Name: transient treatment of human pluripotent stem cells with dmso to promote differentiation
Uploaded: 2019-07-17T14:30:00
Duration: 6 min 55 s
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Ce travail a été soutenu par des subventions de la Stanford University School of Medicine et une bourse Siebel décernée à S. C.

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

En résumé, ce protocole décrit un outil simple et peu coûteux pour améliorer la capacité de différenciation des cellules souches pluripotentes (CSP) à toutes les couches germinales primaires, à divers types de cellules progénitrices spécialisées, et même aux types fonctionnels et matures de cellules in vitro. et les paramètres in vivo. Illustrés sont des protocoles de différenciation spécifiques qui ont été effectivement reproduits dans notre laboratoire ainsi que d'autres, mais tout protocole de différenciation de choix peut être utilisé après le traitement DMSO. Comme le montre le tableau 1, un certain nombre de laboratoires ont également démontré une amélioration de la différenciation de la CFP après un traitement d'Administration numérique transitoire utilisant différents paradigmes pour générer divers autres types de cellules terminales. En outre, bien que les méthodes décrivent ici l'utilisation des CSP humains, le prétraitement DMSO peut être utilisé entre les espèces et s'est avéré efficace chez les cSP de souris, de lapins et de primates.
Bien que des doses plus élevées de DMSO soient connues pour être cytotoxiques, les faibles doses utilisées dans cette méthode (1%-2%) pour une période transitoire entraîner une mort cellulaire minimale. Alors que le nombre global de cellules immédiatement après le traitement DMSO peut diminuer en raison de la promotion DMSO de l'arrêt du cycle cellulaire dans la phase G1 du cycle cellulaire, des études antérieures montrent que les cellules sont en mesure d'atteindre le même niveau de confluence que les cultures témoins après l'ablation de DMSO3.
Le pourcentage et la durée du prétraitement DMSO devraient être optimisés par ligne cellulaire. Le temps de traitement doit être ajusté en tenant compte du temps de cycle/doublement des cellules. Par exemple, les CSP de souris ont généralement des temps de vélo beaucoup plus courts d'environ 15 h; ainsi, le traitement de DMSO pour 15 h pour ces cellules est suffisant. Certains laboratoires ont également constaté que le traitement DMSO était bénéfique lorsqu'il est maintenu pendant le protocole de différenciation ou à des concentrations plus faibles (voir le tableau 1). Il convient de noter que certaines lignes de la CFP sont plus modifiables à la différenciation par rapport à des lignées spécifiques. Par exemple, il a été démontré que les cellules HUES6 sont moins permissives à la différenciation et ont donc connu une amélioration marquée avec le traitement DMSO (figure 2). Alternativement, il a été démontré que les cellules HUES8 utilisées dans la figure 4 et la figure 5 ont une plus grande propension à la différenciation endodermale; ainsi, moins de différences ont été montrées entre le contrôle et DMSO pour la différenciation aux étapes initiales vers l'endoderm définitif. Néanmoins, l'amélioration du prétraitement DMSO est observée à des stades ultérieurs de différenciation dans cette lignée cellulaire (figure 4B). Le traitement DMSO est également polyvalent en ce qu'il est efficace dans les deux systèmes de cultures cellulaires 2D et 3D, il peut être utilisé avec différents types de matériau de revêtement sur les plaques de culture cellulaire, et il fonctionne dans différents types de milieu d'entretien qui favorisent la croissance et l'expansion de hPSC (p. ex. mTeSR, E8, médias conditionnés MEF, etc.).
Plus généralement, ces résultats suggèrent que l'état de départ des cellules souches pluripotentes a une forte influence sur la propension à la différenciation initiale ainsi qu'à la différenciation terminale en types de cellules fonctionnelles. Nous avons précédemment montré que le traitement DMSO fonctionne par rb dans hPSCs3,5. Rb joue un rôle important dans la promotion de la différenciation terminale, la survie cellulaire, et la stabilité génétique des cellules41,42,43,44, et il peut donc expliquer les effets persistants sur les cellules différenciés des hPSC traités par DMSO. Cibler ces premiers modes de régulation peut placer les HPSC sur une meilleure trajectoire de différenciation et, en fin de compte, améliorer leur utilité pour la médecine régénérative.

L'utilisation de cellules souches pluripotentes a mené à de nombreux progrès dans la recherche biomédicale, y compris les domaines de la médecine régénérative et des thérapies à base de cellules souches, la modélisation des maladies et le dépistage des médicaments. Il a également conduit à la perspective globale d'une recherche plus traduisible et de la médecine personnalisée. L'avènement de la technologie induite des cellules souches pluripotentes (iPSC) il y a plus de 20 ans a permis aux chercheurs de développer des cellules souches pluripotentes à partir de tissus somatiques et de les différencier en types de cellules fonctionnelles pour étudier une variété de pathologies, y compris maladies cardiovasculaires, neurologiques et immunologiques. Bien que des progrès significatifs aient été réalisés dans la technologie de différenciation des cellules souches, des défis ont été relevés dans la différenciation efficace des cellules souches embryonnaires humaines (HESC) et des iPSC, ce qui limite l'utilisation généralisée de la technologie des cellules souches dans différents programmes de recherche. La variabilité inhérente entre les différentes lignées cellulaires et clones continue de poser des obstacles à la différenciation des lignées de cellules souches aux linages désirés1. En outre, la réalisation de cellules fonctionnelles matures et différenciées en phase terminale des hPSC demeure un processus fastidieux et inefficace à travers de nombreuses lignées. En fait, les cellules différenciées des hPSC ne se différencient souvent pas en cellules fonctionnelles2. Dans le déplacement des thérapies à base de cellules souches à utiliser chez les patients, il est nécessaire d'améliorer et d'assurer l'efficacité des cellules qui sont générées à partir de hPSC.
Notre laboratoire a mis en place un outil rapide et peu coûteux pour améliorer considérablement l'efficacité de la différencié des iPSC et des ESC en types de cellules matures. Nous avons constaté que le prétraitement des hiPSCs et des HESC avec le sulfoxide de diméthyle de réactif couramment utilisé (DMSO) pendant 24 h à 48 h avant les résultats dirigés de différenciation dans une amélioration marquée de la capacité de différenciation de cellules souches. Le traitement par DMSO augmente la proportion de hiPSCs et de HESC s'au début de la phase G1 du cycle cellulaire et active la protéine rétinoblastome (Rb)3, un régulateur critique de la prolifération cellulaire, de la survie et de la différenciation4. Dans des travaux plus récents, il a été constaté que Rb et ses membres de la famille sont nécessaires pour les effets pro-différenciation de DMSO, de sorte que l'inactivation transitoire de Rb supprime les effets de DMSO, tandis que l'activation constitutive de Rb d'une manière transitoire améliore Effets de DMSO5. Analogue au cycle cellulaire au cours du développement embryonnaire, le cycle cellulaire des ESC et des iPSC est caractérisé par une phase G1 abrégée qui favorise l'auto-renouvellement6,7,8. Cette phase G1 abrégée permet une prolifération plus illimitée mais limite le potentiel de différenciation4,9. En favorisant l'arrêt de croissance dans G1 et en activant des contrôles de point de contrôle dans le cycle cellulaire des HESC et des iPSC, les cellules de traitement de DMSO des nombres premiers pour des changements de destin de cellules suivant la différenciation dirigée.
À ce jour, il a été démontré que le prétraitement DMSO améliore la capacité de différenciation des trois couches germinales dans plus de 30 lignées cellulaires humaines SPÉCIFIQUES à l'ESC et à l'iPSC3,5 ainsi que la différenciation des cellules souches et d'autres lignées cellulaires à une variété d'autres types de cellules matures dans les études ultérieures10,11,12,13,14,15,16, 17 Annonces , 18 ans, états-unis qui , 19 ans, états-unis qui , 20 Ans, états-unis , 21 Ans, états-unis , 22 Ans , 23 Ans, états-unis , 24 Ans, états-unis , 25 Annonces , 26 Annonces , 27 Annonces , 28 (Tableau 1). En outre, le traitement DMSO s'est avéré efficace pour améliorer la différenciation des cellules primaires non humaines21,23 (p. ex. souris, primate, lapin), suggérant des mécanismes partagés entre les espèces. Enfin, le prétraitement DMSO a également été étendu à la technologie d'édition de gènes, avec une étude particulière montrant que 24 h DMSO prétraitement des HESC / iPSCs considérablement augmenté la capacité de Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) /CRISPR-associé protéine-9 (Cas9)-mediated efficacité d'édition de l'ADN non-codage sans incorporer des mutations involontaires29. Fourni ici est une méthodologie détaillée du prétraitement DMSO des HESC et iPSCs pour des applications dans la biologie des cellules souches et la différenciation dirigée.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:651px;" width="651">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">21985023</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">9-Position stir plate&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Chemglass</td>
			<td style="width:135px;">CLS-4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Accutase</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">11105-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Activin A</td>
			<td style="width:135px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>338-AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Advanced RPMI</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">12633012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alk5i II</td>
			<td style="width:135px;">Axxora</td>
			<td style="width:135px;">ALX-270-445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">all-trans retinoic acid&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-Brachyury</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">AF2085</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:215px;">anti-C-peptide</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:135px;">GN-ID4</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-FoxA2</td>
			<td style="width:135px;">Millipore</td>
			<td>07-633</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-Nkx2.2</td>
			<td>University of Iowa, Developmental Hybridoma Bank</td>
			<td>74.5A5</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-Nkx6.1</td>
			<td>University of Iowa, Developmental Hybridoma Bank;&#160;</td>
			<td style="width:135px;">F55A12-supernatant</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-Olig2</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:135px;">MABN50</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-Pax-6</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td style="width:135px;">901301</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-Pdx1</td>
			<td style="width:135px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>AF2419</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-SOX1&#160;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">AF3369</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-SOX17</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">AF1924</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:215px;">B-27 Supplement, minus Vitamin A</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">basic fibroblast growth factor</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>PHG0264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Betacellulin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>50932345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chir99021</td>
			<td style="width:135px;">Stemgent</td>
			<td>04-000-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">CMRL 1066</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">99-603-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:215px;">Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td style="width:135px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:135px;">AMQAF1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:135px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:135px;">G7528&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">DAPI</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:135px;">D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Disposable Spinner Flasks</td>
			<td style="width:135px;">Corning, VWR</td>
			<td style="width:135px;">89089-814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">DMEM/F-12</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">DMSO&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Essential 6 Media</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>A1516501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">FAF-BSA</td>
			<td style="width:135px;">Proliant&#160;</td>
			<td style="width:135px;">68700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">FGF7</td>
			<td style="width:135px;">PeproTech</td>
			<td style="width:135px;">100-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Geltrex</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>A1413202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">GlutaMAX&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Heparin&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:135px;">H3149&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Ultrasensitive Insulin ELISA</td>
			<td>ALPCO Diagnostics</td>
			<td>80-INSHUU-E01.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">ITS-X</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:135px;">51500056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KGF</td>
			<td style="width:135px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">AF-100-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Knockout DMEM</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>10829018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">KnockOut Serum Replacement</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-3,3&#8242;,5-Triiodothyronine (T3)</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:135px;">642245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">LDN193189</td>
			<td style="width:135px;">Stemgent</td>
			<td>04-0074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Matrigel Matrix</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MCDB-131&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Cellgro&#160;</td>
			<td style="width:135px;">15-100-CV&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">MEM NEAA</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:215px;">mTeSR 1</td>
			<td style="width:135px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:135px;">5850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">N2 Supplement</td>
			<td style="width:135px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:135px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:135px;">S3817&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Noggin Fc Chimera Protein</td>
			<td style="width:135px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">3344-NG-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PdBU</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:135px;">524390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Mediatech&#160;</td>
			<td style="width:135px;">30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">RPMI</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sant1</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">S4572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SB431542</td>
			<td style="width:135px;">Stemgent</td>
			<td>04-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Smoothened Agonist, SAG</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td>566660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">StemPro Accutase</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>A1110501&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">TrypLE</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">12604013</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:215px;">Ultra-Low Attachment Microplates</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td>3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Vitamin C</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">A4544&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Wnt3a</td>
			<td style="width:135px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>5036-WN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">XAV 939</td>
			<td style="width:135px;">Tocris</td>
			<td style="width:135px;">3748</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">XXI</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:135px;">565790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Y-27632</td>
			<td style="width:135px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:135px;">72302</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transient treatment of human pluripotent stem cells with dmso to promote differentiation

Malgré l'utilisation croissante de cellules souches pluripotentes (CSP), des difficultés demeurent pour différencier efficacement les cellules souches embryonnaires et induites (ESC et iPSC) à travers diverses lignées. De nombreux protocoles de différenciation ont été développés, mais la variabilité entre les lignées cellulaires et les faibles taux de différenciation posent des défis dans la mise en œuvre réussie de ces protocoles. Décrit ici est un moyen facile et peu coûteux pour améliorer la capacité de différenciation des CFP. Il a déjà été démontré que le traitement des cellules souches ayant une faible concentration de sulfoxide de diméthyle (DMSO) augmente considérablement la propension d'une variété de CSP à se différencier de différents types de cellules suivant la différenciation dirigée. Cette technique s'est maintenant avérée efficace entre différentes espèces (p. ex. souris, primateet stupéfères) en plusieurs lignées, allant des neurones et des sphéroïdes corticaux aux cellules musculaires lisses et aux hépatocytes. Le prétraitement DMSO améliore la différenciation de la PSC en régulant le cycle cellulaire et en amorçant les cellules souches pour être plus sensible aux signaux de différenciation. Fourni ici est la méthodologie détaillée pour utiliser cet outil simple comme un moyen reproductible et largement applicable pour différencier plus efficacement LES CFP à toute lignée de choix.

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Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation

Générer des types de cellules différenciées des cellules souches pluripotentes humaines (HPSC) est très prometteur sur le plan thérapeutique, mais demeure difficile. Les CFP présentent souvent une incapacité inhérente à se différencier même lorsqu'elles sont stimulées par un bon ensemble de signaux. Décrit ici est un outil simple pour améliorer la différenciation multilinéaire à travers une variété de lignes de PSC.

Traitement transitoire des cellules souches pluripotentes humaines avec DMSO pour promouvoir la différenciation

Despite the growing use of pluripotent stem cells (PSCs), challenges in efficiently differentiating embryonic and induced pluripotent stem cells (ESCs and ...

Il s’agit d’un traitement simple qui peut être appliqué à n’importe quelle lignée de cellules souches ou protocole de différenciation aux cellules de choix pour la différenciation. Tout ce qu’on a à faire est d’ajouter DMSO à 1-2% dans le milieu de maintenance de la culture cellulaire. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’augmenter significativement le potentiel de différenciation des cellules souches pluripotentes dans n’importe quelle lignée de choix en amorçant les cellules pour la différenciation.Le traitement par DMSO augmente les chances que les cellules se différencient des iPSC dérivés du patient, ce qui leur permet d’être utilisées pour la thérapie de remplacement cellulaire, la modélisation des maladies et le dépistage des médicaments. Elle peut donner lieu à l’apparition précoce d’une réglementation qui contrôle la sous-prolifération, la différenciation et les spécifications au cours du développement embryonnaire. Nous avons démontré que le traitement DMSO améliore la différenciation dans près de 50 lignées de cellules souches pluripotentes embryonnaires et induites.Alors que d’autres laboratoires ont montré qu’il est bénéfique pour les cellules souches d’autres espèces, comme la souris et le primate. Un jour avant le début de la différenciation, ajoutez DMSO à une concentration de 1 ou 2% pendant 24 heures dans votre support d’entretien typique. 24 heures après le traitement DMSO, remplacez le milieu et procédez à votre protocole de différenciation habituel.Cultiver des cellules selon les instructions manuscrites. Lorsque les cellules atteignent une confluence appropriée, dissociez-les et préparez une suspension à cellule unique. Comptez les cellules vivantes à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur de cellules automatiques, à l’aide d’un marqueur de viabilité tel que le bleu trypan.Afin d’atteindre 80-90% confluency dans le pré-traitement de 24 heures DMSO, plaquez les cellules sur une plaque enduite de six puits à une densité de 500.000 à 1 million de cellules par puits. Incuber les cellules pendant 24 heures à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone. Ensuite, aspirez les médias et remplacez-les par une solution DMSO de 1 à 2 %.Laissez les cellules couver pendant 24-28 heures avant la différenciation. Si vous couvez pendant 48 heures, remplacez le média après 24 heures par une solution DMSO fraîche. Pour atteindre la différenciation de la culture 3D, grandir et recueillir les cellules dans une suspension cellulaire.Comptez les cellules vivantes et plaquez-les dans une plaque de six puits non encoated et à faible attachement dans les médias de cellules souches avec inhibiteur de ROCK. En règle générale, des sphères de cellules souches pluripotentes humaines 3D se forment dans les 24 heures. Laissez les cellules couver pendant 24 heures à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone.Préparer 1-2%DMSO dans les médias de cellules souches préchauffées selon les instructions manuscrites. Pour remplacer le média après l’incubation, inclinez la plaque à un angle de 30 à 45 degrés et laissez les sphères cellulaires s’installer au fond du puits. Aspirez les supports des cellules et suspendez-les doucement dans la solution DMSO.Laissez les cellules couver pendant 24-48 heures à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone. Pré-traiter les cellules avec DMSO tel que décrit pour les cultures 2D, et préparer noggin et SB431542 solutions de stock. Préparez suffisamment de remplacement de sérum de 10%KNOCKOUT, ou KOSR, dans knockout DMEM pour trois à quatre jours de changement de médias.Préparez des supports de différenciation ectodermique en ajoutant de la noggine et du SB431542 au DMEM KO KOSR préchauffé tel que décrit dans le manuscrit. Après le prétraitement du DMSO, aspirer les médias des cellules et ajouter deux millilitres de médias de différenciation à chaque puits. Laissez les cellules couver pendant trois à quatre jours à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone, remplaçant quotidiennement les médias par de nouveaux facteurs de différenciation.Le pré-traitement du DMSO entraîne une diminution transitoire et dépendante de la dose du taux de croissance cellulaire par rapport aux cellules non traitées. Cette diminution de la prolifération est associée à une augmentation du contact cellule à cellule, qui est particulièrement prononcée dans les cellules traitées à 2 % par le DMSO. Lorsque les cellules sont fixées et tachées pour les marqueurs prototypiques de chaque couche germinale, on peut voir que 2% DMSO pré-traitement entraîne une proportion accrue de cellules différenciées couche germinale.Par exemple, SOX17 a été taché pour visualiser les cellules endoderm. Afin d’étudier l’effet du DMSO sur la différenciation des types de cellules progénitrices du système nerveux central, les cellules souches pluripotentes induites par l’homme pourraient être différenciées en cellules progénitrices neurales ou en cellules progénitrices oligodendrocytes. Comparé aux cellules de contrôle, le pré-traitement de 2%DMSO augmente l’expression du marqueur de cellules progénitrices neurales Pax6.De même, le pré-traitement augmente la proportion de cellules exprimant oligodendrocyte marqueur cellulaire ancêtre Olig2. En outre, le traitement initial de DMSO améliore la fonction embryonnaire humaine de cellules souches dérivées après transplantation in vivo. Lorsque des cellules progénitrices pancréatiques différenciées sont transplantées sur des souris immunodéficientes, leur fonctionnalité peut être testée en réponse à un défi de glucose ou à une stimulation KCl.Les améliorations de la fonctionnalité cellulaire sont évidentes de deux semaines à 16 semaines après la transplantation. La considération la plus importante à prendre en compte est le temps de cycle ou de doublement de vos cellules souches. La durée du traitement DMSO devrait être la même que le temps de cycle des cellules.Après le traitement initial du DMSO, on peut comprendre comment la prolifération cellulaire et le cycle cellulaire sont régulés dans les cellules souches, car le traitement aide à promouvoir l’arrêt de la croissance dans la phase G1 du cycle cellulaire. Les cellules différenciées peuvent être utilisées pour comprendre les mécanismes liés à la maladie, pour la co-culture avec d’autres types de cellules, dans les tests de tumorigénicité, et dans des analyses fonctionnelles ou des études de transplantation pour déterminer si les cellules différenciées peuvent sauver un phénotype de la maladie.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Stencil Micropatterning of Human Pluripotent Stem Cells for Probing Spatial Organization of Differentiation Fates

Stencil micromodelage des pluripotentes humaines Cellules souches pour Probing Organisation spatiale des Différenciation Fates

Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into ...

Recherche

Biologie du développement

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Production à grande échelle de cardiomyocytes à partir pluripotentes humaines cellules souches en utilisant un petit protocole Différenciation Molecule-Based hautement reproductible

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays

Rapid Neuronal Différenciation des Induced cellules souches pluripotentes pour mesurer l&#39;activité réseau sur Arrays Micro-électrode

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Réalisé la différenciation des progéniteurs hématopoïétiques primitives et définitif des cellules souches pluripotentes humaines

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Différenciation efficace de pluripotentes cellules souches à NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; pancréatiques progéniteurs

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

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We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a Na&#239;ve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency

Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a NaÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¯ve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency

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Na&#239;ve human pluripotent stem cells (N-hPSC) with improved functionality may have a wide impact in regenerative medicine. The goal of this protocol is ...

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Efficace et évolutive différenciation dirigée de cliniquement compatibles cornéenne limbique épithéliales cellules souches à partir des cellules souches pluripotentes humaines

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Différenciation efficace des cellules souches pluripotentes humaines en cellules hépatiques

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...