Name: cultivation of the marine pelagic tunicate dolioletta gegenbauri (uljanin 1884) for experimental studies
Uploaded: 2019-08-09T14:30:00
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Agradecemos às muitas pessoas que contribuíram com o conhecimento acumulado para este projeto ao longo dos anos, incluindo a G.-A. Paffenhöfer e D. Deibel que desenvolveram originalmente estes protocolos. M. Köster, e L. Lamboley também contribuíram significativamente para o desenvolvimento desses procedimentos.  N.B. López-Figueroa e Á.ee Rodríguez-Santiago geraram as estimativas de abundância de doliolid fornecidas na tabela 1. Este estudo foi apoiado em parte pela Fundação Nacional de ciência dos EUA concede OCE 082599, 1031263 para MEF, projetos colaborativos OCE 1459293 e OCE 14595010 para MEF e DMG e, o Prêmio Nacional de administração oceânica e atmosférica NA16SEC4810007 a DMG. Somos gratos à equipe trabalhadora e profissional do R/V Savannah. Lee Ann DeLeo preparou as figuras, Charles Y. Robertson revisou o manuscrito e, James (Jimmy) Williams fabricou a roda de plâncton

1. preparação de instalações de cultivo para a criação de D. gegenbauri
Nota: todos os materiais e equipamentos exigidos estão listados na tabela de materiais.
<ol><li>Prepare 1 M de hidróxido de sódio (NaOH), 0, 6 M de permanganato de potássio (KMnO4) solução. Para preparar esta solução, dissolva 400 g de NaOH em 10 L de água desionizada. Adicione 100 g de KMnO4 à solução de NaOH e misture bem.</li>
	<li>Prepare uma solução...

<ol>
	<li>Banse, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zooplankton+&#8211;+Pivotal+role+in+the+control+of+ocean+production.">Zooplankton &#8211; Pivotal role in the control of ocean production.</a> Ices Journal of Marine Science. 52 (3-4), 265-277 (1995).</li><li>Wilson, S. E., Ruhl, H. A., Smith, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zooplankton+fecal+pellet+flux+in+the+abyssal+northeast+Pacific:+A+15+year+time-series+study.">Zooplankton fecal pellet flux in the abyssal northeast Pacific: A 15 year time-series study.</a> Limnology and Oceanography. 58 (3), 881-892 (2013).</li><li>Bode, A., &#193;lvarez-Ossorio, M. T., Miranda, A., Ruiz-Villarreal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shifts+between+gelatinous+and+crustacean+plankton+in+a+coastal+upwelling+region.">Shifts between gelatinous and crustacean plankton in a coastal upwelling region.</a> Ices Journal of Marine Science. 70 (5), 934-942 (2013).</li><li>Kiorboe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zooplankton+body+composition.">Zooplankton body composition.</a> Limnology and Oceanography. 58 (5), 1843-1850 (2013).</li><li>Holland, L. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunicates.">Tunicates.</a> Current Biology. 26 (4), R146-R152 (2016).</li><li>Walters, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet+and+trophic+interactions+of+a+circumglobally+significant+gelatinous+marine+zooplankter,+Dolioletta+gegenbauri+(Uljanin,+1884).">Diet and trophic interactions of a circumglobally significant gelatinous marine zooplankter, Dolioletta gegenbauri (Uljanin, 1884).</a> Molecular Ecology. , (2018).</li><li>Piette, J., Lemaire, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thaliaceans,+the+neglected+pelagic+relatives+of+ascidians:+a+developmental+and+evolutionay+enigma.">Thaliaceans, the neglected pelagic relatives of ascidians: a developmental and evolutionay enigma.</a> Quarterly Review of Biology. 90 (2), 117-145 (2015).</li><li>Acu&#241;a, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pelagic+tunicates:+Why+gelatinous?.">Pelagic tunicates: Why gelatinous?.</a> American Naturalist. 158 (1), 100-107 (2001).</li><li>Alldredge, A. L., Madin, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pelagic+tunicates+&#8211;+unique+herivores+in+the+marine+plankton.">Pelagic tunicates &#8211; unique herivores in the marine plankton.</a> Bioscience. 32 (8), 655-663 (1982).</li><li>Wada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+history+of+free-swimming+and+sessile+lifestyles+in+urochordates+as+deduced+from+18S+rDNA+molecular+phylogeny.">Evolutionary history of free-swimming and sessile lifestyles in urochordates as deduced from 18S rDNA molecular phylogeny.</a> Molecular Biology and Evolution. 15 (9), 1189-1194 (1998).</li><li>Zeng, L. Y., Jacobs, M. W., Swalla, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coloniality+has+evolved+once+in+stolidobranch+ascidians.">Coloniality has evolved once in stolidobranch ascidians.</a> Integrative and Comparative Biology. 46 (3), 255-268 (2006).</li><li>Delsuc, F., Brinkmann, H., Chourrout, D., Philippe, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunicates+and+not+cephalochordates+are+the+closest+living+relatives+of+vertebrates.">Tunicates and not cephalochordates are the closest living relatives of vertebrates.</a> Nature. 439 (7079), 965-968 (2006).</li><li>Garstang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphology+of+the+Tunicata,+and+its+bearing+on+the+phylogeny+of+the+chordata.">The morphology of the Tunicata, and its bearing on the phylogeny of the chordata.</a> Quarterly Journal of Microscopical Science. 72 (285), 51-187 (1929).</li><li>Govindarajan, A. F., Bucklin, A., Madin, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+phylogeny+of+the+Thaliacea.">A molecular phylogeny of the Thaliacea.</a> Journal of Plankton Research. 33 (6), 843-853 (2011).</li><li>Godeaux, D., Bone, Q., Braconnot, J. C., Bone, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Biology of Pelagic Tunicates. , 1-24 (1998).</li><li>Deibel, D., Lowen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+life+cycles+and+life-history+adaptations+of+pelagic+tunicates+to+environmental+conditions).">A review of the life cycles and life-history adaptations of pelagic tunicates to environmental conditions).</a> Ices Journal of Marine Science. 69 (3), 358369 (2012).</li><li>Paffenh&#246;fer, G., K&#246;ster, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+one+to+many:+on+the+life+cycle+of+Dolioletta+gegenbauri+Uljanin+(Tunicata,+Thaliacea).">From one to many: on the life cycle of Dolioletta gegenbauri Uljanin (Tunicata, Thaliacea).</a> Journal of Plankton Research. 33 (7), 1139-1145 (2011).</li><li>Paffenh&#246;fer, G. A., Gibson, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+generation+time+and+asexual+fecundity+of+doliolids+(Tunicata,+Thaliacea).">Determination of generation time and asexual fecundity of doliolids (Tunicata, Thaliacea).</a> Journal of Plankton Research. 21 (6), 1183-1189 (1999).</li><li>Conley, K. R., Lombard, F., Sutherland, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammoth+grazers+on+the+ocean's+minuteness:+a+review+of+selective+feeding+using+mucous+meshes.">Mammoth grazers on the ocean's minuteness: a review of selective feeding using mucous meshes.</a> Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 285 (1878), (2018).</li><li>Bouquet, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+optimization+for+the+emergent+zooplanktonic+model+organism+Oikopleura+dioica.">Culture optimization for the emergent zooplanktonic model organism Oikopleura dioica.</a> Journal of Plankton Research. 31 (4), 359370 (2009).</li><li>Denoeud, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+Animal+Genome+Architecture+Unmasked+by+Rapid+Evolution+of+a+Pelagic+Tunicate.">Plasticity of Animal Genome Architecture Unmasked by Rapid Evolution of a Pelagic Tunicate.</a> Science. 330 (6009), 1381-1385 (2010).</li><li>Harrison, P. J., Waters, R. E., Taylor, F. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+broad-spectrum+artificial+seawater+medium+for+coastal+and+open+ocean+phytoplankton.">A broad-spectrum artificial seawater medium for coastal and open ocean phytoplankton.</a> Journal of Phycology. 16 (1), 2835 (1980).</li><li>Ohman, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zooglider:+An+autonomous+vehicle+for+optical+and+acoustic+sensing+of+zooplankton.">Zooglider: An autonomous vehicle for optical and acoustic sensing of zooplankton.</a> Limnology and Oceanography-Methods. 17 (1), 69-86 (2019).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+observations+of+a+doliolid+bloom+in+a+warm+water+filament+using+a+video+plankton+recorder:+Bloom+development,+fate,+and+effect+on+biogeochemical+cycles+and+planktonic+food+webs.">In situ observations of a doliolid bloom in a warm water filament using a video plankton recorder: Bloom development, fate, and effect on biogeochemical cycles and planktonic food webs.</a> Limnology and Oceanography. 60 (5), 1763-1780 (2015).</li><li>Deibel, D., Bone, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The biology of pelagic tunicates. , 171-186 (1998).</li><li>Gibson, D. M., Paffenh&#246;fer, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeding+and+growth+rates+of+the+doliolid,+Dolioletta+gegenbauri+Uljanin+(Tunicata,+Thaliacea).">Feeding and growth rates of the doliolid, Dolioletta gegenbauri Uljanin (Tunicata, Thaliacea).</a> Journal of Plankton Research. 22 (8), 1485-1500 (2000).</li><li>Haskell, A., Hofmann, E., Paffenh&#246;fer, G., Verity, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+effects+of+doliolids+on+the+plankton+community+structure+of+the+southeastern+US+continental+shelf.">Modeling the effects of doliolids on the plankton community structure of the southeastern US continental shelf.</a> Journal of Plankton Research. 21 (9), 1725-1752 (1999).</li><li>Gibson, D. M., Paffenh&#246;ffer, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asexual+reproduction+of+the+doliolid,+Dolioletta+gegenbauri+Uljanin+(Tunicata,+Thaliacea).">Asexual reproduction of the doliolid, Dolioletta gegenbauri Uljanin (Tunicata, Thaliacea).</a> Journal of Plankton Research. 24 (7), 703-712 (2002).</li><li>Frischer, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+of+qPCR+for+quantitative+gut+content+estimation+in+the+circumglobally+abundant+pelagic+tunicate+Dolioletta+gegenbauri+(Tunicata,+Thaliacea).">Reliability of qPCR for quantitative gut content estimation in the circumglobally abundant pelagic tunicate Dolioletta gegenbauri (Tunicata, Thaliacea).</a> Food Webs. 1, 7 (2014).</li><li>K&#246;ster, M., Paffenh&#246;fer, G., Baker, C., Williams, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+consumption+of+doliolids+(Tunicata,+Thaliacea).">Oxygen consumption of doliolids (Tunicata, Thaliacea).</a> Journal of Plankton Research. 32 (2), 171-180 (2010).</li><li>Paffenh&#246;fer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hypothesis+on+the+fate+of+blooms+of+doliolids+(Tunicata,+Thaliacea).">A hypothesis on the fate of blooms of doliolids (Tunicata, Thaliacea).</a> Journal of Plankton Research. 35 (4), 919-924 (2013).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sapphirinid+copepods+as+predators+of+doliolids:+Their+role+in+doliolid+mortality+and+sinking+flux.">Sapphirinid copepods as predators of doliolids: Their role in doliolid mortality and sinking flux.</a> Limnology and Oceanography. 58 (6), 1972-1984 (2013).</li><li>Mart&#237;-Solans, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oikopleura+dioica+Culturing+Made+Easy:+A+Low-Cost+Facility+for+an+Emerging+Animal+Model+in+EvoDevo.">Oikopleura dioica Culturing Made Easy: A Low-Cost Facility for an Emerging Animal Model in EvoDevo.</a> Genesis. 53 (1), 183-193 (2015).</li><li>Nishida, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+appendicularian+Oikopleura+dioica:+Culture,+genome,+and+cell+lineages.">Development of the appendicularian Oikopleura dioica: Culture, genome, and cell lineages.</a> Development Growth &amp; Differentiation. 50, S239-S256 (2008).</li></ol>

A capacidade de cultura os tem sido estabelecida ao longo das últimas décadas e tem sido utilizada para apoiar a investigação em várias áreas. Estudos experimentais em nossos laboratórios têm apoiado a publicação de pelo menos 15 estudos científicos focados na alimentação e crescimento18,26, reprodução18,28, dieta6, 29, fisiologia<...

Zooplâncton conta para a maior biomassa animal no oceano, são componentes-chave em Webs de alimentos marinhos, e desempenham papéis importantes no oceano biogeoquímica ciclos1,2. O zooplâncton, embora constituído por uma enorme diversidade de organismos, pode ser distinguido grosseiramente em duas categorias: gelatinosa e não-gelatinosa com poucos táxons intermediários3,4. Comparado com o zooplâncton não-gelatinoso, o zooplâncton gelatinoso é especialmente difícil de estudar por causa de suas complexas histórias de vida5, e seus tecidos delicados são facilmente danificados durante a captura e manuseio. As espécies de zooplâncton gelatinosas são, portanto, notoriamente difíceis de cultura em laboratório e geralmente menos estudadas em comparação com espécies não gelatinosas6.
Entre os grupos gelatinosos do zooplâncton, um abundante e de importância ecológica no oceano do mundo são os Thaliaceans. Thaliaceans são uma classe de tunicados pelágicos que incluem as ordens salpida, pyrosomida, e doliolida7. Doliolida, coletivamente referidos como doliolids, são pequenos organismos pelágicos livres de natação em forma de barril que podem atingir altas abundâncias em regiões nerióticas produtivas de oceanos subtropicais. Doliolids estão entre os mais abundantes de todos os grupos zooplâncton4,8. Como alimentadores de suspensão, os os coletam partículas de alimento da coluna de água criando correntes filtrantes e capturando-as em redes de muco9. Taxonomicamente, os os são classificados no filo Urochordata10. Ancestral dos chordates, e além de seu significado ecológico como componentes-chave dos sistemas marinhos pelágicos, os Taliaceanos são de importância para a compreensão das origens da história da vida colonial10,11e da evolução dos Cordados5,7,10,12,13,14.
A história de vida dos os é complexa e contribui para a dificuldade em cultivá-los e sustentá-los através do seu ciclo de vida. Uma revisão do ciclo de vida e da anatomia do doliolid pode ser encontrada em Godeaux et al.15. O ciclo de vida doliolid, que envolve uma alternância obrigatória entre estágios sexuais e assexuais da história da vida, é apresentado na Figura 1. Os ovos e o esperma são produzidos pelos gonozooids hermafroditas, o único estágio solitário do ciclo de vida. Gonozooids liberar esperma para a coluna de água e os ovos são fertilizados internamente e liberados para se desenvolverem em larvas. Larvas eclodir e metamorfose em oozooids que podem chegar a 1-2 mm. presumindo condições ambientais propícias e nutrição, oozooids tornam-se enfermeiros precoces dentro de 1-2 dias a 20 ° c e iniciam as fases coloniais do ciclo de vida. Oozooids produzem brotos assexualmente em seu stolon ventral. Estes botões deixam o estolão e migram para o cadóforo dorsal onde se alinham em três fileiras emparelhadas. As fileiras dobro centrais transformam-se designados e as duas fileiras dobro exteriores transformam-se trophozooids. Estes últimos fornecem alimentos tanto para o enfermeiro quanto para os designados16,17. Os trophozooids fornecem a enfermeira a nutrição enquanto perde todos os órgãos internos. Como a abundância de trophozooids aumenta, o tamanho do enfermeiro pode chegar a 15 mm no laboratório. À medida que os designados crescem, cada vez mais ingerem presas planktónicas e atingem ~ 1,5 mm de tamanho antes de serem liberados como indivíduos17. Uma única enfermeira pode liberar > 100 designados durante sua vida útil18. Depois que os designados são liberados do cadophore, continuam a crescer e são a segunda etapa colonial do ciclo de vida. Uma vez que alcangam ~ 5 milímetros no tamanho, cada phorozooid desenvolve um conjunto de gonozóoides em seu pedúnculo ventral. Estes gonozooides podem ingerir partículas quando atingem ~ 1 mm de comprimento. Depois que os gonozóoides alcangaram ~ 2 a 3 milímetros no tamanho são liberados do phorozooid e transformam-se o único estágio solitário do ciclo de vida. Uma vez que alcançam ~ 6 milímetros no tamanho, os gonozóoides tornam-se sexualmente maduros17. Gonozooids pode atingir 9 mm ou maior de comprimento. Gonozooids são hermafroditas, o espermatozóide é liberado intermitentemente enquanto a fertilização dos ovos ocorre internamente16,17. Quando o gonozooide é ≥ 6 mm de tamanho, ele libera até 6 ovos fertilizados. A cultura bem-sucedida requer o suporte às necessidades específicas de cada um desses estágios de história de vida únicos.
Devido ao significado ecológico e evolutivo de Thaliaceans, incluindo doliolids, há uma necessidade para as metodologias de cultivo para avançar o entendimento da biologia, fisiologia, ecologia e história evolutiva do único organismo19 . Os doliolids têm uma promessa considerável como organismos modelo experimentais em biologia do desenvolvimento e genômica funcional porque são transparentes e provavelmente têm genomas simplificados20,21. A falta de métodos de cultivo confiáveis, no entanto, impede sua utilidade como modelos laboratoriais. Embora um punhado dos laboratórios publiquem resultados baseados em doliolids cultivados, a nossas aproximações do cultivo do conhecimento e os protocolos detalhados não estiveram publicados previamente. Com base em anos de experiência e tentativas de cultivo experimental e de erro, o objetivo deste estudo foi revisar experiências e compartilhar protocolos para a coleta e cultivo de doliolids, especificamente a espécie Dolioletta gegenbauri.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1860px;" width="1860">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:681px;">Algal culture tubes (55 mL sterile disposable glass culture tubes)</td>
			<td style="width:417px;">Any</td>
			<td style="width:167px;">NA</td>
			<td style="width:595px;">For algal cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:681px;">Autoclave</td>
			<td style="width:417px;">Any</td>
			<td style="width:167px;">NA</td>
			<td>For sterilizing equipment and seawater for algal cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:681px;">Beakers (2 L glass)</td>
			<td style="width:417px;">Any</td>
			<td style="width:167px;">NA</td>
			<td>For sorting diluted plankton net tow contents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:681px;">Buckets (5 gallon, ~20L)</td>
			<td style="width:417px;">Any</td>
			<td style="width:167px;">NA</td>
			<td>For diluting contents of planton net tow - should be seawater conditioned before first use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:681px;">Carboys (20 L)&#160;</td>
			<td style="width:417px;">Any</td>
			<td style="width:167px;">NA</td>
			<td>For storing seawater</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Doliolid glass culturing jar (1.9 L narrow mouth glass jar with cap)</td>
			<td>Qorpak</td>
			<td>GLC-01882</td>
			<td>Container for culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Doliolid glass culturing jar (3.8 L narrow mouth glass jar with cap)</td>
			<td>Qorpak</td>
			<td>GLC-01858</td>
			<td>Container for culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:681px;">Environmental Chamber (Temperature controlled enviromental chamber)</td>
			<td style="width:417px;">Any</td>
			<td style="width:167px;">NA</td>
			<td>To accommodate plankton wheel and culture maintenance</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:681px;">Filtration apparatus for 47 mm filters</td>
			<td style="width:417px;">Any</td>
			<td style="width:167px;">NA</td>
			<td>For filtering seawater for cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass microfiber filters, 47 mm</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1825-047</td>
			<td>For filtering seawater for cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass pipette (borosillicate glass pipette (glass tubing), OD 10mm, ID 8 mm, wall thickness 1mm)</td>
			<td>Science Company</td>
			<td>NC-10894</td>
			<td>Custom cut and edges polished</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:681px;">Hose clamps, stainless steel, #104 (178 mm)</td>
			<td style="width:417px;">Any</td>
			<td style="width:167px;">NA</td>
			<td>For holding culturing jars to the plankton wheel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isochrysis galbana strain CCMP1323</td>
			<td>National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA)</td>
			<td>strain CCMP1323</td>
			<td>For feeding doliolid cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L1 Media Kit, 50 L</td>
			<td>National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA)</td>
			<td>MKL150L</td>
			<td>For culturing algae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:681px;">Lamp (Fluorescent table lamp with an adjustable arm)</td>
			<td style="width:417px;">Any</td>
			<td style="width:167px;">NA</td>
			<td>For illuminating doliolids in the jars and beakers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:681px;">Lighted temperature controlled incubator</td>
			<td style="width:417px;">Any</td>
			<td style="width:167px;">NA</td>
			<td>For algal cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:681px;">Micropipettes and sterile tips (0-20 &#181;l, 20-200 &#181;l, 200-1000&#160;&#181;l)</td>
			<td style="width:417px;">Any</td>
			<td style="width:167px;">NA</td>
			<td>For algal cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plankton Net (202 &#181;m 0.5 m, 5:1 length) with cod end ring and &#160;4 L aquarium cod-end</td>
			<td>Sea-Gear Corporation</td>
			<td>90-50x5-200-4A/BB</td>
			<td>For collecting living doliolids (see Figure 4)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:681px;">Plankton Wheel</td>
			<td style="width:417px;">NA</td>
			<td style="width:167px;">NA</td>
			<td>Custom built (see Figure 2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plastic wrap</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>To cover inside of lid of doliolid culture jars</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Permanganate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P279-500</td>
			<td>Reagent for cleaning jars and glassware</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rhodomonas&#160;sp. strain CCMP740</td>
			<td>National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA)</td>
			<td>strain CCMP740</td>
			<td>For feeding doliolid cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:681px;">Rubber Tubing</td>
			<td style="width:417px;">NA</td>
			<td style="width:167px;">NA</td>
			<td>For holding culturing jars to the plankton wheel (can be made from tygon tubing)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Bisulfite</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S654-500</td>
			<td>Reagent for cleaning jars and glassware</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP359-212</td>
			<td>Reagent for cleaning jars and glassware</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:681px;">Sterile serological pipettes (1 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL)</td>
			<td style="width:417px;">Any</td>
			<td style="width:167px;">NA</td>
			<td>For algal cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thalassiosira weissflogii strain CCMP1051</td>
			<td>National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA)</td>
			<td>strain CCMP1051</td>
			<td>For feeding doliolid cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:681px;">Tissue culture flasks (250 mL)</td>
			<td style="width:417px;">Any</td>
			<td style="width:167px;">NA</td>
			<td>For algal cultures</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cultivation of the marine pelagic tunicate dolioletta gegenbauri (uljanin 1884) for experimental studies

Os e gelatinosos desempenham um papel crucial nos ecossistemas oceânicos. No entanto, é geralmente difícil investigar sua fisiologia, crescimento, fecundidade e interações tróficas, principalmente devido aos desafios metodológicos, incluindo a capacidade de cultura-los. Isto é particularmente verdadeiro para o doliolid, Dolioletta gegenbauri. D. gegenbauri comumente ocorre em sistemas de prateleira continental subtropical produtiva em todo o mundo, muitas vezes em concentrações de floração capazes de consumir uma grande fração da produção primária diária. Neste estudo, descrevemos abordagens de cultivo para a coleta, criação e manutenção de D. gegenbauri com o objetivo de realizar estudos laboratoriais. D. gegenbauri e outras espécies de doliolid pode ser capturado ao vivo usando obliquamente rebocada cônicos 202 μm malha plâncton redes de um navio à deriva. As culturas são mais confiantemente estabelecidas quando as temperaturas da água estão abaixo de 21 ° c e são iniciadas a partir de gonozooids imaturos, amadurecimento de phorozooids, e grandes enfermeiros. As culturas podem ser mantidas em embarcações de cultura arredondadas em uma roda de plâncton lentamente rotativa e sustentada em uma dieta de algas cultivadas em água do mar natural por muitas gerações. Além da capacidade de estabelecer culturas laboratoriais de D. gegenbauri, demonstramos que a condição de coleta, a concentração de algas, a temperatura e a exposição à água do mar naturalmente condicionada são essenciais para a cultura estabelecimento, crescimento, sobrevivência e reprodução de D. gegenbauri.

Seguindo os procedimentos descritos para coleta e cultivo do doliolid, d. gegenbauri delineado na Figura 3, é possível manter uma cultura de d. gegenbauri ao longo de sua história de vida complexa (Figura 1) e sustentá-lo por muitas gerações. Embora o cultivo de D. gegenbauri seja descrito aqui, esses procedimentos também devem ser relevantes para o cultivo de outras espécies de doliolid.
A captaçã...

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Cultivation of the Marine Pelagic Tunicate Dolioletta gegenbauri Uljanin 1884 for Experimental Studies

Cultivo do Tunicato marinho pelágico Dolioletta gegenbauri (uljanin 1884) para estudos experimentais

Doliolids, incluindo a espécie Dolioletta gegenbauri, são pequeno zooplâncton marinho gelatinoso de significado ecológico encontrado em sistemas de prateleira subcontinentais produtivos em todo o mundo. A dificuldade de cultivar esses organismos delicados limita sua investigação. Neste estudo, descrevemos abordagens de cultivo para a coleta, criação e manutenção do doliolid Dolioletta gegenbauri.

Gelatinous zooplanktons play a crucial role in ocean ecosystems. However, it is generally difficult to investigate their physiology, growth, fecundity, ...

A disponibilidade de organismos modelos culturais tem sido fundamental para o avanço em muitos campos de estudo. Este protocolo, pelo que sabemos, é a única abordagem disponível para a cultura de Doliolids. A tecnologia de cultura doliolida confiável fornece um modelo experimental único para estudar organismos que são importantes para algumas das regiões mais produtivas do oceano e que representam os primeiros ancestrais evolutivos dos vertebrados.Esta técnica é única, pois mantém as partículas de alimentos algas e os organismos suspensos na coluna de água sem contato com as paredes do recipiente como experimentam na natureza. Este método de cultivo pode ser aplicado à cultura de outras pequenas espécies gelatinosas e crustáceas ou plâncton. Como os doliólitos têm um ciclo de vida complexo, compreender e reconhecer as necessidades de cada fase da vida é fundamental.Aprender o ciclo de vida e como reconhecê-los e lidar com eles requer muita prática. Em nossa experiência, a única maneira de aprender essa técnica de cultivo é vê-la e fazê-la. Vários outros participantes do projeto, incluindo Erin Arneson, Nicholas Castalaine, Natalia Lopez, Lauren Lamboye, Briana Pierce, Arya Rodriguez-Santiago e Terrell Scarborough também apareceram brevemente neste vídeo.Antes de estabelecer e criar culturas Doliolid em laboratório, limpe e esterilize potes de cultura de vidro de 1,9 e 3,8 litros, imergindo-os na solução de permangênio de hidróxido de sódio. Deixe os frascos de molho durante a noite. Em seguida, transfira os frascos para a solução de bisulfito de sódio.Deixe os frascos de molho durante a noite. Em seguida, enxágue os frascos completamente com água deionizada. Deixe os frascos secarem.Para manter as culturas de estoque, use rigorosas técnicas de cultura axenica. A cada duas semanas transfere 0,5 mililitros da velha cultura senescente para 25 mililitros de mídia de crescimento fresco em tubos de cultura de vidro estéril de 55 mililitros. Para preparar volumes maiores de fitoplâncton para alimentar Doliolids, transfira de fitoplâncton de estoques axeônicos para frascos de cultura de tecido plástico de 500 mililitros contendo 200 mililitros de mídia de crescimento para inocular em uma a 50 diluição.Incubar a cultura em uma incubadora ambiental ou câmara ambiental a 20 graus Celsius com um ciclo claro-escuro de 12 a 12 horas sob iluminação de luz branca fria de 65 a 85 microEinsteínas por metro quadrado. A cultura leiga é plana para maximizar a iluminação. Gentilmente redemoinho a cultura diariamente.Vá para o mar. Para localizar Doliódes na plataforma continental, implante o instrumento oceanográfico CTD para identificar condições de água propícias à presença de Doliolids por meio de perfil de temperatura da água, salinidade e clorofila A fluorescência. Confirme as condições da água realizando reboques exploratórios com redes especializadas de plâncton.Alternativamente, use um sistema de imagem de perfil in situ para detectar Doliolids. Agora opere o guincho para recuperar o CTD. As garrafas Niskin montadas na roseta CTD coletaram água do mar do local onde estão localizados Doliolids e na profundidade contendo as maiores estimativas de clorofila.Enxágüe três baldes de 22 litros com água do mar e encha com água do mar a pouco mais da metade cheia. Encha a extremidade do bacalhau líquido completamente com água do mar e conecte a extremidade do bacalhau à rede. Implante a rede.Abaixe e levante a rede através da coluna de água, mantendo um ângulo de reboque oblíquo de 15 a 25 graus e a implantação vertical e velocidade de recuperação não superior a 15 metros por minuto. Uma vez que a rede esteja a bordo, transfira suavemente e divida o conteúdo da extremidade do bacalhau para os baldes de plástico cada um contendo água do mar superficial coletada do local. Usando uma pipeta de vidro de furo largo misture suavemente o conteúdo do béquer com a pipeta usando movimentos verticais e horizontais.Usando o dedo indicador, crie sucção capilar para capturar e transferir Doliolids. Capture os Doliódes de fitoplâncton misto no béquer. Após a adição de Doliolids, adicione a cultura rhodomonas no frasco a uma concentração final de cerca de cinco vezes 10 para a terceira a 10 para as quatro células por mililitro.Verifique a cor do trato digestivo dos doliódes. A cor vermelha determina que os Doliódes estão se alimentando ativamente. Para evitar que Os Doliódes estejam presos na interface ar-água, encha completamente os frascos com água do mar não filtrada e rica em partículas para evitar o espaço da cabeça.Coloque um pedaço de plástico sobre a abertura do frasco. Evite criar bolhas de ar que também possam danificar os animais. Aparafusar cuidadosamente a tampa sobre o frasco e inverter suavemente o frasco para determinar se as bolhas estão presentes.Se as bolhas estiverem presentes, encha mais água do mar para removê-las. Depois que os frascos forem preenchidos com a tampa e limpar o excesso de água do lado de fora do frasco. Coloque cada frasco na roda de plâncton colocando o frasco nas barras de metal verticais cobertas com tubos de borracha e entre um grampo de mangueira de aço inoxidável.Certifique-se de que a parte de trás do frasco está amortecida contra o tubo de borracha. Ajuste o parafuso para apertar o grampo da mangueira ao redor do frasco. Deixe os frascos girarem a 0,3 rpm para manter os Doliolids em suspensão.Após três dias de aclimatação para as condições laboratoriais, transfira de 100 a 150 mililitros de água cultural do frasco para um recipiente de amostra e meça a concentração de algas usando um contador Coulter. Com base na estimativa de concentração de algas, adicione algas suficientes para elevar a concentração no frasco de cultura para 40 a 95 microgramas de carbono por litro. Use o contador de partículas para monitorar as concentrações de algas depois que os Doliódes se alimentarem para orientar a decisão de quanta frequência e quanto algas adicionar às culturas.Mantenha concentrações de fitoplâncton nos frascos de cultura entre 40 e 95 microgramas de carbono por litro. Culturing Doliolids requer apoiá-los através de seu complicado ciclo de vida. Desenvolvendo larvas e oozoóides e enfermeiras precoces.Uma vez que um mínimo de oito trophozoóides são visíveis no catafora da enfermeira, transfira pelo menos quatro enfermeiras para um novo frasco de cultivo. Uma vez que os phorozoóides atingem três milímetros de tamanho, reduza o número de animais no frasco. Quando os phorozoóides se tornam maiores que cinco milímetros e desenvolveram aglomerados gonozoóides removem todos, exceto quatro phorozoóides.Este protocolo fornece uma visão geral de uma abordagem de coleta e cultivo de Dolioletta gegenbauri. As taxas de despejo de algas foram semelhantes nas concentrações de 20 a 60 microgramas de carbono por litro e diminuíram à medida que as concentrações alimentares aumentavam. As taxas de despejo aumentaram proporcionalmente sobre as faixas de temperatura que apoiam o crescimento de D.gegenbauri.Foram observadas taxas de crescimento variando de 0,1 a 0,7 milímetros por dia em função da temperatura e disponibilidade de alimentos. O cultivo de Doliolids depende de replicar com sucesso as condições oceânicas e acomodar as necessidades dos animais ao longo de seu complicado ciclo de vida. Consequentemente, é necessário um manuseio suave dos animais durante sua captura, isolamento e criação.As concentrações alimentares devem ser monitoradas com frequência e ajustadas. Isso é particularmente verdadeiro durante as fases de vida das larvas e oozoóides em desenvolvimento. Este método é especificamente projetado para a criação de pequenas espécies de zooplâncton na base da teia alimentar marinha.Este método será valioso, por exemplo, para investigar as respostas do zooplâncton às mudanças climáticas. Desde o seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para os ecologistas zooplânctons determinarem as taxas de alimentação, crescimento e reprodução de doliódicos baseados em laboratório. Além disso, este método abriu caminho para investigações revolucionárias de base molecular da dieta doliolida na natureza.Gostaria de lembrá-lo que o protocolo de limpeza de vidro envolve reagentes que são irritantes respiratórios e devem ser usados em áreas bem ventiladas. Trabalhar no mar também pode ser perigoso, então siga as regras de segurança do navio.

Research

JoVE Journal

Environment

Cultivation of the Marine Pelagic Tunicate Dolioletta gegenbauri (Uljanin 1884) for Experimental Studies

A Noninvasive Method For In situ Determination of Mating Success in Female American Lobsters (Homarus americanus)

A Noninvasive Method For In situ Determination of Mating Success in Female American Lobsters Homarus americanus

Um método não invasivo para<em&gt; Em situ</em&gt; Determinação do sucesso de acasalamento em fêmeas lagostas americanas (<em&gt; Homarus americanus</em&gt;)

Despite being one of the most productive fisheries in the Northwest Atlantic, much remains unknown about the natural reproductive dynamics of American ...

Ambiente

A Fish-feeding Laboratory Bioassay to Assess the Antipredatory Activity of Secondary Metabolites from the Tissues of Marine Organisms

A Laboratory Bioassay alimentando-Fish para avaliar a actividade anti-predação de metabolitos secundários a partir de tecidos de organismos marinhos

Marine chemical ecology is a young discipline, having emerged from the collaboration of natural products chemists and marine ecologists in the 1980s with ...

Clean Sampling and Analysis of River and Estuarine Waters for Trace Metal Studies

Limpo Amostragem e Análise do Rio e Estuarina Waters de Estudos de metal de rastreamento

Most of the trace metal concentrations in ambient waters obtained a few decades ago have been considered unreliable owing to the lack of contamination ...

Experimental Protocol for Biodiesel Production with Isolation of Alkenones as Coproducts from Commercial Isochrysis Algal Biomass

Experimental Protocol for Biodiesel Production with Isolation of Alkenones as Coproducts from Commercial Isochrysis Algal Biomass

Protocolo experimental para Produção de Biodiesel com Isolamento de Alkenones como subprodutos da Commercial<em&gt; Isochrysis</em&gt; Algas Biomassa

The need to replace petroleum fuels with alternatives from renewable and more environmentally sustainable sources is of growing importance. ...

VacuSIP, an Improved InEx Method for In Situ Measurement of Particulate and Dissolved Compounds Processed by Active Suspension Feeders

VacuSIP, an Improved InEx Method for In Situ Measurement of Particulate and Dissolved Compounds Processed by Active Suspension Feeders

VacuSIP, um método melhorado para Inex<em&gt; In Situ</em&gt; Medição de partículas e dissolvidos compostos Processado por alimentadores de suspensão ativa

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and ...

Ecotoxicological Method with Marine Bacteria Vibrio anguillarum to Evaluate the Acute Toxicity of Environmental Contaminants

Ecotoxicological Method with Marine Bacteria Vibrio anguillarum to Evaluate the Acute Toxicity of Environmental Contaminants

Método Ecotoxicológico com Bactérias Marinhas<em&gt; Vibrio anguillarum</em&gt; Avaliar a Toxicidade Aguda dos Contaminantes Ambientais

Bacteria are an important component of the ecosystem, and microbial community alterations can have a significant effect on biogeochemical cycling and food ...

Vegetated Treatment Systems for Removing Contaminants Associated with Surface Water Toxicity in Agriculture and Urban Runoff

Vegetated Sistemas de Tratamento para Remoção de Contaminantes Associados à Toxicidade de Águas Superfícies na Agricultura e Escorrências Urbanas

Urban stormwater and agriculture irrigation runoff contain a complex mixture of contaminants that are often toxic to adjacent receiving waters. Runoff may ...

Extraction of Organochlorine Pesticides from Plastic Pellets and Plastic Type Analysis

Extração de Pesticidas Organoclorados de Pelotização de Plástico e Análise de Tipo de Plástico

Plastic resin pellets, categorized as microplastics (&#8804;5 mm in diameter), are small granules that can be unintentionally released to the environment ...

Development of New Methods for Quantifying Fish Density Using Underwater Stereo-video Tools

Desenvolvimento de novos métodos para quantificar a densidade de peixes usando ferramentas de estéreo-vídeo subaquáticas

The use of video camera systems in ecological studies of fish continues to gain traction as a viable, non-extractive method of measuring fish lengths and ...

Methods for Image-based Surveys of Benthic Macroinvertebrates and Their Habitat Exemplified by the Drop Camera Survey for the Atlantic Sea Scallop

Métodos para pesquisas com base em imagem de macroinvertebrados bentônicos e seu Habitat, exemplificado pela pesquisa câmera Drop para o Oceano Atlântico Vieira

Underwater imaging has long been used in the field of marine ecology but decreasing costs of high-resolution cameras and data storage have made the ...