Name: transient treatment of human pluripotent stem cells with dmso to promote differentiation
Uploaded: 2019-07-17T14:30:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Stanford University School of Medicine og et Siebel-stipendium, der blev tildelt S. C.

1. vedligeholdelse af stamceller
Bemærk: Den nedenfor beskrevne celle vedligeholdelsesprotokol gælder for pluipotent-stamceller (kvikskranker), der vedligeholdes i et vedligende monolayer. Medier, andre reagenser og cellekultur plader, der anvendes før DMSO-behandlingen, kan justeres efter behov. For alle de følgende protokoller i dette manuskript skal cellerne håndteres under et biologisk sikkerhedskabinet.
<ol><li>Coat steril, 6 brønd, vævskultur behandlede plader med en pluripotente stamcelle-kvalificeret matrix eller substrat, der er fremstillet i henhold til fabrikantens anvisninger og Inkubér i mindst 1 time i en CO2 -inkubator (5% Co2, fugtig atmosfære). Overtrukne plader kan være film indpakket og opbevaret ved 4 °C i op til en uge.</li>
	<li>Tø de kryopræserverede PSCs i et 37 °c vandbad. Steriliser hætteglasset med ethanol før indføring i det biologiske sikkerhedskabinet, og Overfør straks cellerne ved pipettering til et sterilt konisk rør, der indeholder 5-10 volumener af forvarmede stamcelle medier.</li>
	<li>Cellerne centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved stuetemperatur (RT).</li>
	<li>Aspirér mediet og resuspender forsigtigt celle pellet i 1 mL stamcelle medier suppleret med en 10 μM klippe hæmmer, såsom Y-27632.</li>
	<li>Aspirer den kultur matrix fra pladen og frø cellerne ved den ønskede tæthed, typisk 0,5-1 x 106 celler pr brønd i mindst 2 ml stamcelle medier pr brønd. Bemærk: Plating tæthed kan variere på tværs af forskellige cellelinjer, og kloner og bør optimeres i overensstemmelse hermed.</li>
	<li>Vedligehold cellerne ved at udskifte med forvarmede stamcelle medier dagligt. Opdel cellerne ved ca. 70%-80% konfluency, eller når celle kolonierne begynder at tage kontakt.</li>
	<li>For at opdele celler, aspirere medierne og vaske cellerne én gang med sterile PBS. Cellerne inkubates med 1 mL af en dissociations enzym opløsning pr. brønd i 5-10 minutter ved 37 °C.</li>
	<li>Vask og resuspension cellerne med forvarmet stamcelle medier og Overfør til et sterilt konisk rør med 5-10 volumener af stamcelle medier. Følg trin 1.3-1.7 for at plade cellerne.</li>
</ol>2. DMSO-forbehandling
Bemærk: Ved plettering af cellerne til DMSO-forbehandling forud for differentiering, bør start plating celletætheden optimeres med hensyn til den typiske vækstrate af stamcelle linjen samt den differentierings protokol, der anvendes. Validerer pluripotens ved hjælp af konventionelle markører, hvis det er nødvendigt. Celler skal være urerne mindst 1x-2x efter indledende optøning forud for differentiering.
<ol><li>
2D-kultur differentiering
	<ol>
<li>Når cellerne når en passende sammenblanding, tilbereder de coatede plader, dissocierer cellerne og klargør en enkelt cellesuspension som beskrevet ovenfor.</li>
		<li>Tæl levende celler ved hjælp af et hemocytometer eller automatisk celle tæller, herunder trypan og et Blue eller en anden levedygtighed markør.</li>
		<li>Plade cellerne på en belagt 6 brønd plade ved 0,5-1 x 106 celler pr brønd i stamcelle medier med 10 μM rock inhibitor. Bemærk: For de cellelinjer, som blev testet i vores laboratorium, resulterede disse tæthethere typisk i 80%-90% flydende-celler inden for 24-timers-DMSO-forbehandlingen.</li>
		<li>Lad cellerne inkubere i 24 timer ved 37 °C i en CO2 -inkubator (5% Co2, fugtig atmosfære).</li>
		<li>Forbered 1%-2% DMSO i forvarmede stamcelle medier (f. eks. 100 μL DMSO i 10 mL af mediet = 1% DMSO-opløsning eller 200 μL DMSO i 10 mL af mediet = 2% DMSO-opløsning).</li>
		<li>Efter 24 timers inkubation skal mediet aspirere fra cellerne og udskiftes med DMSO-opløsning.</li>
		<li>Lad cellerne inkubere i 24 timer til 48 h ved 37 °C i en CO2 -inkubator (5% Co2, fugtig atmosfære) før differentiering. Bemærk: Typisk er en 24 h DMSO-behandling tilstrækkelig på tværs af et flertal af humane ESC-og iPSC-linjer. Cellelinjer med meget langsomme vækstrater (lange fordoblings tider) kan drage fordel af 48 h inkubation med DMSO. Til en 48 h inkubation med DMSO kan medierne udskiftes med friske stamcelle medier med 1%-2% DMSO efter den første 24 timers behandling.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
3D kultur differentiering:
	<ol>
<li>Når cellerne når en passende konfluency, dissocierer og samler cellerne i en cellesuspension som beskrevet ovenfor.</li>
		<li>Tæl levende celler ved hjælp af en hemocytometer eller automatisk celle tæller herunder en levedygtighed markør.</li>
		<li>Plade cellerne i en ubelagt, lav-fastgørelse 6 brønd plade ved 0,5-1 x 106 celler pr brønd i stamcelle medier med 10 μM rock inhibitor. Bemærk: For de cellelinjer, som blev testet i vores laboratorium, resulterede disse tætheer typisk i 3D hPSC Sphere formation inden for 24 timer af indstillings celler.</li>
		<li>Lad cellerne inkubere i 24 timer ved 37 °C i en CO2 -inkubator (5% Co2, fugtig atmosfære).</li>
		<li>Forbered 1%-2% DMSO i forvarmede stamcelle medier (f. eks. 100 μL DMSO i 10 mL af mediet = 1% DMSO-opløsning eller 200 μL DMSO i 10 mL af mediet = 2% DMSO-opløsning).</li>
		<li>Udskift mediet efter standardprocedurer (f. eks. vippe pladen i en vinkel på 30 °-45 °, så celle sfærerne kan bosætte sig i bunden af brønden; Overfør celler til et sterilt konisk rør og lad celle kugler bosætte sig i bunden af røret; eller forsigtigt indsamle celler, jeg n suspension med 5 eller 10 mL pipette til et sterilt konisk rør og centrifuge celler ved 300 x g i 5 minutter ved RT).</li>
		<li>Aspirér mediet fra cellerne og Udskift det med DMSO-opløsning, pipettering forsigtigt.</li>
		<li>Lad cellerne inkubere i 24 timer til 48 h ved 37 °C i en CO2 -inkubator (5% Co2, fugtig atmosfære) før differentiering. Bemærk: Typisk er en 24 h DMSO-behandling tilstrækkelig på tværs af et flertal af humane ESC-og iPSC-linjer. Cellelinjer med meget langsomme vækstrater (lange fordoblings tider) kan drage fordel af 48 h inkubation med DMSO. Til en 48 h inkubation med DMSO kan medierne udskiftes med friske stamcelle medier med 1%-2% DMSO efter den første 24 timers behandling.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. differentiering til primære kimlag
Bemærk: Følgende beskriver metoder, der tidligere har vist sig at være effektive i vores laboratorium for kvikskranker dyrket i en enkeltlags på 6 brønd plader. Enhver differentierings protokol bør anvendes efter DMSO-behandlingen for at fremme differentiering i de ønskede lineages. Fjern DMSO-opløsningen efter en 24-48 h-behandling, og Fortsæt med differentieringen efter standardprotokoller.
<ol><li>
Endoderm differentiering (tilpasset fra Kroon et al.30)<ol>
<li>Forbehandl celler med DMSO som beskrevet ovenfor for 2D-kulturer.</li>
		<li>Forbered Wnt3a og Aktivin en bestand løsninger.</li>
		<li>Forbered dag 1 epitel differentierings medie ved at tilsætte Wnt3a til en endelig koncentration på 20 ng/ml og Activity a til en endelig koncentration på 100 ng/ml til det passende volumen af forvarmede rpmi-medier.</li>
		<li>Efter DMSO forbehandling, aspirere medier fra cellerne og erstatte det med dag 1 medier (f. eks 2 mL per brønd af en 6 brønd plade).</li>
		<li>Lad cellerne inkubere i 24 timer ved 37 °C i en CO2 -inkubator (5% Co2, fugtig atmosfære).</li>
		<li>Forbered dag 2 og 3 epitel differentierings medier ved at tilsætte Activity a til en endelig koncentration på 100 ng/ml til det passende volumen af forvarmede rpmi Media.</li>
		<li>Sug mediet ud af cellerne, og Udskift det med dag 2-medier (f. eks. 2 mL pr. brønd af en 6-brønd plade).</li>
		<li>Lad cellerne inkubere i 24 timer ved 37 °C i en CO2 -inkubator (5% Co2, fugtig atmosfære).</li>
		<li>Aspirere medier fra cellerne og erstatte med dag 3 medier (f. eks 2 mL pr brønd af en 6 brønd plade).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mesoderm differentiering (tilpasset fra Zhang et al.31)<ol>
<li>Forbehandl cellerne med DMSO som beskrevet ovenfor for 2D-kulturer.</li>
		<li>Forbered Wnt3a og Aktivin en bestand løsninger.</li>
		<li>Forbered af differentierings medier ved at tilsætte Wnt3a til en endelig koncentration på 20 ng/ml og Activity a til en endelig koncentration på 100 ng/ml til den passende mængde forvarmede Advanced rpmi Media.</li>
		<li>Efter DMSO forbehandling, aspirere medier fra celler og erstatte med differentiering medier (f. eks 2 mL pr brønd af en 6 brønd plade).</li>
		<li>Lad cellerne inkubere i 24 timer ved 37 °C i en CO2 -inkubator (5% Co2, fugtig atmosfære).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Differentiering af ectoderm (tilpasset fra Chambers et al.32)<ol>
<li>Forbehandl cellerne med DMSO som beskrevet ovenfor for 2D-kulturer.</li>
		<li>Forbered Noggin og SB431542 Stock Solutions.</li>
		<li>Forbered ectodermal differentierings base medier ved at opløse knockout serum udskiftning (KOSR) til en endelig koncentration på 10% i knockout DMEM. Bemærk: Forbered nok basis medier til 3-4 dages medieskift.</li>
		<li>Forbered ectodermal differentierings medier ved at tilsætte Noggin til en endelig koncentration på 500 ng/ml og SB431542 til en endelig koncentration på 10 μM til det passende volumen af forvarmede kosr/knockout DMEM.</li>
		<li>Efter DMSO forbehandling, aspirere medier fra celler og erstatte med differentiering medier (f. eks 2 mL pr brønd af en 6 brønd plade).</li>
		<li>Lad cellerne inkubere i 3-4 dage ved 37 °C i en CO2 -inkubator (5% Co2, fugtig atmosfære), og Udskift dagligt medierne med frisk tilsatte differentierings faktorer.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. differentiering til stamcelle typer
I det følgende beskrives metoder, der tidligere har vist sig at være effektive i vores laboratorium for kvikskranker, der dyrkes i 2D-eller 3D-kulturer. Enhver differentierings protokol bør anvendes efter DMSO-behandlingen for at fremme differentiering i de ønskede lineages. Fjern DMSO-opløsningen efter en 24-48 h-behandling, og Fortsæt med differentieringen efter standardprotokoller.
<ol><li>Neurale progenitorcelle differentiering (tilpasset fra Tchieu et al.33)<ol>
<li>Forbered 6 brønd plader ved belægning med en pluripotente stamcelle-kvalificeret reduceret vækstfaktor matrix eller substrat, pr fabrikantens anvisninger, i mindst 1 time i en CO2 -inkubator (5% Co2, fugtig atmosfære). Coatede plader kan film indpakket og opbevares ved 4 °C i op til 1 uge.</li>
		<li>Plade PSCs som beskrevet ovenfor ved densitet 0,5-1 x 106 celler pr brønd i stamcelle medier indeholdende en klippe hæmmer.</li>
		<li>Forbehandl celler med DMSO som beskrevet ovenfor for 2D-kulturer.</li>
		<li>Forbered små kemiske inhibitorer LDN193189, SB431542 og XAV939 stamopløsninger.</li>
		<li>Forbered dage 1-3 Neuro ectoderm differentiering medier ved at supplere væsentlige 6 medier med 500 nM LDN193189, 10 μM SB431542, og 2 μM XAV939.</li>
		<li>Efter DMSO forbehandling, aspirere medierne og erstatte med dage 1-3 neuroectoderm medier (f. eks 2 mL pr brønd af en 6 brønd plade). Skift medier dagligt.</li>
		<li>Forbered dage 4-12 Neuro ectoderm differentiering medier ved at supplere væsentlige 6 medier med 500 nM LDN193189 og 10 μM SB431542.</li>
		<li>På dag 4 af differentiering, aspirere medierne og erstatte med dage 4-12 neurodectoderm medier. Skift medierne dagligt.</li>
		<li>Efter 12 dages differentiering bør differentierede celler udtrykke passende markører for neurale stamceller (NPC'er). NPCs kan vedligeholdes yderligere i neurale medier, der indeholder DMEM/F-12, 2% B-27,5% N-2, og suppleret med 10 μg/mL grundlæggende fibroblast vækstfaktor (bFGF). Passage NPCs når flydende ved hjælp af en celle løsrivelse løsning, plating NPCs på 0.5-1 x 106 celler per brønd.</li>
	</ol></li>
	<li>Oligodendrocyte progenitorcelle differentiering (tilpasset fra Douvaras og Fossati34)<ol>
<li>PSCs pladen, som beskrevet ovenfor, med en densitet på 1 x 105 pr. brønd på coatede 6 brønd plader i stamcelle medier, der indeholder en klippe hæmmer.</li>
		<li>Forbehandl celler med DMSO som beskrevet ovenfor for 2D-kulturer.</li>
		<li>Forbered SB431542, LDN193189, All-Trans retinoinsyre (RA), og udjævnet agonist (SAG) stamopløsninger.</li>
		<li>Forbered dage 0 – 8 differentierings medier ved at supplere DMEM/F-12 med 10 μM SB431542, 250 nM LDN193189 og 100 nM RA.</li>
		<li>Efter DMSO forbehandling, inkubere celler med differentierings medier i 8 dage, skiftende medier dagligt med frisk tilsat differentierings faktorer (f. eks. 2 mL pr. brønd af en 6-brønd plade).</li>
		<li>På dag 8 skal du udskifte mediet med DMEM/F-12, der indeholder 1x MEM ikke-essentielle aminosyrer (NEAA) opløsning, 1X L-glutamin, 2-mercaptoethanol, penicillin/streptomycin og 1x N-2 suppleret 100 nM RA og 1 μM SAG. Skift medierne dagligt.</li>
		<li>Efter 12 dages differentiering bør differentierede celler udtrykke passende markører for oligodendrocyte progenitorceller (OPCs).</li>
	</ol></li>
	<li>Differentiering af endokrine progenitorceller (tilpasset fra Pagliuca et al.35)<ol>
<li>Seed PSCs ved 6 x 105 celler/ml i stamcelle medier plus 10 μM klippe hæmmer i 500 ml spinner kolber placeret på en 9-positions omrøring sat i rotationshastighed på 70 rpm i en 37 °c inkubator, 5% Co2og 100% fugtighed.</li>
		<li>Tillad klynger at bosætte sig i bunden af kolben, aspirere medierne, derefter forbehandle med 1%-2% DMSO.</li>
		<li>Forbered Activin A, Chir99021, KGF, Sant1, All-Trans retinoinsyre (RA), LDN193189, PdBU, XXI, Alk51, T3 og Betacelluin Stock Solutions.</li>
		<li>Forbered differentierings base mediet baseret på formuleringen i tabel 3.</li>
		<li>Efter DMSO forbehandling skal der aspirere medier og udskiftes med S1-medier suppleret med 100 ng/mL Activity A og 3 mM Chir99021 (f. eks. 500 mL pr. kolbe). Tillad inkubation i 24 timer.</li>
		<li>På dag 2 skal du udskifte mediet med S1-medier suppleret med 100 ng/mL Activity A. Tillad inkubation i 2 dage.</li>
		<li>På dag 4 skal du udskifte mediet med S2-medier suppleret med 50 ng/mL KGF. Lad inkubation i 3 dage, skiftende medier efter de første 2 dage (dag 6).</li>
		<li>På dag 7 skal du udskifte mediet med S3-medier suppleret med 50 ng/mL KGF, 0,25 mM Sant1, 2 mM RA og 200 nM LDN193189. Tillad inkubation i 24 timer.</li>
		<li>På dag 8 skal du udskifte mediet med S3-medier suppleret med 50 ng/mL KGF, 0,25 mM Sant1, 2 mM RA, 200 nM LDN193189 og 500 nM PdBU. Tillad inkubation i 24 timer.</li>
		<li>På dag 9 skal du udskifte mediet med S3-medier suppleret med 50 ng/mL KGF, 0,25 mM Sant1 og 100 nM RA. Lad inkubation i 5 dage, skiftende medier hver 2 dage (dag 11 og 13).</li>
		<li>På dag 14 og 16, Udskift medier med S5 medier suppleret med 0,25 mM Sant1, 100 nM RA, 1 mM XXI, 10 mM Alk5i II, 1 mM T3, og 20 ng/mL betacellulin (4 dage total inkubation).</li>
		<li>På dag 18 og 20, Udskift medier med S5 medier suppleret med 25 nM RA, 1 mM XXI, 10 mM Alk5i II, 1 mM T3, og 20 ng/mL betacellulin.</li>
	</ol></li>
</ol>5. immunocytochemical validering af differentiering
Bemærk: Følgende metoder beskriver en generel immunocytochemical protokol, der kan justeres efter behov. Primære antistoffer er dem, der tidligere er blevet valideret i vores laboratorium. Andre teknikker til validering af differentiering kan også anvendes (f. eks. flow cytometri, qPCR, RNA-sekvensering, Western-blotting, funktionelle assays osv.).
<ol><li>
Immunolabeling-celler
	<ol>
<li>For 3D-kulturer i suspension, plade hele celle klynger eller klynger spredt i enkelt cellesuspension på belagte plader til 18-24 h før fiksering.</li>
		<li>Aspirer medier fra vedsiddende celler, og vask kortvarigt med PBS ved RT på en shaker.</li>
		<li>Til celle fiksering, Aspirér PBS og der inkuberes ved celler med 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i PBS i 20 min ved rt på shaker. Forsigtig: PFA-bestanden skal tilberedes under en stinkhætte på grund af dens toksicitet. Inhalér og bær ikke korrekt personligt beskyttelsesudstyr.</li>
		<li>Fjern PFA og kassér i den rigtige beholder til kemisk affald.</li>
		<li>Vask cellerne 3x med PBS i mindst 5 minutter pr. vask ved RT på en shaker.</li>
		<li>For celle permeabilisering og blokering, der inkuberes ved celler med 5% æsel serum udarbejdet i 0,3% Triton-x 100/PBS for 1 h ved rt på en shaker.</li>
		<li>Forbered primær antistof opløsning i den samme opløsning, der anvendes til permeabilisering/blokering.</li>
		<li>Inkuber i primær antistof opløsning natten over ved 4 °C på shaker.</li>
		<li>Efter natten inkubation, vask cellerne 3x med PBS i mindst 5 min per vask på RT på en shaker.</li>
		<li>Forbered sekundær antistof opløsning i permeabilisering/blokerende opløsning.</li>
		<li>Gør det muligt at inkubere i sekundær antistof opløsning i 1 time ved RT på en shaker.</li>
		<li>Aspirer sekundær antistof opløsning, og vask cellerne 3x med PBS i mindst 5 minutter pr. vask ved RT på en shaker.</li>
		<li>Inkubér celler med DAPI eller en anden foretrukken markør for passende inkubattid, og skyl i PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kvantificering af billeder
	<ol>
<li>Erhverve mindst tre billeder pr. tilstand på et fluorescerende mikroskop og/eller med en høj indholds screening platform.</li>
		<li>Kvantificere procentdelen af positive celler for hver markør ved at tælle det samlede antal antistof farvede celler og det samlede celleantal (baseret på DAPI/Hoechsts farvning) ved hjælp af objektiv billedsoftware (f. eks. ImageJ) eller en automatiseret screening platform for Analyser.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Sammenfattende beskriver denne protokol et simpelt og billigt værktøj til at øge differentierings kapaciteten for pluripotente stamceller (kvikskranker) til alle primære kimlag, forskellige typer af specialiserede stamceller og endda funktionelle, modne celletyper i in vitro og in vivo-indstillinger. Illustreret er specifikke differentierings protokoller, der er blevet effektivt gengivet i vores laboratorium såvel som andre, men enhver differentiering protokol valg kan anvendes efter DMSO behandling. Som vist i tabel 1har en række laboratorier også påvist en forbedring af PSC-differentieringen efter forbigående DMSO-behandling ved hjælp af forskellige paradigmer til at generere forskellige andre terminal celletyper. Selv om metoderne her beskriver brugen af menneskelige kvikskranker, kan DMSO-forbehandlingen udnyttes på tværs af arter og har vist sig at være effektiv i mus, kanin og primat PSCs.
Selv om højere doser af DMSO vides at være cytotoksiske, er de lave doser, der anvendes i denne metode (1%-2%) for en forbigående periode resultere i minimal celledød. Mens det samlede celleantal umiddelbart efter DMSO-behandlingen kan falde på grund af DMSO-fremme af celle cyklus anholdelse i G1-fasen af cellecyklussen, viser tidligere undersøgelser, at cellerne er i stand til at nå det samme niveau af konfluency som kontrolkulturer efter fjernelse af DMSO3.
Procent og varighed af DMSO forbehandling skal optimeres pr. cellelinje. Behandlingstiden bør justeres med hensyn til cyklenes/fordoblings tiden for cellerne. For eksempel, mus kvikskranker typisk har meget kortere cykel tider på omkring 15 h; således, DMSO behandling for 15 h for disse celler er tilstrækkelig. Nogle laboratorier har også fundet, at DMSO-behandlingen er gavnlig, når den fortsættes under differentierings protokollen eller ved lavere koncentrationer (Se tabel 1). Det skal bemærkes, at nogle PSC-linjer er mere ændrede for differentiering til specifikke lineages. For eksempel har HUES6 celler vist sig at være mindre eftergivende for differentiering og dermed havde markant forbedring med DMSO behandling (figur 2). Alternativt har HUES8 celler, der anvendes i figur 4 og figur 5 , vist sig at have en højere tilbøjelighed til epitel differentiering; der blev således påvist færre forskelle mellem kontrol og DMSO for differentiering i de indledende faser i retning af definitive endoderm. Ikke desto mindre observeres forbedringen af DMSO-forbehandling i senere stadier af differentieringen i denne cellelinje (figur 4B). DMSO-behandlingen er også alsidig, fordi den er effektiv i både 2D-og 3D-cellekulturer, den kan bruges med forskellige typer belægningsmateriale på cellekultur plader, og den virker i forskellige typer af vedligeholdelses medium, der fremmer vækst og ekspansion af hPSCs (f. eks. mTeSR, E8, MEF-konditionerede medier osv.).
Mere generelt tyder disse resultater på, at udgangstilstanden for pluripotente stamceller har en stærk indflydelse på tilbøjeligheden til indledende differentiering samt terminal differentiering i funktionelle celletyper. Vi har tidligere vist, at DMSO-behandlingen fungerer via RB i hpscs3,5. RB spiller en vigtig rolle i at fremme terminal differentiering, celle overlevelse, og den genetiske stabilitet af cellerne41,42,43,44, og det kan derfor forklare de vedvarende virkninger på celler forskellige fra DMSO-behandlede hPSCs. Målretning af disse tidlige reguleringsformer kan sætte hPSCs på en bedre bane for differentiering og i sidste ende forbedre deres anvendelighed til regenerativ medicin.

Brugen af pluripotente stamceller har ført til talrige fremskridt inden for biomedicinsk forskning, herunder områder med regenerativ medicin og stamcelle baserede terapier, sygdoms modellering og lægemiddel screening. Det har også ført til en samlet udsigt til mere translerbar forskning og personlig medicin. Fremkomsten af induceret pluripotente stamcelle (iPSC) teknologi for over 20 år siden har gjort det muligt for forskere at udvikle pluripotente stamceller fra somatiske væv og differentiere dem i funktionelle celletyper til at studere en række patologier, herunder kardiovaskulære, neurologiske og immunologiske sygdomme. Selv om der er gjort betydelige fremskridt med hensyn til stamcelle differentierings teknologi, fortsætter udfordringerne med effektivt at differentiere humane embryonale stamceller (hESCs) og iPSCs, hvilket begrænser den udbredte anvendelse af stamcelleteknologi på tværs af forskellige forskningsprogrammer. Iboende variation på tværs af forskellige cellelinjer og kloner fortsætter med at udgøre forhindringer for differentiering af stamcellelinjer til ønskede linages1. Desuden er det at udlede modne, terminalt differentierede funktionelle celler fra hPSCs fortsat en kedelig og ineffektiv proces på tværs af mange lineages. I virkeligheden, celler differentieret fra hPSCs ofte undlader at terminalt differentiere i funktionelle celler2. I yderligere bevægelige stamcelle-baserede terapier til brug hos patienter, der er behov for at forbedre og sikre effekten af celler, der er genereret fra hPSCs.
Vores laboratorium har etableret et hurtigt, billigt værktøj til markant at forbedre effektiviteten af at differentiere både iPSCs og ESCs i modne celletyper. Vi konstaterede, at forbehandling af hiPSCs og hESCs med det almindeligt anvendte reagens dimethylsulfoxid (DMSO) i 24 timer til 48 h forud for målrettet differentiering resulterer i en markant forbedring af stamcelle differentierings kapaciteten. Behandling med DMSO øger andelen af hipscs og hESCs i den tidlige G1 fase af cellecyklussen og aktiverer Retinoblastom protein (RB)3, en kritisk regulator af celle proliferation, overlevelse og differentiering4. I nyere tid har det været konstateret, at RB og dets familiemedlemmer er nødvendige for de Pro-differentierings effekter af DMSO, således at forbigående inaktivering af RB undertrykker virkningerne af DMSO, mens konstitutiv aktivering af RB på en transient måde øger DMSO'S effekter5. Analogt med cellen cyklus under fosterudvikling, celle cyklus af ESCs og ipscs er karakteriseret ved en forkortet G1 fase, der fremmer selvfornyelse6,7,8. Denne forkortede G1-fase giver mulighed for mere ubegrænset spredning, men begrænser mulighederne for differentiering4,9. Ved at fremme vækst anholdelse i G1 og aktivere check point kontrol i cellen cyklus af hESCs og ipscs, DMSO behandling primtal celler for celle skæbne ændringer efter instrueret differentiering.
Til dato har DMSO forbehandling vist sig at forbedre differentierings kapaciteten til alle tre kimlag i over 30 kontrol-og sygdomsspecifikke humane ESC-og IPSC-cellelinjer3,5 samt differentiering af stamceller og andre cellelinjer til en række andre modne celletyper i efterfølgende undersøgelser10,11,12,13,14,15,16, 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 (tabel 1). Desuden har DMSO-behandling vist sig at være effektiv til at øge differentieringen af ikke-humane primærceller21,23 (f. eks. mus, primat, kanin), hvilket tyder på fælles mekanismer på tværs af arter. Endelig, DMSO forbehandling er også blevet udvidet til genteknologi, med en bestemt undersøgelse, der viser, at 24 h DMSO forbehandling af hESCs/iPSCs signifikant øget evne til Clustered regelmæssigt Interspaced korte Palindromic gentagelser (CRISPR) /CRISPR-associated protein-9 (Cas9)-medieret redigering effektivitet af ikke-kodning DNA uden at indarbejde utilsigtede mutationer29. Forudsat her er en detaljeret metode til DMSO forbehandling af hESCs og iPSCs til anvendelser i stamcelle biologi og målrettet differentiering.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:651px;" width="651">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">21985023</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">9-Position stir plate&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Chemglass</td>
			<td style="width:135px;">CLS-4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Accutase</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">11105-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Activin A</td>
			<td style="width:135px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>338-AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Advanced RPMI</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">12633012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alk5i II</td>
			<td style="width:135px;">Axxora</td>
			<td style="width:135px;">ALX-270-445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">all-trans retinoic acid&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-Brachyury</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">AF2085</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:215px;">anti-C-peptide</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:135px;">GN-ID4</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-FoxA2</td>
			<td style="width:135px;">Millipore</td>
			<td>07-633</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-Nkx2.2</td>
			<td>University of Iowa, Developmental Hybridoma Bank</td>
			<td>74.5A5</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-Nkx6.1</td>
			<td>University of Iowa, Developmental Hybridoma Bank;&#160;</td>
			<td style="width:135px;">F55A12-supernatant</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-Olig2</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:135px;">MABN50</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-Pax-6</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td style="width:135px;">901301</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-Pdx1</td>
			<td style="width:135px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>AF2419</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-SOX1&#160;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">AF3369</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-SOX17</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">AF1924</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:215px;">B-27 Supplement, minus Vitamin A</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">basic fibroblast growth factor</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>PHG0264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Betacellulin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>50932345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chir99021</td>
			<td style="width:135px;">Stemgent</td>
			<td>04-000-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">CMRL 1066</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">99-603-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:215px;">Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td style="width:135px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:135px;">AMQAF1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:135px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:135px;">G7528&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">DAPI</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:135px;">D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Disposable Spinner Flasks</td>
			<td style="width:135px;">Corning, VWR</td>
			<td style="width:135px;">89089-814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">DMEM/F-12</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">DMSO&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Essential 6 Media</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>A1516501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">FAF-BSA</td>
			<td style="width:135px;">Proliant&#160;</td>
			<td style="width:135px;">68700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">FGF7</td>
			<td style="width:135px;">PeproTech</td>
			<td style="width:135px;">100-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Geltrex</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>A1413202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">GlutaMAX&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Heparin&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:135px;">H3149&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Ultrasensitive Insulin ELISA</td>
			<td>ALPCO Diagnostics</td>
			<td>80-INSHUU-E01.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">ITS-X</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:135px;">51500056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KGF</td>
			<td style="width:135px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">AF-100-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Knockout DMEM</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>10829018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">KnockOut Serum Replacement</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-3,3&#8242;,5-Triiodothyronine (T3)</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:135px;">642245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">LDN193189</td>
			<td style="width:135px;">Stemgent</td>
			<td>04-0074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Matrigel Matrix</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MCDB-131&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Cellgro&#160;</td>
			<td style="width:135px;">15-100-CV&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">MEM NEAA</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:215px;">mTeSR 1</td>
			<td style="width:135px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:135px;">5850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">N2 Supplement</td>
			<td style="width:135px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:135px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:135px;">S3817&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Noggin Fc Chimera Protein</td>
			<td style="width:135px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">3344-NG-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PdBU</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:135px;">524390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Mediatech&#160;</td>
			<td style="width:135px;">30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">RPMI</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sant1</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">S4572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SB431542</td>
			<td style="width:135px;">Stemgent</td>
			<td>04-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Smoothened Agonist, SAG</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td>566660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">StemPro Accutase</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>A1110501&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">TrypLE</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">12604013</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:215px;">Ultra-Low Attachment Microplates</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td>3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Vitamin C</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">A4544&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Wnt3a</td>
			<td style="width:135px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>5036-WN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">XAV 939</td>
			<td style="width:135px;">Tocris</td>
			<td style="width:135px;">3748</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">XXI</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:135px;">565790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Y-27632</td>
			<td style="width:135px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:135px;">72302</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transient treatment of human pluripotent stem cells with dmso to promote differentiation

På trods af den stigende anvendelse af pluripotente stamceller (kvikskranker) er udfordringerne i en effektiv differentiering af embryonale og inducerede pluripotente stamceller (esc'er og ipscs) på tværs af forskellige nedstamningens fortsat. Talrige differentierings protokoller er blevet udviklet, men variabilitet på tværs af cellelinjer og lave differentierings rater er en udfordring for en vellykket gennemførelse af disse protokoller. Beskrevet her er en nem og billig måde at øge differentierings kapaciteten af kvikskranker. Det har tidligere vist sig, at behandling af stamceller med en lav koncentration af dimethylsulfoxid (DMSO) øger tilbøjeligheden af en række kvikskranker til at differentiere til forskellige celletyper efter målrettet differentiering. Denne teknik har nu vist sig at være effektiv på tværs af forskellige arter (fx mus, primat, og menneske) i flere lineages, lige fra neuroner og kortikale sfæroider til glatte muskelceller og hepatocytter. DMSO-forbehandlingen forbedrer PSC-differentieringen ved at regulere cellecyklussen og priming af stamceller for at være mere lydhør over for differentierings signaler. Forudsat her er den detaljerede metode til at bruge dette enkle værktøj som en reproducerbar og bredt anvendelige midler til mere effektivt at differentiere kvikskranker til enhver slægt af valg.

Morfologi af DMSO-behandlede iPSCs Humane ipscs afledt af kontrol emner blev dyrket enten i en overholder 2D-enkeltlags eller i 3D-celle kugler i suspension. Ca. 24 timer efter første belægning blev cellerne behandlet med enten 1% eller 2% DMSO i 24 timer i vedligeholdelses mediet. Repræsentative lysfelt-billeder efter DMSO-behandling er vist i figur 1. I overensstemmelse med tidligere rapporter for ipscs, der blev opretholdt i et enkeltlags3, resulterede DMSO-forbehandling i en forbigående dosisafhængig fald i vækstraten sammenlignet med ikke-DMSO-behandlede celler (figur 1a). Denne nedsatte spredning er forbundet med en stigning i celle-til-celle kontakt, som er særligt udtalt i de 2% DMSO-behandlede celler, der viser øget dannelse af mere stærkt klyngeopdelte celle kolonier. I andre celletyper har DMSO-induceret G1 anholdelse vist sig at være forbundet med øget ekspression af proteiner involveret i celle-celle interaktioner, der understøtter kontakt-hæmning induceret vækst anholdelse36. I iPSCs vedligeholdt som 3D-celle kugler øgede DMSO-behandlingen også antallet af celle kugler (figur 1B). Desuden resulterede DMSO-behandling også i mindre variable 3D Sphere størrelser, som tidligere har vist sig at være tegn på forbedret differentierings evne af cellerne37. Det er vigtigt, at hverken 1% eller 2% DMSO resulterede i celletoksicitet, målt ved levedygtighed tæller (n = 3; 2D-kultur% Live = kontrol: 80 ± 1,3; 1% DMSO: 82 ± 3,7, 2%: 81 ± 2,7; 3D-kultur% Live = kontrol: 81 ± 4,3; 1% DMSO: 82 ± 6,7, 2%: 82 ± 2,7). Samlet set er disse resultater i overensstemmelse med forestillingen om, at DMSO-behandling ændrer cellecyklussen og vækst mønstrene i dyrkede stamceller. Disse virkninger på væksthæmning er reversible, når DMSO fjernes fra mediet, som tidligere vist3.
DMSO-behandling forbedrer differentieringen af Esc'er til de primære kimlag HUES6 hESCs blev seedet på coatede plader i 24 timer efterfulgt af behandling med 2% DMSO i 24 timer i vedligeholdelses mediet. Cellerne blev derefter differentieret i de tre primære kimlag efter behandlings paradigmer vist i figur 2A30,31,32. Differentierede celler blev derefter fikseret og immunologisk farves for prototypiske markører for hvert af de respektive kimlag (SOX17 for endoderm, brachyury for mesoderm og SOX1 for ectoderm). Som vist i figur 2B, 24 h af forbehandling med 2% DMSO øget andelen af celler, der udtrykker hver respektive kimlag markør. Dette er i overensstemmelse med tidligere rapporter fra vores laboratorium, der viser øget immunoreaktivitet, genekspression, samt absolutte antal differentierede celler mod alle kimlag i stamceller behandlet med DMSO3,5. HUES6 er en hesc linje med meget lav tilbøjelighed til differentiering på tværs af alle nedstamningens1, men DMSO behandling forbedrer væsentligt sin evne til at skelne på tværs af alle kimlag.
DMSO-behandling forbedrer differentieringen til stamcelle typer For at undersøge virkningen af DMSO på differentiering til CNS-stamcelle typer blev humane iPSCs differentieret til enten neurale stamceller (NPCs) eller oligodendrocyte stamceller (OPCs). For at generere NPCs blev cellerne forbehandlet med 2% DMSO i 24 timer i vedligeholdelses mediet efterfulgt af 12 dages styret differentiering33 (figur 3A). Som vist i figur 3B, 2% DMSO forbehandling øget EKSPRESSION af NPC markør PAX6 i forhold til kontrol. Ved hjælp af en anden tidligere valideret protokol34 (figur 3C) blev ipscs differentieret i 12 dage i OPCs. Svarende til NPCs, OPCs afledt af iPSCs forbehandlet med 2% DMSO for 24 h viste en stigning andel af celler, der udtrykker OPC markører OLIG2 (figur 3D).
En indledende DMSO-behandling fortsætter med at øge differentieringen i modne celletyper For at undersøge virkningen af DMSO på de sidste stadier af en differentierings protokol blev HUES8 hESCs forbehandlet i 24 timer med 2% DMSO før differentiering til β-celler efter en 20-dages styret differentierings protokol beskrevet i figur 4a 35. HUES8 blev anvendt, da de tidligere har vist sig at have en højere tilbøjelighed til epitel afstamning1,38. På den endelige endoderm fase, de differentierede celler Express SOX17 og FOXA2, definitive endoderm (DE) specifikke markører. Med yderligere differentiering i bugspytkirtlen forfædre (PP1) fase, differentierede celler Express PDX1 og FOXA2, markører karakteristisk for bugspytkirtel stamceller. På disse stadier af bugspytkirtel Celledifferentiering var effektivitetsgevinsterne ved induktion i DE og derefter i PP1 høj for både kontrol-og DMSO-behandlede hesc'er, der var differentieret i hver af disse stadier (figur 4B, trin 1 og 3). selv om HUES8 celle linjen er blevet bemærket at have øget tilbøjelighed til at differentiere sig i den epitel afstamning, som differentiering er induceret yderligere i de mere specialiserede celletyper i de terminale stadier de DMSO-behandlede hESCs er meget mere tilbøjelige til at producere modne bugspytkirtel endokrine celler. Effektivitetsgevinsterne ved generering af PDX1/NKX 6.1 + pancreasstam celler, Neuro Genin 3 + endokrine celler og NKX 6.1/C-peptid + SC-β-celler var væsentligt højere i de DMSO-behandlede Hesc'er (figur 4B, trin 4 og 5). Disse resultater er i overensstemmelse med NPC og OPC differentiering viser, at DMSO øger differentierings potentialet til stamceller celletyper og viser også, at virkningen af DMSO er vedholdende i at generere mere specialiserede celletyper. Dette er i overensstemmelse med tidligere arbejde, hvor vi har vist, at den indledende 24 h DMSO behandling øger differentiering i Terminal celletyper på tværs af kimlag, herunder i neuronal celler samt slå kardiomyocytter31,39 i cellelinjer med høje eller dårlige tilbøjeligheder til differentiering3.
Initiale DMSO-behandling forbedrer hESC-afledt celle funktion efter in vivo -transplantation Tidligere har vi demonstreret effektiviteten af DMSO behandling i at øge differentieringen af hESCs til funktionelle bugspytkirtel stamceller, der senere viser en markant forbedring i insulinsekretionen in vivo3. Ved hjælp af tidligere udgivne protokoller3,30,40, HUES8 hESCs blev behandlet med 1% DMSO for 24 h, differentieret i bugspytkirtel stamceller, og transplanteres i immunodedygtige scid-beige mus til at vurdere (f. eks. insulinsekretion som reaktion på en glucoseudfordring eller KCl-stimulation) (figur 5a). Mens effektivitetsgevinsterne ved differentiering i FOXA2 + (~ 90%) og PDX1 + (~ 75%) pancreasprogenitorer var sammenlignelige mellem kontrol og DMSO-behandlede hESCs (figur 5B) for HUES8 hesc-linjen, var de celler, der var differentieret fra hESCs efter en 24-timers 1% DMSO-behandling, forbedret respons på glukose og KCl stimulation efter in vivo-transplantation. Forbedringer i funktionaliteten var tydelig inden for 2 uger efter transplantation (figur 5C) og varede op til mindst 16 uger efter transplantation (figur 5D). Tilsammen tyder disse resultater på, at DMSO-forbehandling ikke blot øger differentierings effektiviteten for kimlag, stamceller og mere modne celletyper, men også at den fortsætter med at forbedre funktionaliteten af de differentierede celler in vivo.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Differentieret celle type</td>
			<td>Start af celle type</td>
			<td>% DMSO</td>
			<td>Varighed af DMSO-behandling</td>
			<td>Varighed af DMSO-behandling</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hepatiske celler</td>
			<td>Esc Hepatoma-cellelinje Esc Esc Mesenchymal stamceller iPSCs Esc Esc Hepatoma-cellelinje Esc</td>
			<td>1,0 1,0 1,0 0,5 0.1-2.0 1,0 1,0 0,5 1,0 0,6</td>
			<td>8 dage Flere dage 7 dage 10-14 dage 7-21 dage 7 dage 4 dage 5 dage 2-21 dage Hele</td>
			<td>Basma et al., 2008 Kanebratt og Andersson, 2008 Hay et al., 2009 Duan et al., 2010 Alizadeh et al., 2014 Kondo et al., 2014 Szkolnicka et al., 2014 Czysz et al., 2015 Nikolaou et al., 2016 Vanhove et al., 2016</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primære kimlag</td>
			<td>ESCs og iPSCs Af Af</td>
			<td>0.1-2.0 0,5 0.1-2.0</td>
			<td>24 timer 24 timer 24 timer</td>
			<td>Chetty et al., 2013 Chetty et al., 2015 Li et al., 2018</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hjerte celler</td>
			<td>ESCs og iPSCs P19 celler ESCs og iPSCs Føtal mesenchymal stamceller</td>
			<td>0.1-2.0 1,0 1.0-2.0 0,8-1,0</td>
			<td>24 timer 4 dage 24-30 timer 24 timer</td>
			<td>Chetty et al., 2013 Choi et al., 2014 Van den Berg et al., 2016 Deng et al., 2017</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pancreasceller</td>
			<td>ESCs og iPSCs Af</td>
			<td>0.1-2.0 0,5</td>
			<td>24 timer 24 timer</td>
			<td>Chetty et al., 2013 Chetty et al., 2015</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glatte muskelceller</td>
			<td>P19 celler</td>
			<td>1,0</td>
			<td>4 dage</td>
			<td>Choi et al., 2014</td>
		</tr>
<tr>
<td>Endotelceller</td>
			<td>P19 celler</td>
			<td>1,0</td>
			<td>4 dage</td>
			<td>Choi et al., 2014</td>
		</tr>
<tr>
<td>Enterocytcellerne</td>
			<td>iPSCs</td>
			<td>0-1.6</td>
			<td>4 dage</td>
			<td>Ogaki et al., 2015</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tarm epitelet</td>
			<td>iPSCs</td>
			<td>0-1.6</td>
			<td>4 dage</td>
			<td>Ogaki et al., 2015</td>
		</tr>
<tr>
<td>Neurale celler</td>
			<td>Marmoset iPSC</td>
			<td>0.05-2.0</td>
			<td>24 timer</td>
			<td>Qiu et al., 2015</td>
		</tr>
<tr>
<td>Neutrofiler</td>
			<td>Leukæmi cellelinje</td>
			<td>1,25</td>
			<td>6-8 dage</td>
			<td>Teimourian og Moghanloo, 2016</td>
		</tr>
<tr>
<td>Skelet-Myotubes</td>
			<td>iPSCs</td>
			<td>1,5</td>
			<td>24 timer</td>
			<td>Swartz et al., 2016</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kortikale organoid</td>
			<td>hiPSCs</td>
			<td>1,0</td>
			<td>24 timer</td>
			<td>Yoon et al., 2018</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Resumé af tidligere publiceret arbejde, som påviser de gavnlige virkninger af DMSO-behandling på differentiering.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>S1</td>
			<td>S2</td>
			<td>S3</td>
			<td>S5</td>
		</tr>
<tr>
<td>MCDB131 (L)</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glucose (g)</td>
			<td>0,44</td>
			<td>0,44</td>
			<td>0,44</td>
			<td>3,6</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO3 (g)</td>
			<td>2,46</td>
			<td>1,23</td>
			<td>1,23</td>
			<td>1,754</td>
		</tr>
<tr>
<td>FAF-BSA (g)</td>
			<td>20</td>
			<td>20</td>
			<td>20</td>
			<td>20</td>
		</tr>
<tr>
<td>ITS-X (mL)</td>
			<td>0,02</td>
			<td>0,02</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glutamax (mL)</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>C-vitamin (mg)</td>
			<td>44</td>
			<td>44</td>
			<td>44</td>
			<td>44</td>
		</tr>
<tr>
<td>Heparin (mg)</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>P/S (mL)</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: komponenter i endokrine progenitorcelle differentierings base Medias.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59833/59833fig1.jpg"> Figur 1 : DMSO-behandling ændrer væksten af hPSCs. (A) repræsentative lysfelt billeder af hipscs belagt i et enkeltlags efter at have modtaget nogen behandling (kontrol) eller behandling med 1% eller 2% DMSO for 24 h. DMSO fremmer en forbigående dosisafhængig væksthæmning af ipscs. (B) repræsentative lysfelt billeder af hipscs belagt på lav-fastgørelse plader til at tillade 3D sfære dannelse efter at have modtaget nogen behandling (kontrol) eller behandling med 1% eller 2% DMSO for 24 h. DMSO behandling resulterer i mindre variabel 3D Sphere formation sammenlignet med kontrol. Scale bar = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59833/59833fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59833/59833fig2.jpg"> Figur 2 : DMSO-behandling forbedrer differentieringen af hPSCs til primære kimlag. A) skematisk differentiering af protokoller, der anvendes til at generere de tre primære kimlag. B) repræsentative billeder af differentierede HUES6 hESCs immunolabeled for SOX17 (endoderm), brachyury (mesoderm) og SOX1 (ectoderm). Forbehandling med 2% DMSO for 24 h øgede differentierings effektiviteten på tværs af alle tre kimlag. Procentdele af celler, der differentierer til SOX17 + endodermal, Brachyury (Brachy) + mesodermal eller SOX1 + ectodermal celler efter målrettet differentiering i hvert kimlag af kontrol og DMSO-behandlede Hesc'er, noteres med SEM af tre biologiske replikater . Uparret t-test: endoderm p = 0,0003; mesoderm p = 0,047; ectoderm p = 0,015. Scale bar = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59833/59833fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59833/59833fig3.jpg"> Figur 3 : DMSO-behandling forbedrer differentieringen af neurale progenitorcelle typer. A) skematisk differentierings protokol, der anvendes til generering af neurale stamceller (NPC'er). (B) repræsentative billeder af humane ipscs differentieret i NPC'er immunolabeled for Pax6. 24 timer forbehandling med 2% DMSO øgede antallet PAX6 positive celler. Procentdele af celler, der differentierer til Pax6 + NPCs efter målrettet differentiering af kontrol og DMSO-behandlede humane iPSCs, noteres med SEM af tre biologiske replikater. Ikke-parret t-test: p = 0,0225. Scale bar = 200 μm.C) skematisk differentierings protokol, der anvendes til at generere oligodendrocyte stamceller (OPCs). (D) repræsentative billeder af humane ipscs differentieret i OPCs immunolabeled for OPC markører Olig2. 24 timer forbehandling med 2% DMSO øgede ekspression af begge OPC-markører sammenlignet med kontrol. Procentdele af celler, der differentierer til Olig2 + OPCs efter målrettet differentiering af kontrol og DMSO-behandlede humane iPSCs, noteres med SEM af fire biologiske replikater. Ikke-parret t-test: p = 0,0466. Scale bar = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59833/59833fig3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59833/59833fig4.jpg"> Figur 4 : DMSO-behandling forbedrer Terminal differentierings potentialet for hPSCs. (A) skematisk af en ~ 20 dag instrueret DIFFERENTIERING af HUES8 hESCs i terminalt differentierede bugspytkirtel endokrine celler. B) immun farvning for de indikerede markører på hvert trin i differentieringen efter målrettet differentiering af ubehandlede kontrol celler og celler, som er forbehandlet med 2% DMSO i 24 timer. Den initiale DMSO-behandling fortsætter med at øge differentieringen i de terminale endokrine celletyper i de sidste stadier af den rettede differentiering. Procentdele af celler, der differentierer til de angivne markører på hvert trin i differentieringen efter målrettet differentiering af kontrol og DMSO-behandlede Hesc'er, noteres med SEM på to til fire biologiske replikater. Scale bar = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59833/59833fig4large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59833/59833fig5.jpg"> Figur 5 : Initiel DMSO-behandling af hPSCs øger glucosereaktions evnen efter transplantation af pancreasstamceller in vivo. A) skematisk målrettet differentiering (~ 15 dage) af HUES8 hESCs til bugspytkirtel stamceller (PP2) efter ingen behandling (kontrol) eller en 24 h 1% DMSO-behandling og efterfølgende transplantation (5.000.000 celler) til immunodedygtig SCID-beige mus. B) procentdel af celler, som differentierer til PDX1 + og FOXA2 + pancreasstamceller efter in vitro-styret differentiering af kontrol-og DMSO-behandlede Hesc'er umiddelbart før transplantation (n = 1). C) gennemsnitlige Elisa-målinger af humant insulin fra serum fra mus efter en lav (2,5 mm) eller høj (15 mm) glukose udfordring eller kaliumchlorid (KCl) stimulation ved (C) 2 uger og (D) 16 uger efter transplantation af pancreas stamceller, som adskiller sig fra kontrol og DMSO-behandlede hESCs (fejlstænger = SEM; n = 3 efter 2 uger og 16 uger for kontrol; n = 2 efter 2 uger og 16 uger for DMSO). To-vejs ANOVA: p = 0,0051 for kontrol vs. DMSO efter 2 uger; p = 0,0116 for kontrol vs. DMSO efter 16 uger. Musene studerede på de forskellige tidspunkter er forskellige. Resultaterne er tilpasset fra Chetty et al.3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59833/59833fig5large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation at JoVE.com

Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation

Generering af differentierede celletyper fra humane pluripotente stamceller (hPSCs) rummer store terapeutiske løfter, men forbliver udfordrende. Kvikskranker udviser ofte en iboende manglende evne til at skelne, selv når de stimuleres med et korrekt sæt af signaler. Beskrevet her er et simpelt værktøj til at forbedre multi differentiering på tværs af en række PSC linjer.

Forbigående behandling af humane pluripotente stamceller med DMSO for at fremme differentiering

Despite the growing use of pluripotent stem cells (PSCs), challenges in efficiently differentiating embryonic and induced pluripotent stem cells (ESCs and ...

Det er en simpel behandling, der kan anvendes på enhver stamcellelinje eller differentiering protokol til prime celler til differentiering. Alt man skal gøre er at tilføje DMSO på 1-2% i cellekultur vedligeholdelse medium. Den største fordel ved denne teknik er det giver mulighed for at øge differentiering potentiale pluripotente stamceller i enhver afstamning af valg ved priming celler til differentiering.DMSO behandling øger chancen for, at celler vil skelne fra patient-afledte iPSCs, så de kan bruges til celle substitutionsterapi, sygdom modellering, og narkotika screening. Det kan give anledning til en tidlig indtræden af regulering, der styrer subspredning, differentiering og specifikation under embryonal udvikling. Vi har vist, at DMSO-behandlingen forbedrer differentieringen i næsten 50 menneskelige embryonale og inducerede pluripotente stamcellelinjer.Mens andre laboratorier har vist, at det er gavnligt for stamceller af andre arter, såsom mus og primat. En dag før differentieringsdebutet tilsættes DMSO ved en koncentration på 1 eller 2% i 24 timer i dit typiske vedligeholdelsesmedium. 24 timer efter DMSO-behandlingen skal du udskifte mediet og fortsætte med din sædvanlige differentieringsprotokol.Dyrk celler i henhold til manuskript retninger. Når cellerne når en passende sammenløb, adskille dem og forberede en enkelt celle suspension. Tæl de levende celler med et hæmocytometer eller automatisk celletæller ved hjælp af en levedygtighedsmarkør som f.eks.For at opnå 80-90% sammenløb inden for 24-timers DMSO forbehandling, plade cellerne på en belagt seks-brønd plade på en tæthed på 500, 000 til 1 million celler pr brønd. Inkuber cellerne i 24 timer ved 37 grader Celsius i en kuldioxidinkubator. Derefter indsugning medierne og erstatte det med en 1-2% DMSO løsning.Lad cellerne inkubere i 24-28 timer før differentiering. Hvis der inkuberes i 48 timer, skal mediet udskiftes efter 24 timer med frisk DMSO-opløsning. For at opnå 3D kultur differentiering, vokse og indsamle cellerne i en celle suspension.Tæl de levende celler og plade dem i en ubestrøget, lav-vedhæftet seks-godt plade i stamcellemedier med ROCK-hæmmer. Typisk vil 3D-menneskelige pluripotente stamceller kugler dannes inden for 24 timer. Lad cellerne inkubere i 24 timer ved 37 grader Celsius i en kuldioxidinkubator.Forbered 1-2% DMSO i forvarmte stamcellemedier i henhold til manuskriptretninger. For at erstatte mediet efter inkubation skal pladen vippes til en vinkel på 30 grader til 45 grader og lade cellekuglerne sætte sig i bunden af brønden. Inspirer mediet fra cellerne, og suspension dem forsigtigt i DMSO-opløsningen.Lad cellerne inkubere i 24-48 timer ved 37 grader Celsius i en kuldioxid inkubator. Forbevar celler med DMSO som beskrevet for 2D-kulturer, og forbered noggin- og SB431542-lagerløsninger. Forbered nok 10% knockout serum udskiftning, eller KOSR, i knockout DMEM i tre til fire dages medieskift.Forbered ectodermal differentiering medier ved at tilføje noggin og SB431542 til pre-opvarmet KOSR knockout DMEM som beskrevet i manuskriptet. Efter DMSO forbehandling, aspirere medier fra celler og tilføje to milliliter differentiering medier til hver brønd. Lad cellerne inkubere i tre til fire dage ved 37 grader Celsius i en kuldioxid inkubator, erstatte medierne dagligt med friske differentieringsfaktorer.DMSO-forbehandling resulterer i et forbigående og dosisafhængigt fald i cellevækstraten sammenlignet med ikke-behandlede celler. Dette fald spredning er forbundet med en stigning i celle-til-celle kontakt, som er særligt udtalt i 2% DMSO-behandlede celler. Når cellerne er fastgjort og farves for prototypiske markører for hvert kimlag, kan det ses, at 2% DMSO forbehandling resulterer i øget andel af differentierede kimlagceller.For eksempel blev SOX17 farves for at visualisere endoderm celler. For at undersøge virkningen af DMSO på differentiering til centralnervesystemet stamcelletyper, human-induceret pluripotente stamceller kunne differentieres i enten neurale progenitor celler eller oligodendrocyte progenitor celler. Sammenlignet med kontrolceller øger 2% DMSO forbehandling ekspressionen af neurale progenitorcellemarkør Pax6.Tilsvarende forbehandling øger andelen af celler, der udtrykker oligodendrocyte stamcellemarkør Olig2. Desuden forbedrer den indledende DMSO-behandling den humane embryonale stamcellefunktion efter in vivo-transplantation. Når differentierede pancreas progenitor celler transplanteres til immundefekte mus, deres funktionalitet kan testes som reaktion på en glukose udfordring eller KCl stimulation.Forbedringer i celle funktionalitet er tydelig fra to uger til 16 uger efter transplantation. Det vigtigste at tage hensyn til er cykel- eller fordoblingstiden for dine stamceller. Længden af DMSO behandling bør være den samme som cykling tid af cellerne.Efter den indledende DMSO behandling, kan man forstå, hvordan cellespredning og cellecyklus reguleres i stamceller, da behandlingen hjælper med at fremme vækstarholdning i G1-fasen af cellecyklussen. De differentierede celler kan bruges til at forstå sygdomsrelaterede mekanismer, til co-culturing med andre celletyper, i tumorigenicity assays, og i funktionelle analyser eller transplantation undersøgelser for at afgøre, om de differentierede celler kan redde en sygdom fænotype.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Stencil Micropatterning of Human Pluripotent Stem Cells for Probing Spatial Organization of Differentiation Fates

Stencil Micropatterning for Human pluripotente stamceller til Sondering Spatial Organisation af differentiering Fates

Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Storstilet produktion af cardiomyocytter fra menneskelige pluripotente stamceller Ved hjælp af en meget reproducerbar lille molekyle-Based Differentiering Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays

Hurtig neuronal differentiering af induceret pluripotente stamceller til måling Network Aktivitet på Micro-elektrode Arrays

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Instrueret differentiering af Primitive og endelige hæmatopoietisk ophav fra humane pluripotente stamceller

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Effektiv Differentiering af pluripotente stamceller til NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; Pankreatisk progenitorer

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In vitro differentiering af humane pluripotente stamceller til trofoblastceller

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Hurtig, instrueret differentiering af retinale Pigment epitel celler fra menneskelige embryonale eller induceret pluripotente stamceller

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a Na&#239;ve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency

Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a NaÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¯ve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency

Kemiske Reversion af konventionelle humane pluripotente stamceller til en naiv-lignende tilstand med forbedret Multilineage differentiering potens

Na&#239;ve human pluripotent stem cells (N-hPSC) with improved functionality may have a wide impact in regenerative medicine. The goal of this protocol is ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Effektiv og skalerbar styret differentiering af klinisk kompatibel hornhinde Limbal epitelial stamceller fra humane pluripotente stamceller

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...