadesinde sağlar, vezikül büyüme ikincisi sonucu sentezinde ise.

Vezikül üretimi Şekil 1 , farklı şişme çözeltileri ve cam boncuk yöntemiyle hazırlanan veziküllerin iletim elektron MIKROSKOBU (Tem) görüntülerini gösterir (Ayrıca bakınız VOGELE ve al.11). Şekil 1a'da örnek için sadece PBS, veziküller oluşumunu kanıtlamak ve boyutlarını belirlemek için şişlik çözeltisi olarak kullanılmıştır. TX-TL şişme çözeltisi olarak kullanıldığında (<stro...

Watch this Scientific Journal Video about In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth at JoVE.com

In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

Vesiculo 'da otonom vezikül büyümesi için peptid membran öncülerinin sentezini

Burada sunulan peptid tabanlı Küçük unilamellar veziküller büyüme yeteneğine oluşturulması için protokoller vardır. Membran peptid vesiculo üretiminde kolaylaştırmak için, bu veziküller bir transkripsiyon-çeviri sistemi ve peptid-kodlama Plasmid ile donatılmıştır.

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an ...

Protokolümüzde, peptitlerden yapılmış reaksiyon bölmeleri oluşturmak için küçük cam boncuklardan film yeniden hidrasyon uyguluyoruz. Deneylerde, protokolün basitliğinden ve sağlamlığından faydalanıyoruz. Bu tekniğin en büyük avantajı, kullanılan ham hücre özü gibi hassas numuneleri bile dahil edebilme yeteneğidir.Organik çözücülerle temas numuneyi önemli ölçüde etkileyecektir. Bu prosedüre başlamak için, ELP çözeltisini 1.1 milimolara yoğunlaştırmak için santrifüj vakum konsantratörü kullanın. Bu konsantre çözeltinin 200 mikrolitresini 2-1 kloroform ve metanol karışımının 1,250 mikrolitresini karıştırın.Girdap çözeltisi iyice karıştırmak için. Sonra, on mililitrelik yuvarlak alt şişe ye 1,5 gram küresel cam boncuk ekleyin. Yuvarlak alt şişeye ELP ve kloroform metanol çözeltisi ekleyin ve yavaşça karıştırmak için sallayın.Şişeyi döner buharlaştırıcıya bağlayın. Hızı 150 RPM'ye ayarlayın ve sıvı oda sıcaklığında buharlaşana kadar basıncı yaklaşık dört dakika boyunca 20.000 pascal'a ayarlayın. Olası kaynama geriliği nedeniyle döner evaporatör kullanırken dikkatli olmak önemlidir.Bundan sonra, gevşek cam boncuk kaybını önlemek için yuvarlak alt şişe nin açılması etrafında alüminyum folyo sarın ve kalan kloroform ve metanol buharlaşır sağlamak için, en az bir saat boyunca bir kurutucu içine şişe yerleştirin. Tek bir deney için, 100 miligram peptid kaplı cam boncukları 60 mikrolitre şişme çözeltisi ile karıştırın. Bu numuneyi 25 derecede beş dakika kuluçkaya yatırın.Örnekleri hızlı bir şekilde santrifüj ve cam boncuk tortu için bir masa üstü santrifüj kullanın. Sonra veziküller içeren supernatant, toplamak için bir pipet kullanın. İlk olarak, daha iyi faz ayrımı sağlamak için bir mikro santrifüj tüp içinde roti-Fenol, kloroform veya izoamyl alkol 100 mikrolitre ile önceden saflaştırılmış plazmid DNA 100 mikrolitre karıştırın.Tüpü altı kez hafifçe ters çevirin ve 16,000 kez g ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca santrifüj edin. Daha sonra, üst faza 200 mikrolitre kloroform ekleyin ve tüpü altı kez ters çevirin. Numuneyi 16,000 kez g ve oda sıcaklığında beş dakika santrifüj edin.Bundan sonra, pipet ayrı bir tüp için supernatant ve etanol yağış için üç molar sodyum asetat 10 mikrolitre ekleyin. 80 santigrat derecede bir mililitre soğuk etanol ekleyin ve numuneyi 80 derecede bir saat saklayın. Sonra, 16, 000 kez g ve 15 dakika boyunca dört derece santigrat örnek santrifüj.Supernatant decant ve 20 santigrat derece soğuk% 70 etanol bir mililitre ekleyin. Santrifüj 16, 000 kez g ve dört santigrat derece beş dakika. Daha sonra, DNA peletrahatsız değil dikkatli olmak, pipetleme ile sıvı çıkarın.Kalan etanol buharlaştırmak için yaklaşık 15 dakika oda sıcaklığında örnek saklayın. Bundan sonra, numune konsantrasyonunu 260 nanometrede emilim le ölçülen yaklaşık 300 nanomolar'a ayarlamak için numuneye ultra saf su ekleyin. Transkripsiyon-çeviri reaksiyonu hazırlamak için, hazırlanan ham hücre ekstraksiyonu ve buz üzerindeki reaksiyon tamponu izleyin.60 mikrolitrelik reaksiyon karışımı için plazma DNA'sını reaksiyon tamponunun 37,5 mikrolitresine ekleyin, 28,7 mikrolitre ham hücre ekstresi ekleyin ve ultra saf suyla 58,8 mikrolitrelik son hacmi doldurun. Reaksiyon başlamadan hemen önce, T7RNA polimeraz çözeltisinin 1,2 mikrolitresini ekleyin ve pipetleri yukarı ve aşağı karıştırın. Deney süresince numuneyi ve şişlik çözeltisini 29 santigrat derecede kuluçkaya yatırın, bu da genellikle dört ila sekiz saattir.Veziküllerin iletim elektron mikroskobu görüntüleri, TX/TL ve hatta sadece PBS gibi çeşitli şişme solüsyonlarının vezikül oluşturmak için kullanılabileceğini göstermektedir. Her iki çözüm için de boyut belirleme düz bir adımdır. Dinamik ışık saçılımı, cam boncuk yöntemi olmadan hazırlanan veziküllerin 134 nanometre çapında sonuç verdiğini, cam boncuklar kullanıldığında %25'lik bir polidağılım la sonuçverdiğini, çapın %21'lik bir polidispersite sahip iki floresan proteinin floresan şiddeti ile ELP vezikülleri içinde ölçüldüğünde floresan plaka okuyucu kullanılarak ölçülür.Vezikül oluşumundan sonra veziküllerin içeriği ve dış solüsyonun aynı olduğunu, bu nedenle protein ekspresyonunu bastırmak için kanamisin antibiyotiğinin dış solüsyona eklenmediğini belirtmek önemlidir. Bir kontrol olarak, Kanamisin de şişme çözeltisi eklenir, bu durumda vezikül içinde protein ifadesi bastırılır. Bu Kanamisin membran yoluyla diffüz olmadığını gösterir, ve sürekli iç ekspresyon bastırır, her zaman.FRET tnes sonra membran içine ELP dahil göstermek için yapılır. Membran ELP'lerinin ekspresyonu üzerine, ek peptidler membrana dahil edilmiştir, bu da FRET çiftleri arasındaki ortalama mesafeyi arttırır ve bu da donör sinyalinin artmasına neden olarak sonuçlanır. Sunulan teknik basit reaksiyon kapları üretmek veya peptid bazlı membranlar ile yapay hücreler oluşturmak için kullanılabilir.İçerideki içerik gerektiği gibi seçilebilir. Bu peptit vezikülleri kullanarak, şimdi içlerinde daha karmaşık sentez reaksiyonları üzerinde ileriye bakabilirsiniz.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

Akson Streç Büyüme: Nöronal Büyüme Mechanotransduction

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata ...

Gold Nanostar Synthesis with a Silver Seed Mediated Growth Method

Gümüş Tohum aracılığı Büyüme Yöntemi ile Altın Nanostar Sentezi

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest ...

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

3 boyutlu montaj Self-Peptid Hidrojel İnsan Sinir Progenitör Hücreler Yetiştiriciliği

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Generation and Recovery of ÃƒÅ½Ã‚Â²-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Adım büyüme PEG-peptid Hidrojeller kaynaktan β-hücre sferoidlerin Üretimi ve Kurtarma

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Mikroakışkan jeti kullanarak çift katlı lipid Vesikül Üretimi

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Analysis of Tubular Membrane Networks in Cardiac Myocytes from Atria and Ventricles

Kulakçık ve karıncığa gelen kardiyak miyozitlerde Boru Membran Ağlarının Analizi

In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules - the transverse-axial tubule system (TATS) - controls deep intracellular signaling functions. ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Lüminesans Rezonans Enerji memeli hücrelerinde ifade Membran Proteinleri Konformasyonel Değişiklikleri Eğitim transfer

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

Heparin Binding Domain osteojenik Büyüme Faktörü Teslim polielektrolit Kompleksi

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Synthesis of Monocyte-targeting Peptide Amphiphile Micelles for Imaging of Atherosclerosis

Monosit hedefleme peptid Amfifil Micelles için düşsel ateroskleroz sentezi

Atherosclerosis is a major contributor to cardiovascular disease, the leading cause of death worldwide, which claims 17.3 million lives annually. ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

Üç boyutlu peptid iskele memeli hücrelerinde kültür

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...