Name: transient treatment of human pluripotent stem cells with dmso to promote differentiation
Uploaded: 2019-07-17T14:30:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation at JoVE.com

وقد تم دعم هذا العمل بمنح من كلية الطب بجامعة ستانفورد وزمالة سيبيل الممنوحة لـ S.C.

وليس للميكن الكشف عن ذلك.

وباختصار، يصف هذا البروتوكول أداة بسيطة وغير مكلفة لتعزيز قدرة التمايز للخلايا الجذعية متعددة القوى (PSCs) لجميع الطبقات الجرثومية الأولية، وأنواع مختلفة من خلايا السلف المتخصصة، وحتى أنواع الخلايا الناضجة الوظيفية في المختبر وفي إعدادات الجسم الحي. موضحة هي بروتوكولات تمايز محددة تم استنساخها بشكل فعال في مختبرنا وكذلك في مختبرات أخرى، ولكن يمكن استخدام أي بروتوكول تمايز من اختيارك بعد علاج DMSO. وكما هو مبين في الجدول1، أظهر عدد من المختبرات أيضاً تعزيزاً للتمايز بين الشركات بعد المعالجة العابرة لـ DMSO باستخدام نماذج مختلفة لتوليد أنواع مختلفة من الخلايا الطرفية الأخرى. وعلاوة على ذلك، على الرغم من أن الأساليب هنا تصف استخدام الـ PSCs البشري، فإن المعالجة المسبقة لDMSO يمكن استخدامها عبر الأنواع وقد ثبت أنها فعالة في الفئران والأرانب وPSCs الرئيسيات.
على الرغم من أن جرعات أعلى من DMSO من المعروف أن تكون سامة للخلايا، والجرعات المنخفضة المستخدمة في هذه الطريقة (1٪ -2٪) لفترة عابرة يؤدي إلى الحد الأدنى من موت الخلايا. في حين أن الأرقام الإجمالية للخلايا مباشرة بعد العلاج DMSO قد تنخفض بسبب تعزيز DMSO من اعتقال دورة الخلية في المرحلة G1 من دورة الخلية، وتظهر الدراسات السابقة أن الخلايا قادرة على الوصول إلى نفس مستوى الملاءمة كما الثقافات السيطرة بعد إزالة DMSO3.
يجب تحسين النسبة المئوية ومدة المعالجة المسبقة DMSO لكل خط الخلية. وينبغي تعديل وقت العلاج مع مراعاة لركوب الدراجات / مضاعفة الوقت من الخلايا. على سبيل المثال، PSCs الماوس عادة ما يكون أقصر بكثير أوقات ركوب الدراجات من حوالي 15 ساعة; وبالتالي، فإن علاج DMSO لمدة 15 ساعة لهذه الخلايا يكفي. كما وجدت بعض المختبرات أن علاج DMSO مفيد عند استمراره أثناء بروتوكول التمايز أو بتركيزات أقل (انظر الجدول1). وتجدر الإشارة إلى أن بعض خطوط PSC قابلة للتعديل بدرجة أكبر للتمييز بين سلالات محددة. فعلى سبيل المثال، تبين أن خلايا HUES6 أقل تساهلاً في التمايز، وبالتالي فقد تحسنت بشكل ملحوظ مع علاج DMSO (الشكل2). وكبديل لذلك، تبين أن خلايا HUES8 المستخدمة في الشكل 4 والشكل 5 لديها ميل أعلى نحو التمايز داخل الجلد؛ وهكذا، تم إظهار اختلافات أقل بين السيطرة وDMSO للتمايز في المراحل الأولية نحو endoderm النهائي. ومع ذلك، يلاحظ تعزيز المعالجة المسبقة لDMSO في مراحل لاحقة من التمايز في هذا الخط الخلوي (الشكل4باء). علاج DMSO هو أيضا تنوعا من حيث أنه فعال في كل من أنظمة الثقافات الخلية 2D و 3D، ويمكن استخدامه مع أنواع مختلفة من مواد الطلاء على لوحات ثقافة الخلية، ويعمل في أنواع مختلفة من وسائل الصيانة التي تعزز النمو والتوسع في hPSCs (على سبيل المثال، mTeSR، E8، وسائل الإعلام مكيفة MEF، الخ).
وبشكل أعم، تشير هذه النتائج إلى أن حالة بدء الخلايا الجذعية متعددة القوى لها تأثير قوي على الميل إلى التمايز الأولي وكذلك التمايز النهائي في أنواع الخلايا الوظيفية. لقد أظهرنا سابقا أن وظائف العلاج DMSO من خلال Rb في hPSCs3،5. Rb يلعب دورا هاما في تعزيز التمايز النهائي، وبقاء الخلية، والاستقرار الوراثي للخلايا41،42،43،44،وبالتالي قد يفسر الآثار المستمرة على الخلايا متمايزة عن hPSCs المعالجة بـ DMSO. وقد يؤدي استهداف هذه الأساليب المبكرة للتنظيم إلى وضع هذه المراكز على مسار أفضل للتمايز وتحسين فائدتها في الطب التجديدي في نهاية المطاف.

وقد أدى استخدام الخلايا الجذعية متعددة القوى إلى العديد من التطورات في البحوث الطبية الحيوية، بما في ذلك مجالات الطب التجديدي والعلاجات القائمة على الخلايا الجذعية، ونمذجة الأمراض، وفحص الأدوية. كما أدى ذلك إلى الآفاق العامة لمزيد من البحوث القابلة للترجمة والطب الشخصي. وقد سمح ظهور تكنولوجيا الخلايا الجذعية متعددة القوى المستحثة (iPSC) منذ أكثر من 20 عاماً للباحثين بتطوير خلايا جذعية متعددة القوى من الأنسجة الجسدية وتمييزها إلى أنواع الخلايا الوظيفية لدراسة مجموعة متنوعة من الأمراض، بما في ذلك أمراض القلب والأوعية الدموية والعصبية والمناعية. على الرغم من أن خطوات كبيرة قد قطعت في تكنولوجيا تمايز الخلايا الجذعية، لا تزال التحديات في التمييز الفعال بين الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) وiPSCs مستمرة، مما يحد من الاستخدام الواسع النطاق لتكنولوجيا الخلايا الجذعية عبر مختلف برامج البحوث. لا يزال التباين المتأصل عبر خطوط الخلايا المختلفة والحيوانات المستنسخة يشكل عقبات أمام التمييز بين خطوط الخلايا الجذعية إلى اللاينات المطلوبة1. وعلاوة على ذلك، فإن اشتقاق خلايا وظيفية ناضجة ومختلفة بشكل نهائي عن هذه المراكز لا يزال عملية شاقة وغير فعالة عبر العديد من السلالات. في الواقع، الخلايا المتمايزة عن hPSCs غالبا ً ما تفشل في التمييز بشكل نهائي في الخلايا الوظيفية2. في مزيد من نقل العلاجات القائمة على الخلايا الجذعية لاستخدامها في المرضى، هناك حاجة إلى تحسين وضمان فعالية الخلايا التي يتم إنشاؤها من hPSCs.
وقد أنشأ مختبرنا أداة سريعة وغير مكلفة لتعزيز كفاءة التمييز بين كل من iPSCs وESCs في أنواع الخلايا الناضجة. وجدنا أن المعالجة المسبقة للhiPSCs وhESCs مع كبريتيد ثنائي الميثيل الكاشف شائع الاستخدام (DMSO) لمدة 24 ساعة إلى 48 ساعة قبل توجيه التمايز يؤدي إلى تحسن ملحوظ في قدرة تمايز الخلايا الجذعية. العلاج مع DMSO يزيد من نسبة hiPSCs وhESCs في مرحلة G1 المبكرة من دورة الخلية وينشط بروتين الريتينوبلاستوما (Rb)3، وهو منظم حاسم لانتشار الخلايا، والبقاء على قيد الحياة، والتمايز4. في العمل الأحدث، تم العثور على أن Rb وأفراد أسرته مطلوبة للآثار المؤيدة للتمايز من DMSO، بحيث التعطيل العابر للRb يمنع آثار DMSO، في حين أن التنشيط التأسيسي للRb بطريقة عابرة يعزز آثار DMSO5. مماثلة لدورة الخلية أثناء النمو الجنيني، تتميز دورة الخلايا من ESCs وiPSCs بمرحلة G1 مختصرة التي تشجع على التجديد الذاتي6،7،8. هذه المرحلة المختصرة G1 تسمح بانتشار أكثر غير مقيد ة ولكنها تحد من إمكانية التمايز4و9. من خلال تعزيز القبض على النمو في G1 وتفعيل ضوابط نقاط التفتيش في دورة الخلايا من hESCs وiPSCs، والعلاج DMSO رئيس الخلايا للتغيرات مصير الخلية بعد التمايز الموجه.
حتى الآن، وقد ثبت DMSO المعالجة المسبقة لتحسين القدرة على التمايز لجميع الطبقات الجرثوميةالثلاث في أكثر من 30 السيطرة والأمراض الخاصة بالإنسان ESC وiPSC خطوط الخلايا 3،5، فضلا عن التمايز من الخلايا الجذعية وغيرها خطوط الخلايا إلى مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا الناضجة الأخرى في الدراسات اللاحقة10،11،12،13،14،15،16، 17 سنة , 18 سنة , 19 سنة , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 (الجدول1). وعلاوة على ذلك، تبين أن علاج DMSO فعال في تعزيز التمييز بين الخلايا الأولية غير البشرية21و23 (مثل الماوس والرئيسيات والأرانب)، مما يشير إلى آليات مشتركة عبر الأنواع. وأخيراً، تم توسيع نطاق المعالجة المسبقة لـ DMSO لتشمل تكنولوجيا تحرير الجينات، حيث أظهرت دراسة خاصة أن المعالجة المسبقة لـ DMSO 24 ساعة من الـ HESCs/iPSCs زادت بشكل كبير من قدرة عمليات التكرار القصيرة المتداخلة المتباعدة (CRISPR) /CRISPR المرتبطة البروتين-9 (Cas9) بوساطة كفاءة التحرير من الحمض النووي غير الترميز دون إدراج الطفرات غير المقصودة29. وترد هنا منهجية مفصلة للمعالجة المسبقة للمراكز والبلدان المتوسطة الدخل من أجل التطبيقات في بيولوجيا الخلايا الجذعية والتمايز الموجه.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:651px;" width="651">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">21985023</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">9-Position stir plate&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Chemglass</td>
			<td style="width:135px;">CLS-4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Accutase</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">11105-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Activin A</td>
			<td style="width:135px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>338-AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Advanced RPMI</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">12633012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alk5i II</td>
			<td style="width:135px;">Axxora</td>
			<td style="width:135px;">ALX-270-445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">all-trans retinoic acid&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-Brachyury</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">AF2085</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:215px;">anti-C-peptide</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:135px;">GN-ID4</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-FoxA2</td>
			<td style="width:135px;">Millipore</td>
			<td>07-633</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-Nkx2.2</td>
			<td>University of Iowa, Developmental Hybridoma Bank</td>
			<td>74.5A5</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-Nkx6.1</td>
			<td>University of Iowa, Developmental Hybridoma Bank;&#160;</td>
			<td style="width:135px;">F55A12-supernatant</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-Olig2</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:135px;">MABN50</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-Pax-6</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td style="width:135px;">901301</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-Pdx1</td>
			<td style="width:135px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>AF2419</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-SOX1&#160;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">AF3369</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-SOX17</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">AF1924</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:215px;">B-27 Supplement, minus Vitamin A</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">basic fibroblast growth factor</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>PHG0264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Betacellulin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>50932345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chir99021</td>
			<td style="width:135px;">Stemgent</td>
			<td>04-000-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">CMRL 1066</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">99-603-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:215px;">Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td style="width:135px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:135px;">AMQAF1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:135px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:135px;">G7528&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">DAPI</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:135px;">D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Disposable Spinner Flasks</td>
			<td style="width:135px;">Corning, VWR</td>
			<td style="width:135px;">89089-814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">DMEM/F-12</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">DMSO&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Essential 6 Media</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>A1516501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">FAF-BSA</td>
			<td style="width:135px;">Proliant&#160;</td>
			<td style="width:135px;">68700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">FGF7</td>
			<td style="width:135px;">PeproTech</td>
			<td style="width:135px;">100-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Geltrex</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>A1413202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">GlutaMAX&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Heparin&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:135px;">H3149&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Ultrasensitive Insulin ELISA</td>
			<td>ALPCO Diagnostics</td>
			<td>80-INSHUU-E01.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">ITS-X</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:135px;">51500056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KGF</td>
			<td style="width:135px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">AF-100-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Knockout DMEM</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>10829018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">KnockOut Serum Replacement</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-3,3&#8242;,5-Triiodothyronine (T3)</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:135px;">642245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">LDN193189</td>
			<td style="width:135px;">Stemgent</td>
			<td>04-0074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Matrigel Matrix</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MCDB-131&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Cellgro&#160;</td>
			<td style="width:135px;">15-100-CV&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">MEM NEAA</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:215px;">mTeSR 1</td>
			<td style="width:135px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:135px;">5850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">N2 Supplement</td>
			<td style="width:135px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:135px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:135px;">S3817&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Noggin Fc Chimera Protein</td>
			<td style="width:135px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">3344-NG-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PdBU</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:135px;">524390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Mediatech&#160;</td>
			<td style="width:135px;">30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">RPMI</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sant1</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">S4572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SB431542</td>
			<td style="width:135px;">Stemgent</td>
			<td>04-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Smoothened Agonist, SAG</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td>566660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">StemPro Accutase</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>A1110501&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">TrypLE</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">12604013</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:215px;">Ultra-Low Attachment Microplates</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td>3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Vitamin C</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">A4544&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Wnt3a</td>
			<td style="width:135px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>5036-WN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">XAV 939</td>
			<td style="width:135px;">Tocris</td>
			<td style="width:135px;">3748</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">XXI</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:135px;">565790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Y-27632</td>
			<td style="width:135px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:135px;">72302</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transient treatment of human pluripotent stem cells with dmso to promote differentiation

وعلى الرغم من الاستخدام المتزايد للخلايا الجذعية المتعددة القوى، لا تزال هناك تحديات في التمييز الفعال بين الخلايا الجذعية الجنينية والمستحثة المتعددة القوى (ESCs وiPSCs) عبر مختلف السلالات. وقد وُضعت بروتوكولات تمايز عديدة، ومع ذلك فإن التباين بين الخطوط الخلوية وانخفاض معدلات التمايز يضفيان تحديات في تنفيذ هذه البروتوكولات بنجاح. ويوصف هنا بأنه وسيلة سهلة وغير مكلفة لتعزيز قدرة الشركات الخاصة على التمايز. وقد تبين من قبل أن معالجة الخلايا الجذعية ذات التركيز المنخفض من كبريتيد ثنائي الميثيل (DMSO) يزيد إلى حد كبير من ميل مجموعة متنوعة من الشركات الخاصة إلى التفريق إلى أنواع مختلفة من الخلايا بعد التمايز الموجه. وقد ثبت الآن أن هذه التقنية فعالة عبر أنواع مختلفة (على سبيل المثال، الماوس، الرئيسيات، والإنسان) في سلالات متعددة، بدءا من الخلايا العصبية وspheroids القشرية إلى خلايا العضلات الملساء وخلايا الكبد. يعمل العلاج المسبق لـ DMSO على تحسين تمايز PSC من خلال تنظيم دورة الخلايا والخلايا الجذعية فتيلة لتكون أكثر استجابة لإشارات التمايز. وترد هنا المنهجية التفصيلية لاستخدام هذه الأداة البسيطة كوسيلة قابلة للاستنساخ وقابلة للتطبيق على نطاق واسع للتمييز بكفاءة أكبر بين الشركات الخاصة وأي سلالة من الاختيار.

Watch this Scientific Journal Video about Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation at JoVE.com

Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation

توليد أنواع الخلايا المتمايزة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى (hPSCs) يحمل وعدا علاجيا كبيرا ولكن لا يزال تحديا. وكثيراً ما تظهر المراكز الخاصة بهذه المراكز عجزاً متأصلاً عن التمييز حتى عندما يتم تحفيزها بمجموعة مناسبة من الإشارات. يوصف هنا هو أداة بسيطة لتعزيز التمايز متعدد السلالات عبر مجموعة متنوعة من خطوط PSC.

العلاج العابر للخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى مع DMSO لتعزيز التمايز

Despite the growing use of pluripotent stem cells (PSCs), challenges in efficiently differentiating embryonic and induced pluripotent stem cells (ESCs and ...

وهو علاج بسيط يمكن تطبيقه على أي خط الخلايا الجذعية أو بروتوكول التمايز إلى الخلايا الرئيسية للتمايز. كل ما على المرء القيام به هو إضافة DMSO في 1-2٪ في شبكة الاتصالات الخلوية المتوسطة. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح للمرء أن يزيد بشكل كبير من إمكانات التمايز للخلايا الجذعية متعددة القدرات في أي سلالة من اختيار عن طريق الخلايا فتيلة للتمايز.يزيد علاج DMSO من فرصة أن الخلايا ستميز عن iPSCs المشتقة من المريض ، مما يسمح باستخدامها في العلاج ببدائل الخلايا ، ونمجة الأمراض ، وفحص الأدوية. ويمكن أن يؤدي إلى بداية مبكرة للتنظيم الذي يتحكم في الانتشار دون الانتشار والتمايز والمواصفات أثناء التطور الجنيني. وقد أثبتنا أن علاج DMSO يحسن التمايز في ما يقرب من 50 خط الخلايا الجذعية الجنينية والمستحثة.في حين أظهرت مختبرات أخرى أنه مفيد للخلايا الجذعية من الأنواع الأخرى، مثل الفأر والرئيسيات. قبل يوم واحد من بداية التمايز، أضف دمسو بتركيز 1 أو 2٪ لمدة 24 ساعة في وسط الصيانة النموذجي. بعد 24 ساعة من علاج DMSO، استبدل المتوسط واعمل على بروتوكول التمايز المعتاد.تنمو الخلايا وفقا لاتجاهات المخطوطات. عندما تصل الخلايا إلى التقاء مناسب ، افصلها وتعد تعليقًا وحيدًا للخلية. عد الخلايا الحية مع عداد الهيموسيتات أو عداد الخلايا التلقائي، وذلك باستخدام علامة قابلية البقاء مثل الأزرق trypan.من أجل تحقيق 80-90٪ التقاء داخل 24 ساعة DMSO المعالجة المسبقة، لوحة الخلايا على لوحة ستة جيدا المغلفة في كثافة 500، 000 إلى 1 مليون خلية في البئر. احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون. ثم، الطامح وسائل الإعلام واستبدالها مع حل DMSO 1-2٪.السماح للخلايا لاحتضان لمدة 24-28 ساعة قبل التمايز. إذا احتضان لمدة 48 ساعة، استبدال وسائل الإعلام بعد 24 ساعة مع حل DMSO جديدة. لتحقيق تمايز ثقافة 3D، تنمو وجمع الخلايا في تعليق الخلية.عد الخلايا الحية ولوح لهم في غير المصقول، وانخفاض المرفق ستة جيدا لوحة في وسائل الإعلام الخلايا الجذعية مع مثبط روك. عادة، 3D مجالات الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات سوف تشكل في غضون 24 ساعة. السماح للخلايا لاحتضان لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون.إعداد 1-2٪ DMSO في وسائل الإعلام الخلايا الجذعية ساخنة مسبقا وفقا لتوجيهات المخطوطات. لاستبدال الوسائط بعد الحضانة، قم بإمالة اللوحة إلى زاوية 30 درجة إلى 45 درجة، والسماح لزوايا الخلايا بالاستقرار في الجزء السفلي من البئر. استلهم الوسائط من الخلايا ثم قم بإعادة تعليقها بلطف في حل DMSO.السماح للخلايا لاحتضان لمدة 24-48 ساعة في 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون. قبل علاج الخلايا مع DMSO كما هو موضح للثقافات 2D، وإعداد noggin وحلول الأسهم SB431542. إعداد ما يكفي من 10٪ استبدال المصل بالضربة القاضية, أو KOSR, في DMEM خروج المغلوب لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام من تغيير وسائل الإعلام.إعداد وسائط التمايز التمايز التحضيمي بإضافة noggin و SB431542 إلى DMEM الزخرفة من الـ KOSR التي تم تسخينها مسبقًا كما هو موضح في المخطوطة. بعد DMSO قبل المعالجة، استنشاق وسائل الإعلام من الخلايا وإضافة ملليلتر اثنين من وسائل الإعلام التمايز إلى كل بئر. السماح للخلايا بالاحتضان لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون، واستبدال وسائل الإعلام يوميًا بعوامل تمايز جديدة.يؤدي العلاج المسبق لـ DMSO إلى انخفاض عابر ومعتمد على الجرعة في معدل نمو الخلايا مقارنة بالخلايا غير المعالجة. ويرتبط هذا الانخفاض في الانتشار مع زيادة في الاتصال من خلية إلى خلية، والتي هي واضحة بشكل خاص في الخلايا المعالجة DMSO 2٪. عندما تكون الخلايا ثابتة وملطخة لعلامات ا يسبق كل طبقة جرثومية، يمكن ملاحظة أن 2٪ DMSO نتائج ما قبل المعالجة في زيادة نسبة خلايا طبقة الجرثومية المتباينة.على سبيل المثال، كان ملطخة SOX17 لتصور الخلايا أندودم. من أجل التحقيق في تأثير DMSO على التمايز لأنواع الخلايا السلف في الجهاز العصبي المركزي ، يمكن تمييز الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان إلى خلايا سلف عصبية أو خلايا سلف oligodendrocyte. بالمقارنة مع الخلايا التحكم, 2٪ DMSO المعالجة المسبقة يزيد من التعبير عن علامة الخلية السلف العصبي Pax6.وبالمثل، فإن المعالجة المسبقة تزيد من نسبة الخلايا التي تعبر عن أوليجودندروسيت علامة الخلية السلف Olig2. وعلاوة على ذلك، يحسن العلاج الأولي من DMSO وظيفة الخلايا الجذعية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية بعد زرع الخلايا الجنينية في الجسم الحي. عندما يتم زرع خلايا السلف البنكرياسية المتمايزة في الفئران المناعية، يمكن اختبار وظائفها استجابة لتحدي الجلوكوز أو التحفيز KCl.ويتضح من التحسينات في وظائف الخلايا من أسبوعين إلى 16 أسبوعا بعد زرع. الاعتبار الأكثر أهمية التي يجب أخذها في الاعتبار هو ركوب الدراجات أو مضاعفة الوقت للخلايا الجذعية. يجب أن يكون طول علاج DMSO هو نفس وقت ركوب الدراجات في الخلايا.بعد العلاج الأولي DMSO، يمكن للمرء أن يفهم كيف يتم تنظيم انتشار الخلايا ودورة الخلية في الخلايا الجذعية، كما يساعد العلاج على تعزيز اعتقال النمو في مرحلة G1 من دورة الخلية. يمكن استخدام الخلايا المتمايزة لفهم الآليات المتعلقة بالمرض ، للمشاركة في الزراعة مع أنواع الخلايا الأخرى ، في مقايسات الأورام ، وفي التشايس الوظيفي أو دراسات الزرع لتحديد ما إذا كانت الخلايا المتمايزة يمكن أن تنقذ نوعًا من أنواع المرض الظاهرية.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Stencil Micropatterning of Human Pluripotent Stem Cells for Probing Spatial Organization of Differentiation Fates

الاستنسل Micropatterning من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية لجس التنظيم المكاني للتمايز الأقدار

Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

إنتاج واسع النطاق العضلية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية باستخدام تكرار للغاية الصغيرة وبناء جزيء بروتوكول التمايز

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays

السريع العصبية تمايز الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات لقياس نشاط الشبكة على المصفوفات الدقيقة الكهربائي

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

وجه التفريق بين فروعه المكونة للدم البدائي والنهائي من الخلايا الجذعية Pluripotent البشرية

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

التمايز كفاءة الخلايا الجذعية المحفزة لNKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; البنكرياس أسلاف

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

في المختبر تمايز متعددة القدرات البشرية الخلايا الجذعية إلى خلايا الأرومة الغاذية

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

التفريق بين الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية من الخلايا الجذعية Pluripotent المستحث أو الجنينية البشرية سريعة وموجهة

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a Na&#239;ve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency

Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a NaÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¯ve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency

الارتداد الكيميائية للخلايا الجذعية Pluripotent البشرية التقليدية إلى حالة شبيهة بالسذاجة مع التمايز مولتيلينيجي تحسين فاعلية

Na&#239;ve human pluripotent stem cells (N-hPSC) with improved functionality may have a wide impact in regenerative medicine. The goal of this protocol is ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

فعالة وقابلة للتمايز الموجهة متوافقة سريرياً القرنية حوفي طلائي الخلايا الجذعية من الخلايا الجذعية Pluripotent البشرية

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

التمايز الفعال للخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى في خلايا الكبد

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...