Name: transient treatment of human pluripotent stem cells with dmso to promote differentiation
Uploaded: 2019-07-17T14:30:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door beurzen van de Stanford University School of Medicine en een Siebel Fellowship uitgereikt aan S. C.

1. onderhoud van de stamcel
Opmerking: Het hieronder beschreven Cell Maintenance Protocol is van toepassing op pluipotente stamcellen (PSCs) die in een aanhandige monolaag worden gehandhaafd. Media, andere reagentia en celcultuurplaten die vóór de DMSO-behandeling worden gebruikt, kunnen zo nodig worden aangepast. Voor alle volgende protocollen in dit manuscript moeten cellen worden behandeld onder een biologische veiligheidskast.
<ol><li>Coat steriel, 6 goed, met weefselcultuur behandelde platen met een pluripotente stamcel-gekwalificeerde matrix of substraat volgens de instructies van de fabrikant en incuberen gedurende ten minste 1 uur in een CO2 -incubator (5% Co2, vochtige atmosfeer). Gecoate platen kunnen folie worden verpakt en gedurende maximaal een week bij 4 °C worden bewaard.</li>
	<li>De cryopreserved PSCs in een waterbad van 37 °C ontdooien. Steriliseer de flacon met ethanol voorafgaand aan de introductie tot de biologische veiligheidskast, breng de cellen dan onmiddellijk over met pipetteren naar een steriele conische buis met 5-10 volumes van voorverwarmde stamcel media.</li>
	<li>Centrifugeer de cellen bij 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT).</li>
	<li>Aspireren de media en voorzichtig regenen de celpellet in 1 mL stamcel media aangevuld met een 10 μM ROTSREMMER, zoals Y-27632.</li>
	<li>Aspirate de cultuur matrix van de plaat en zaai de cellen op de gewenste dichtheid, typisch 0,5-1 x 106 cellen per goed in ten minste 2 ml stamcel media per put. Opmerking: De plating dichtheid kan variëren over verschillende cellijnen, en klonen en dienovereenkomstig worden geoptimaliseerd.</li>
	<li>Behoud de cellen door dagelijks te vervangen door voorverwarmde stamcel media. Splits de cellen op ongeveer 70%-80% confluentie of wanneer de celkolonies beginnen contact te maken.</li>
	<li>Voor het splitsen van cellen, aspireren de media en was de cellen één keer met steriele PBS. Inbroed de cellen met 1 mL van een dissociatie enzym oplossing per put gedurende 5-10 minuten bij 37 °C.</li>
	<li>Was en hervat de cellen met voorverwarmde stamcel media en breng deze over in een steriele conische buis met 5-10 volumes stamcel media. Volg de stappen 1.3-1.7 om de cellen te plaat.</li>
</ol>2. DMSO voor behandeling
Opmerking: Wanneer de cellen voor DMSO voor behandeling vóór differentiatie worden geplateeerd, moet de celdichtheid van de start plating worden geoptimaliseerd met inachtneming van de typische groeisnelheid van de stamcel lijn en het differentiatie protocol dat wordt gebruikt. Valideer pluripotentie met behulp van conventionele markers, indien nodig. De cellen moeten ten minste 1x-2x na de eerste ontdooiing vóór de differentiatie worden door gevoerd.
<ol><li>
2D cultuur differentiatie
	<ol>
<li>Wanneer de cellen een geschikte confluentie bereiken, de gecoate platen voorbereiden, de cellen ontkoppelen en een eencellige suspensie voorbereiden zoals hierboven beschreven.</li>
		<li>Tel de levende cellen met behulp van een hemocytometer of automatische celteller inclusief trypan Blue of een andere levensvatbaarheid marker.</li>
		<li>Plaat de cellen op een gecoate 6-put plaat met 0,5-1 x 106 cellen per put in stamcel media met de 10 ΜM-rotsremmer. Opmerking: Voor de cellijnen die in ons laboratorium getest werden, resulteerden deze dichtheden doorgaans in 80%-90% confluente cellen binnen de 24 h DMSO voor behandeling.</li>
		<li>Laat cellen 24 uur incueren bij 37 °C in een CO2 -incubator (5% Co2, vochtige atmosfeer).</li>
		<li>Bereid 1%-2% DMSO in voorverwarmde stamcel media (bijv. 100 μL DMSO in 10 mL van de media = 1% DMSO oplossing, of 200 μL DMSO in 10 mL van de Media = 2% DMSO oplossing).</li>
		<li>Na 24 h incubatie, aspireren de media uit cellen en vervang deze door DMSO oplossing.</li>
		<li>Laat de cellen gedurende 24 uur tot 48 uur incueren bij 37 °C in een CO2 -incubator (5% Co2, vochtige atmosfeer) voorafgaand aan differentiatie. Opmerking: Typisch, een 24 h DMSO behandeling is voldoende over een meerderheid van de menselijke ESC en iPSC lijnen. Cellijnen met zeer langzame groeipercentages (lange Verdubbelings tijden) kunnen profiteren van de incubatie van 48 h met DMSO. Voor een incubatie van 48 h met DMSO kunnen media worden vervangen door verse stamcel media met 1%-2% DMSO na de eerste 24 uur van de behandeling.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
3D-cultuur differentiatie:
	<ol>
<li>Wanneer de cellen een geschikte confluentie bereiken, dissociëren en verzamelen de cellen in een celsuspensie zoals hierboven beschreven.</li>
		<li>Tel de levende cellen met behulp van een hemocytometer of automatische celteller inclusief een levensvatbaarheid marker.</li>
		<li>Plaat de cellen in een ongecoat, laag-gehechtheid 6-goed plaat met 0,5-1 x 106 cellen per put in stamcel media met 10 ΜM-rotsremmer. Opmerking: Voor de cellijnen die in ons laboratorium getest werden, resulteerden deze dichtheden doorgaans in 3D hPSC-bol-vorming binnen 24 uur van het instellen van cellen.</li>
		<li>Laat cellen 24 uur incueren bij 37 °C in een CO2 -incubator (5% Co2, vochtige atmosfeer).</li>
		<li>Bereid 1%-2% DMSO in voorverwarmde stamcel media (bijv. 100 μL DMSO in 10 mL Media = 1% DMSO-oplossing, of 200 μL DMSO in 10 mL Media = 2% DMSO-oplossing).</li>
		<li>Vervang de media volgende standaardprocedures (bijvoorbeeld, kantel de plaat in een hoek van 30 °-45 ° om celbollen te laten vestigen op de bodem van de put; Breng cellen over naar een steriele conische buis en laat celbollen zich op de bodem van de buis vestigen; of Verzamel cellen die ik n suspensie met een pipet van 5 of 10 mL in een steriele conische buis en centrifuge cellen bij 300 x g gedurende 5 minuten bij RT).</li>
		<li>Aspireren de media uit cellen en vervang deze door DMSO oplossing, pipetteren zachtjes.</li>
		<li>Laat cellen gedurende 24 uur tot 48 uur incueren bij 37 °C in een CO2 -incubator (5% Co2, vochtige atmosfeer) voorafgaand aan differentiatie. Opmerking: Typisch, een 24 h DMSO behandeling is voldoende over een meerderheid van de menselijke ESC en iPSC lijnen. Cellijnen met zeer langzame groeipercentages (lange Verdubbelings tijden) kunnen profiteren van de incubatie van 48 h met DMSO. Voor een incubatie van 48 h met DMSO kunnen media worden vervangen door verse stamcel media met 1%-2% DMSO na de eerste 24 uur van de behandeling.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. differentiatie aan primaire kiem lagen
Opmerking: Hieronder worden de methoden beschreven die eerder zijn getoond om effectief te zijn in ons laboratorium voor pscs gekweekt in een monolaag op 6 well Plates. Elk differentiatie Protocol van keuze moet worden gebruikt na de DMSO-behandeling om differentiatie in gewenste kilometerstanden te bevorderen. Verwijder DMSO-oplossing na een behandeling van 24-48 h en ga door met differentiatie volgens de standaardprotocollen.
<ol><li>
Endoderm-differentiatie (aangepast van kroon et al.30)<ol>
<li>Behandel cellen vooraf met DMSO zoals hierboven beschreven voor 2D-culturen.</li>
		<li>Bereid Wnt3a en Activin een voorraadoplossing.</li>
		<li>Bereid dag 1 endodermale differentiatie media door Wnt3a toe te voegen aan een eindconcentratie van 20 ng/mL en Activin A tot een eindconcentratie van 100 ng/mL naar het juiste volume van voorverwarmde RPMI-media.</li>
		<li>Na DMSO voor behandeling, aspireren media uit de cellen en vervang deze door dag 1 media (bv., 2 mL per put van een 6 goed plaat).</li>
		<li>Laat cellen 24 uur incueren bij 37 °C in een CO2 -incubator (5% Co2, vochtige atmosfeer).</li>
		<li>Maak dagen 2 en 3 endodermale differentiatie media door Activin A toe te voegen aan een eindconcentratie van 100 ng/mL op het juiste volume van voorverwarmde RPMI-media.</li>
		<li>Aspireren media uit de cellen en vervang deze door dag 2 media (bijv., 2 mL per put van een 6 goed plaat).</li>
		<li>Laat de cellen 24 uur incueren bij 37 °C in een CO2 -incubator (5% Co2, vochtige atmosfeer).</li>
		<li>Aspireren media uit de cellen en vervangen door dag 3 media (bijv., 2 mL per put van een 6 goed plaat).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mesoderm-differentiatie (aangepast van Zhang et al.31)<ol>
<li>Pretreat de cellen met DMSO zoals hierboven beschreven voor 2D-culturen.</li>
		<li>Bereid Wnt3a en Activin een voorraadoplossing.</li>
		<li>Bereid mesodermale differentiatie media voor door Wnt3a toe te voegen aan een eindconcentratie van 20 ng/mL en Activin A tot een eindconcentratie van 100 ng/mL naar het juiste volume van voorverwarmde geavanceerde RPMI-media.</li>
		<li>Na DMSO voor behandeling, aspireren media uit cellen en vervangen door differentiatie media (bijvoorbeeld, 2 mL per put van een 6 goed plaat).</li>
		<li>Laat cellen 24 uur incueren bij 37 °C in een CO2 -incubator (5% Co2, vochtige atmosfeer).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ectoderm-differentiatie (aangepast van Chambers et al.32)<ol>
<li>Pretreat de cellen met DMSO zoals hierboven beschreven voor 2D-culturen.</li>
		<li>Bereid Noggin en SB431542 stockoplossingen voor.</li>
		<li>Bereid ectodermale differentiatie basismedia voor door het oplossen van de afdek serum vervanging (KOSR) tot een uiteindelijke concentratie van 10% in Knockout-DMEM. Opmerking: Bereid voldoende basismedia voor 3-4 dagen aan media wisseling.</li>
		<li>Bereid ectodermale differentiatie media voor door Noggin toe te voegen aan een eindconcentratie van 500 ng/mL en SB431542 tot een eindconcentratie van 10 μM op het juiste volume van voorverwarmde KOSR/Knockout-DMEM.</li>
		<li>Na DMSO voor behandeling, aspireren media uit cellen en vervangen door differentiatie media (bijvoorbeeld, 2 mL per put van een 6 goed plaat).</li>
		<li>Laat cellen gedurende 3-4 dagen incueren bij 37 °C in een CO2 -incubator (5% Co2, vochtige atmosfeer), waarbij media dagelijks worden vervangen door vers toegevoegde differentiatie factoren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. differentiatie naar soorten voorlopercellen
Hieronder worden de methoden beschreven die eerder effectief blijken te zijn in ons laboratorium voor PSCs die in een 2D-of 3D-cultuur zijn geteeld. Elk differentiatie Protocol van keuze moet worden gebruikt na de DMSO-behandeling om differentiatie in gewenste kilometerstanden te bevorderen. Verwijder DMSO-oplossing na een behandeling van 24-48 h en ga door met differentiatie volgens de standaardprotocollen.
<ol><li>Celdifferentiatie van neurale voorloper cellen (aangepast van Tchieu et al.33)<ol>
<li>Bereid 6 goed platen door coating met een pluripotente stamcel-gekwalificeerde gereduceerde groeifactor matrix of substraat, volgens de instructies van de fabrikant, voor ten minste 1 h in een CO2 incubator (5% Co2, vochtige atmosfeer). Gecoate platen kunnen folie worden verpakt en bewaard bij 4 °C gedurende maximaal 1 week.</li>
		<li>Plaat PSCs zoals hierboven beschreven bij een dichtheid van 0,5-1 x 106 cellen per put in stamcel media die een rotsremmer bevatten.</li>
		<li>Behandel cellen vooraf met DMSO zoals hierboven beschreven voor 2D-culturen.</li>
		<li>Bereid kleine chemische remmers LDN193189, SB431542, en XAV939 stockoplossingen.</li>
		<li>Maak dagen 1-3 neuroectoderm differentiatie media door de aanvulling van essentiële 6 media met 500 nM LDN193189, 10 μM SB431542 en 2 μM XAV939.</li>
		<li>Na DMSO voor behandeling, aspireren de media en vervangen door dagen 1-3 neuroectoderm media (bv., 2 mL per put van een 6 goed plaat). Media dagelijks wijzigen.</li>
		<li>Maak dagen 4-12 neuroectoderm differentiatie media door aanvulling van essentiële 6 media met 500 nM LDN193189 en 10 μM SB431542.</li>
		<li>Op dag 4 van differentiatie, aspireren de media en vervangen door dagen 4-12 neurodectoderm media. Verander de media dagelijks.</li>
		<li>Na 12 dagen van differentiatie moeten gedifferentieerde cellen passende markers van neurale voorlopercellen (Npc's) uitdrukken. Npc's kunnen verder worden onderhouden in neurale media met DMEM/F-12,5% B-27, 1% N-2, en aangevuld met 10 μg/mL basis fibroblast-groeifactor (bFGF). Doorgang de Npc's wanneer Confluent Health met behulp van een cel loslating oplossing, plating NPCs 0,5-1 x 106 cellen per put.</li>
	</ol></li>
	<li>Oligodendrocyten voorlopercellen celdifferentiatie (aangepast van Douvaras en Fossati34)<ol>
<li>Plaat de PSCs zoals hierboven beschreven bij een dichtheid van 1 x 105 per goed op gecoate 6 well Plates in stamcel media die een rotsremmer bevatten.</li>
		<li>Behandel cellen vooraf met DMSO zoals hierboven beschreven voor 2D-culturen.</li>
		<li>Bereid SB431542, LDN193189, all-trans retinoïnezuur (RA) en gladgestreken agonist (SAG) stockoplossingen.</li>
		<li>Bereid dagen 0 – 8 differentiatie media door aan te vullen DMEM/F-12 met 10 μM SB431542, 250 nM LDN193189, en 100 nM RA.</li>
		<li>Na DMSO voor behandeling, cellen met differentiatie media gedurende 8 dagen inbroed, dagelijks media verwisselen met vers toegevoegde differentiatie factoren (bijv. 2 mL per put van een 6-put).</li>
		<li>Op dag 8, vervang media met DMEM/F-12 met 1x MEM niet-essentiële aminozuren (NEAA) oplossing, 1X L-glutamine, 2-mercaptoethanol, penicillaire/streptomycine, en 1x N-2 aangevuld 100 nM RA en 1 μM SAG. Verander de media dagelijks.</li>
		<li>Na 12 dagen van differentiatie moeten gedifferentieerde cellen passende markers van oligodendrocyten voorlopercellen (OPCs) uitdrukken.</li>
	</ol></li>
	<li>Celdifferentiatie van Hormoonprogenitor (aangepast van Pagliuca et al.35)<ol>
<li>Zaad PSCs bij 6 x 105 cellen/ml in stamcel Media Plus 10 μM rotsremmer in 500 ml spinner kolven geplaatst op een 9-positie roer plaat ingesteld bij rotatiesnelheid van 70 rpm in een incubator van 37 °c, 5% Co2en 100% vochtigheid.</li>
		<li>Toestaan dat clusters zich vestigen aan de onderkant van de kolf, aspireren de media, dan voorbehandelen met 1%-2% DMSO.</li>
		<li>Bereid Activin A, Chir99021, KGF, Sant1, all-trans retinoïnezuur (RA), LDN193189, PdBU, XXI, Alk51, T3, en Betacelluin stockoplossingen.</li>
		<li>Maak basismedia voor differentiatie op basis van de formulering in tabel 3.</li>
		<li>Na DMSO voor behandeling, aspireren media en vervangen door S1 media aangevuld met 100 ng/mL Activin A en 3 mM Chir99021 (bv., 500 mL per kolf). Laat incubatie gedurende 24 uur toe.</li>
		<li>Op dag 2 vervangt u media door S1-media aangevuld met 100 ng/mL Activin A. laat incubatie gedurende 2 dagen toe.</li>
		<li>Vervang op dag 4 media met S2-media aangevuld met 50 ng/mL KGF. Laat de incubatietijd gedurende 3 dagen na de eerste 2 dagen (dag 6) veranderen.</li>
		<li>Vervang op dag 7 media met S3-media aangevuld met 50 ng/mL KGF, 0,25 mM Sant1, 2 mM RA en 200 nM LDN193189. Laat incubatie gedurende 24 uur toe.</li>
		<li>Vervang op dag 8 media met S3-media aangevuld met 50 ng/mL KGF, 0,25 mM Sant1, 2 mM RA, 200 nM LDN193189 en 500 nM PdBU. Laat incubatie gedurende 24 uur toe.</li>
		<li>Op dag 9 vervangt u media door S3-media aangevuld met 50 ng/mL KGF, 0,25 mM Sant1 en 100 nM RA. Laat de incubatietijd gedurende 5 dagen toe, waarbij de media om de 2 dagen worden vervangen (dag 11 en 13).</li>
		<li>Vervang op de dagen 14 en 16 media door S5 media aangevuld met 0,25 mM Sant1, 100 nM RA, 1 mM XXI, 10 mM Alk5i II, 1 mM T3 en 20 ng/mL betacellulin (4 dagen totale incubatie).</li>
		<li>Vervang op de dagen 18 en 20 media door S5-media aangevuld met 25 nM RA, 1 mM XXI, 10 mM Alk5i II, 1 mM T3 en 20 ng/mL betacellulin.</li>
	</ol></li>
</ol>5. immunocytochemische validering van differentiatie
Opmerking: De volgende methoden beschrijft een algemeen immunocytochemisch protocol dat indien nodig kan worden aangepast. Primaire antilichamen zijn degenen die eerder in ons laboratorium zijn gevalideerd. Andere technieken voor validatie van differentiatie kunnen ook worden gebruikt (bijvoorbeeld flow cytometrie, qPCR, RNA-sequencing, Western blotting, functionele assays, enz.).
<ol><li>
Immunolabeling cellen
	<ol>
<li>Voor 3D-culturen in suspensie, plaat hele celclusters of clusters gedispergeerd in eencellige suspensie op gecoate platen voor 18-24 h voorafgaand aan fixatie.</li>
		<li>Aspirate media uit aanhangers en spoel kort met PBS bij RT op een shaker.</li>
		<li>Voor celfixatie, aspiraat PBS en incuberen cellen met 4% Paraformaldehyde (PFA) in PBS gedurende 20 minuten bij RT op Shaker. Let op: PFA voorraad moet worden bereid onder een rook afzuigkap als gevolg van de toxiciteit. Niet inademen en gepaste persoonlijke beschermingsmiddelen dragen.</li>
		<li>Verwijder PFA en gooi deze weg in de juiste chemische afvalbak.</li>
		<li>Was cellen 3x met PBS gedurende ten minste 5 minuten per wasbeurt bij RT op een shaker.</li>
		<li>Voor celpermeisatie en blokkering, incuberen cellen met 5% Donkey serum bereid in 0,3% Triton-x 100/PBS voor 1 uur bij RT op een shaker.</li>
		<li>Bereid primaire antilichaam oplossing in dezelfde oplossing die wordt gebruikt voor permeabilisatie/blokkering.</li>
		<li>Inincuberen in primaire antilichaam oplossing 's nachts bij 4 °C op Shaker.</li>
		<li>Na een nachtelijke incubatie, wassen cellen 3x met PBS gedurende ten minste 5 minuten per wasbeurt bij RT op een shaker.</li>
		<li>Bereid secundaire antilichaam oplossing in permeabilization/blokkerende oplossing.</li>
		<li>Laat in een secundaire antilichaam oplossing voor 1 uur inbroed bij RT op een shaker.</li>
		<li>Aspirate secundaire antilichaam oplossing en spoel cellen 3x met PBS gedurende ten minste 5 minuten per wasbeurt bij RT op een shaker.</li>
		<li>Inbroed cellen met DAPI of een andere voorkeurs markering voor de juiste incubatietijd en spoel af in PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kwantificering van afbeeldingen
	<ol>
<li>Verkrijg minimaal drie beelden per toestand op een fluorescerende Microscoop en/of met een high content screening platform.</li>
		<li>Kwantificeer het percentage positieve cellen voor elke marker door het totale aantal cellen met antilichamen te tellen en de totale celaantallen (gebaseerd op DAPI/Hoechst-kernen-kleuring) met behulp van onbevooroordeelde beeldverwerkingssoftware (bijv. imagej) of een geautomatiseerd screening platform voor Analyses.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Samengevat, dit protocol beschrijft een eenvoudig en goedkoop instrument om de differentiatie capaciteit van pluripotente stamcellen (PSCs) te vergroten tot alle primaire kiem lagen, verschillende soorten gespecialiseerde voorlopercellen, en zelfs functionele, volwassen celtypen in in vitro en in vivo-instellingen. Geïllustreerd zijn specifieke differentiatie protocollen die effectief zijn gereproduceerd in ons laboratorium en andere, maar elk differentiatie Protocol van keuze kan worden gebruikt na de DMSO-behandeling. Zoals weergegeven in tabel 1, heeft een aantal laboratoria ook een verhoging van de PSC-differentiatie aangetoond na een voorbijgaande DMSO-behandeling met behulp van verschillende paradigma's om verschillende andere terminale celtypen te genereren. Bovendien, hoewel de methoden hier beschrijven het gebruik van menselijke pscs, de DMSO voor behandeling kan worden gebruikt voor verschillende soorten en is aangetoond dat effectief in muis, konijn, en primaat pscs.
Hoewel hogere doseringen van DMSO bekend zijn als cytotoxisch, zijn de lage doses die bij deze methode worden gebruikt (1%-2%) voor een voorbijgaande periode resulteren in minimale celdood. Terwijl de totale celaantallen onmiddellijk na DMSO behandeling kan afnemen als gevolg van DMSO bevordering van celcyclus arrestatie in de G1 fase van de celcyclus, eerdere studies tonen aan dat cellen in staat zijn om hetzelfde niveau van confluentie als controleculturen te bereiken na verwijdering van DMSO3.
Het percentage en de duur van de DMSO-voor behandeling moeten per cellijn worden geoptimaliseerd. De behandelingstijd moet worden aangepast met inachtneming van de fiets-/Verdubbelings tijd van de cellen. Muis-PSCs hebben bijvoorbeeld meestal veel kortere fiets tijden van ongeveer 15 uur; Dus, DMSO behandeling voor 15 h voor deze cellen is voldoende. Sommige laboratoria hebben ook geconstateerd dat de DMSO-behandeling heilzaam is wanneer deze wordt voortgezet tijdens het differentiatie protocol of bij lagere concentraties (Zie tabel 1). Er moet worden opgemerkt dat sommige PSC-lijnen meer op differentiatie van specifieke kilometerstanden kunnen worden gericht. Zo is aangetoond dat HUES6 cellen minder toelaatbaar zijn voor differentiatie en dus een duidelijke verbetering met DMSO-behandeling hadden (Figuur 2). Als alternatief is aangetoond dat HUES8 cellen in Figuur 4 en Figuur 5 een hogere neiging hebben naar endodermale differentiatie; Er werden dus minder verschillen getoond tussen controle en DMSO voor differentiatie in de beginfase naar definitieve endoderm. Niettemin, de verbetering van DMSO voor behandeling wordt waargenomen in latere stadia van differentiatie in deze cellijn (Figuur 4B). De DMSO-behandeling is ook veelzijdig omdat het effectief is in zowel 2D-als 3D-celculturen, het kan worden gebruikt met verschillende soorten coatingmateriaal op celcultuurplaten, en het werkt in verschillende soorten onderhouds medium die groei en uitbreiding van hPSCs (bijv. mTeSR, E8, MEF-geconditioneerde media, enz.).
Meer in het algemeen suggereren deze resultaten dat de start toestand van pluripotente stamcellen een sterke invloed heeft op de neiging voor initiële differentiatie en terminale differentiatie in functionele celtypen. We hebben eerder aangetoond dat de DMSO-behandeling functioneert via rb in hpscs-3,5. RB speelt een belangrijke rol bij het bevorderen van terminaldifferentiatie, celoverleving en de genetische stabiliteit van cellen41,42,43,44, en het kan daarom de aanhoudende effecten op cellen verklaren worden onderscheiden van DMSO-behandelde hPSCs. Het targeten van deze vroege vormen van regulering kan hPSCs op een beter traject voor differentiatie plaatsen en uiteindelijk hun nut voor regeneratieve geneeskunde verbeteren.

Het gebruik van pluripotente stamcellen heeft geleid tot tal van vooruitgang in biomedisch onderzoek, waaronder de velden van regeneratieve geneeskunde en stamcel therapieën, ziekte modellering en geneesmiddelen screening. Het heeft ook geleid tot het algemene vooruitzicht van meer vertaalbare onderzoek en gepersonaliseerde geneeskunde. De opkomst van de geïnduceerde pluripotente stamceltechnologie (iPSC) meer dan twintig jaar geleden heeft onderzoekers de mogelijkheid gelaten pluripotente stamcellen uit somatische weefsels te ontwikkelen en ze te differentiëren in functionele celtypen om een verscheidenheid aan pathologieën te bestuderen, waaronder cardiovasculaire, neurologische en immunologische ziekten. Hoewel er belangrijke stappen zijn gezet in technologie voor stamcel differentiatie, blijven de uitdagingen bij het effectief differentiëren van menselijke embryonale stamcellen (hESCs) en iPSCs nog steeds bestaan, waardoor het wijdverbreide gebruik van stamceltechnologie in verschillende onderzoeksprogramma's. Inherente variabiliteit over verschillende cellijnen en klonen blijft obstakels vormen voor het differentiëren van stamcellijnen naar gewenste linages1. Bovendien blijft het afleiden van volwassen, terminaal gedifferentieerde functionele cellen van hPSCs een vervelend en inefficiënt proces over vele kilometerstanden. In feite, cellen gedifferentieerd van hPSCs vaak niet terminaal differentiëren in functionele cellen2. Bij het verder verplaatsen van stamcel therapieën om te gebruiken bij patiënten, is het noodzakelijk om de werkzaamheid van cellen die worden gegenereerd door hPSCs te verbeteren en te waarborgen.
Ons lab heeft een snelle, goedkope tool opgericht om de efficiëntie van het differentiëren van zowel iPSCs als ESCs aanzienlijk te verbeteren in volwassen celtypen. We constateerden dat voor behandeling van hiPSCs en hESCs met de veelgebruikte reagens Dimethylfumaraat sulfoxide (DMSO) voor 24 h tot 48 h voorafgaand aan gerichte differentiatie resulteert in een duidelijke verbetering van de capaciteit van stamcel differentiatie. Behandeling met DMSO verhoogt het aandeel van hipscs en hescs in de vroege G1-fase van de celcyclus en activeert het Retinoblastoom-eiwit (RB)3, een kritische regulator van celproliferatie, overleving en differentiatie4. In meer recent werk is geconstateerd dat rb en zijn familieleden verplicht zijn voor de Pro-differentiatie-effecten van DMSO, zodat tijdelijke inactivatie van rb de effecten van DMSO onderdrukt, terwijl de constitutieve activering van RB op een voorbijgaande manier DMSO van effecten5. Analoog aan de celcyclus tijdens de embryonale ontwikkeling, wordt de celcyclus van ESCs en ipscs gekenmerkt door een verkorte G1-fase die zelf vernieuwing6,7,8bevordert. Deze verkorte G1-fase zorgt voor meer onbeperkte proliferatie, maar beperkt het potentieel voor differentiatie4,9. Door het bevorderen van de arrestatie van de groei in G1 en activeren controlepunt controles in de celcyclus van hescs en ipscs, de DMSO behandeling priemgetallen cellen voor het lot van de cel verandert na gerichte differentiatie.
Tot op heden heeft DMSO voor behandeling aangetoond dat het de differentiatie capaciteit voor alle drie de kiem lagen verbetert in meer dan 30 controle-en ziektespecifieke humane ESC-en IPSC-cellijnen3,5 en de differentiatie van stamcellen en andere cellijnen naar een verscheidenheid van andere volwassen celtypen in volgende studies10,11,12,13,14,15,16, 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 (tabel 1). Bovendien is de DMSO-behandeling effectief gebleken bij het verbeteren van de differentiatie van niet-humane primaire cellen21,23 (bijv. muis, primaat, konijn), wat duidt op gedeelde mechanismen voor verschillende soorten. Tot slot, DMSO voor behandeling is ook uitgebreid tot genediting technologie, met een bepaalde studie waaruit blijkt dat 24 h DMSO voor behandeling van hESCs/iPSCs aanzienlijk toegenomen het vermogen van geclusterde regelmatig Intergespreide korte palindroom herhalingen (CRISPR) /Crispr-geassocieerde proteïne-9 (Cas9)-gemedieerde bewerkings efficiëntie van niet-Codeer-DNA zonder onbedoelde mutaties29. Hier vindt u een gedetailleerde methodologie van de DMSO voor behandeling van hESCs en iPSCs voor toepassingen in stamcel biologie en gerichte differentiatie.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:651px;" width="651">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">21985023</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">9-Position stir plate&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Chemglass</td>
			<td style="width:135px;">CLS-4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Accutase</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">11105-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Activin A</td>
			<td style="width:135px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>338-AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Advanced RPMI</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">12633012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alk5i II</td>
			<td style="width:135px;">Axxora</td>
			<td style="width:135px;">ALX-270-445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">all-trans retinoic acid&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-Brachyury</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">AF2085</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:215px;">anti-C-peptide</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:135px;">GN-ID4</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-FoxA2</td>
			<td style="width:135px;">Millipore</td>
			<td>07-633</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-Nkx2.2</td>
			<td>University of Iowa, Developmental Hybridoma Bank</td>
			<td>74.5A5</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-Nkx6.1</td>
			<td>University of Iowa, Developmental Hybridoma Bank;&#160;</td>
			<td style="width:135px;">F55A12-supernatant</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-Olig2</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:135px;">MABN50</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-Pax-6</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td style="width:135px;">901301</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-Pdx1</td>
			<td style="width:135px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>AF2419</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-SOX1&#160;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">AF3369</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-SOX17</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">AF1924</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:215px;">B-27 Supplement, minus Vitamin A</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">basic fibroblast growth factor</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>PHG0264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Betacellulin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>50932345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chir99021</td>
			<td style="width:135px;">Stemgent</td>
			<td>04-000-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">CMRL 1066</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">99-603-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:215px;">Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td style="width:135px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:135px;">AMQAF1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:135px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:135px;">G7528&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">DAPI</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:135px;">D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Disposable Spinner Flasks</td>
			<td style="width:135px;">Corning, VWR</td>
			<td style="width:135px;">89089-814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">DMEM/F-12</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">DMSO&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Essential 6 Media</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>A1516501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">FAF-BSA</td>
			<td style="width:135px;">Proliant&#160;</td>
			<td style="width:135px;">68700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">FGF7</td>
			<td style="width:135px;">PeproTech</td>
			<td style="width:135px;">100-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Geltrex</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>A1413202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">GlutaMAX&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Heparin&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:135px;">H3149&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Ultrasensitive Insulin ELISA</td>
			<td>ALPCO Diagnostics</td>
			<td>80-INSHUU-E01.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">ITS-X</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:135px;">51500056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KGF</td>
			<td style="width:135px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">AF-100-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Knockout DMEM</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>10829018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">KnockOut Serum Replacement</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-3,3&#8242;,5-Triiodothyronine (T3)</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:135px;">642245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">LDN193189</td>
			<td style="width:135px;">Stemgent</td>
			<td>04-0074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Matrigel Matrix</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MCDB-131&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Cellgro&#160;</td>
			<td style="width:135px;">15-100-CV&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">MEM NEAA</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:215px;">mTeSR 1</td>
			<td style="width:135px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:135px;">5850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">N2 Supplement</td>
			<td style="width:135px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:135px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:135px;">S3817&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Noggin Fc Chimera Protein</td>
			<td style="width:135px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">3344-NG-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PdBU</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:135px;">524390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Mediatech&#160;</td>
			<td style="width:135px;">30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">RPMI</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sant1</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">S4572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SB431542</td>
			<td style="width:135px;">Stemgent</td>
			<td>04-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Smoothened Agonist, SAG</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td>566660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">StemPro Accutase</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>A1110501&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">TrypLE</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">12604013</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:215px;">Ultra-Low Attachment Microplates</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td>3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Vitamin C</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">A4544&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Wnt3a</td>
			<td style="width:135px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>5036-WN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">XAV 939</td>
			<td style="width:135px;">Tocris</td>
			<td style="width:135px;">3748</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">XXI</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:135px;">565790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Y-27632</td>
			<td style="width:135px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:135px;">72302</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transient treatment of human pluripotent stem cells with dmso to promote differentiation

Ondanks het toenemende gebruik van pluripotente stamcellen (PSCs) blijven de uitdagingen bij het efficiënt differentiëren van embryonale en geïnduceerde pluripotente stamcellen (Esc's en iPSCs) over verschillende kilometerstanden bestaan. Talrijke differentiatie protocollen zijn ontwikkeld, maar de variabiliteit over cellijnen en lage differentiatie percentages is een uitdaging voor het succesvol implementeren van deze protocollen. Hier beschreven is een eenvoudig en goedkoop middel om de differentiatie capaciteit van PSCs te vergroten. Eerder is aangetoond dat de behandeling van stamcellen met een lage concentratie van dimethylsulfoxide (DMSO) de neiging van een verscheidenheid aan PSCs aanzienlijk verhoogt om te differentiëren naar verschillende celtypen na gerichte differentiatie. Deze techniek is nu effectief gebleken voor verschillende soorten (bijv. muis, primaat en mens) in meerdere kilometerstanden, variërend van neuronen en corticale spheroïden tot gladde spiercellen en hepatocyten. De DMSO voor behandeling verbetert PSC differentiatie door het reguleren van de celcyclus en priming stamcellen om beter te reageren op differentiatie signalen. Hier is de gedetailleerde methodologie voor het gebruik van dit eenvoudige hulpmiddel als een reproduceerbare en breed toepasbaar middel om efficiënter te differentiëren PSCs naar elke Lineage van keuze.

Watch this Scientific Journal Video about Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation at JoVE.com

Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation

Het genereren van gedifferentieerde celtypen van menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) houdt een grote therapeutische belofte in, maar blijft uitdagend. PSCs vertonen vaak een inherent onvermogen om te differentiëren, zelfs wanneer ze worden gestimuleerd met een juiste reeks signalen. Hier beschreven is een eenvoudig hulpmiddel om de multi Lineage-differentiatie over verschillende PSC-lijnen te verbeteren.

Voorbijgaande behandeling van menselijke pluripotente stamcellen met DMSO om differentiatie te bevorderen

Despite the growing use of pluripotent stem cells (PSCs), challenges in efficiently differentiating embryonic and induced pluripotent stem cells (ESCs and ...

Het is een eenvoudige behandeling die kan worden toegepast op een stamcellijn of differentiatie protocol op priemcellen voor differentiatie. Het enige wat men hoeft te doen is om DMSO toe te voegen op 1-2%in de cel cultuur onderhoud medium. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het mogelijk maakt een aanzienlijk verhogen van de differentiatie potentieel van pluripotente stamcellen in een afstamming van keuze door priming cellen voor differentiatie.DMSO behandeling verhoogt de kans dat cellen zich zullen onderscheiden van patiënt-afgeleide iPSCs, waardoor ze kunnen worden gebruikt voor celvervangende therapie, ziekte modellering, en drug screening. Het kan aanleiding geven tot het vroege begin van regelgeving die subproliferatie, differentiatie en specificatie tijdens de embryonale ontwikkeling te controleren. We hebben aangetoond dat de DMSO-behandeling de differentiatie in bijna 50 menselijke embryonale en geïnduceerde pluripotente stamcellijnen verbetert.Terwijl andere laboratoria hebben aangetoond dat het gunstig is voor stamcellen van andere soorten, zoals muis en primaat. Een dag voor het begin van differentiatie, voeg DMSO bij een concentratie van 1 of 2% gedurende 24 uur in uw typische onderhoudsmedium. 24 uur na de DMSO behandeling, vervang medium en ga verder met uw gebruikelijke differentiatie protocol.Kweek cellen volgens manuscriptrichtingen. Wanneer de cellen een geschikte samenloop bereiken, scheidt u ze en bereidt u een enkele celsuspensie voor. Tel de levende cellen met een hemocytometer of automatische celteller, met behulp van een levensvatbaarheidsmarkering zoals trypanblauw.Om 80-90% samenvloeiing te bereiken binnen de 24-uurs DMSO voorbehandeling, plaat de cellen op een gecoate zes-put plaat bij een dichtheid van 500, 000 tot 1 miljoen cellen per put. Broed de cellen 24 uur lang in 37 graden Celsius in een koolstofdioxide incubator. Vervolgens, aspirate de media en vervang het door een 1-2%DMSO oplossing.Laat de cellen 24-28 uur voor differentiatie uitbroeden. Als u 48 uur uitbroedt, vervangt u de media na 24 uur door een verse DMSO-oplossing. Om 3D-cultuurdifferentiatie te bereiken, groeien en verzamelen van de cellen in een cel suspensie.Tel de levende cellen en plaat ze in een ongecoate, lage bevestiging zes-put plaat in stamcel media met ROCK remmer. Typisch, 3D menselijke pluripotente stamcellen bollen vormen binnen 24 uur. Laat de cellen 24 uur incuceren bij 37 graden Celsius in een koolstofdioxide incubator.Bereid 1-2%DMSO in voorverwarmde stamcelmedia volgens manuscriptrichtingen. Om de media te vervangen na incubatie, kantel de plaat tot een hoek van 30 graden tot 45 graden en laat celbollen zich aan de onderkant van de put vestigen. De media uit de cellen aanzuigen en deze voorzichtig opnieuw opschorten in de DMSO-oplossing.Laat de cellen 24-48 uur incuceren bij 37 graden Celsius in een koolstofdioxide incubator. Behandel cellen vooraf met DMSO zoals beschreven voor 2D-culturen en bereid noggin- en SB431542-voorraadoplossingen voor. Bereid genoeg 10% knock-out serum vervanging, of KOSR, in knock-out DMEM voor drie tot vier dagen van de media te veranderen.Bereid ectodermale differentiatiemedia voor door noggin en SB431542 toe te voegen aan de voorverwarmde KOSR knock-out DMEM zoals beschreven in het manuscript. Na DMSO voorbehandeling, aanzuigen media uit cellen en voeg twee milliliter van differentiatie media aan elke put. Laat de cellen drie tot vier dagen incuren bij 37 graden Celsius in een koolstofdioxide-incubator, waarbij media dagelijks worden vervangen door nieuwe differentiatiefactoren.DMSO voorbehandeling resulteert in een tijdelijke en dosisafhankelijke afname van de celgroei in vergelijking met niet-behandelde cellen. Deze afname proliferatie wordt geassocieerd met een toename van cel-naar-cel contact, die vooral wordt uitgesproken in de 2%DMSO-behandelde cellen. Wanneer de cellen zijn vastgesteld en gekleurd voor prototypische markers van elke kiemlaag, kan worden vastgesteld dat 2%DMSO voorbehandeling resulteert in een verhoogd deel van gedifferentieerde kiemlaagcellen.Sox17 werd bijvoorbeeld bevlekt om endodermcellen te visualiseren. Om het effect van DMSO op differentiatie op de voorloperceltypen van het centrale zenuwstelsel te onderzoeken, kunnen door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen worden onderscheiden in neurale voorlopercellen of oligodendrocytenverercellen. Vergeleken met controlecellen verhoogt 2%DMSO voorbehandeling de expressie van neurale voorlopercelmarker Pax6.Ook verhoogt de voorbehandeling het percentage cellen dat oligodendrocyte voorlopercelmarker Olig2 uitdrukt. Bovendien verbetert de eerste DMSO-behandeling de celfunctie van menselijke embryonale stamcel na in-vivo transplantatie. Wanneer gedifferentieerde pancreasercellen worden getransplanteerd in immunodeficiënte muizen, kan hun functionaliteit worden getest in reactie op een glucoseuitdaging of KCl-stimulatie.Verbeteringen in de celfunctionaliteit zijn duidelijk van twee weken tot 16 weken na transplantatie. De belangrijkste overweging om rekening mee te houden is het fietsen of verdubbelen van de tijd van uw stamcellen. De lengte van de DMSO-behandeling moet gelijk zijn aan de fietstijd van de cellen.Na de eerste DMSO-behandeling kan men begrijpen hoe celproliferatie en de celcyclus worden gereguleerd in stamcellen, omdat de behandeling helpt bij het bevorderen van groeiarrestatie in de G1-fase van de celcyclus. De gedifferentieerde cellen kunnen worden gebruikt om ziektegerelateerde mechanismen te begrijpen, voor co-culturing met andere celtypen, in tumorigeniciteitstesten en in functionele testen of transplantatiestudies om te bepalen of de gedifferentieerde cellen een ziektefenotype kunnen redden.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Stencil Micropatterning of Human Pluripotent Stem Cells for Probing Spatial Organization of Differentiation Fates

Stencil micropatterning van menselijke pluripotente stamcellen voor Probing ruimtelijke organisatie van Differentiatie Fates

Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Grootschalige productie van cardiomyocyten van menselijke pluripotente stamcellen met behulp van een zeer reproduceerbare Small-Molecule Based Differentiatie Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays

Rapid neuronale differentiatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen voor het meten van het netwerk activiteit op micro-electrode arrays

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Regie van differentiatie van primitieve en definitieve hematopoietische progenitorcellen van menselijke pluripotente stamcellen

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficiënte Differentiatie van pluripotente stamcellen tot NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; Pancreatic Progenitors

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In vitro differentiatie van humane pluripotente stamcellen in trofoblastcellen

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Snelle, gerichte differentiatie van de epitheliale cellen van de retinale Pigment van menselijke embryonale of geïnduceerde pluripotente stamcellen

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a Na&#239;ve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency

Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a NaÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¯ve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency

Chemische terugkeer van conventionele menselijke pluripotente stamcellen naar een naïef-achtige toestand met verbeterde Multilineage differentiatie potentie

Na&#239;ve human pluripotent stem cells (N-hPSC) with improved functionality may have a wide impact in regenerative medicine. The goal of this protocol is ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Efficiënt en schaalbare gestuurde differentiatie van klinisch hoornvlies Limbal epitheliale cellen van de stam van menselijke pluripotente stamcellen

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...