Name: transient treatment of human pluripotent stem cells with dmso to promote differentiation
Uploaded: 2019-07-17T14:30:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch Stipendien der Stanford University School of Medicine und ein Siebel Fellowship an S. C. unterstützt.

1. Stammzellpflege
HINWEIS: Das unten beschriebene Zellerhaltungsprotokoll gilt für pluipotente Stammzellen (PSCs), die in einer anhaftenden Monoschicht gehalten werden. Medien, andere Reagenzien und Zellkulturplatten, die vor der DMSO-Behandlung verwendet werden, können bei Bedarf angepasst werden. Für alle folgenden Protokolle in diesem Manuskript sollten Zellen unter einem biologischen Sicherheitsschrank behandelt werden.
<ol><li>Mantel sterile, 6 Brunnen, gewebekulturbehandelte Platten mit einer pluripotenten Stammzell-qualifizierten Matrix oder Substrat, die nach Herstelleranleitung hergestellt und mindestens 1 h in einem CO2-Inkubator (5% CO2, feuchte Atmosphäre) inkubiert werden. Beschichtete Platten können bis zu einer Woche bei 4 °C eingewickelt und gelagert werden.</li>
	<li>Die kryokonservierten PSCs in einem 37 °C-Wasserbad auftauen. Sterilisieren Sie die Durchstechflasche mit Ethanol vor der Einführung in den biologischen Sicherheitsschrank und übertragen Sie die Zellen dann sofort durch Pipettieren in ein steriles konisches Rohr, das 5-10 Bände vorgewärmter Stammzellmedien enthält.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 5 min bei Raumtemperatur (RT).</li>
	<li>Die Medien ansaugen und das Zellpellet in 1 ml Stammzellmedium, ergänzt durch einen 10-M-ROCK-Hemmer, wie Y-27632, sanft wieder aufsetzen.</li>
	<li>Saugen Sie die Kulturmatrix aus der Platte und säen Sie die Zellen mit der gewünschten Dichte, typischerweise 0,5-1 x 106 Zellen pro Brunnen in mindestens 2 ml Stammzellmedium pro Brunnen. HINWEIS: Die Beschichtungsdichte kann zwischen verschiedenen Zelllinien und Klone variieren und sollte entsprechend optimiert werden.</li>
	<li>Pflegen Sie die Zellen, indem Sie sie täglich durch vorgewärmte Stammzellenmedien ersetzen. Teilen Sie die Zellen bei etwa 70%-80% Konfluenz oder wenn die Zellkolonien beginnen, Kontakt aufzunehmen.</li>
	<li>Zum Spalten von Zellen, aspirieren Sie die Medien und waschen Sie die Zellen einmal mit sterilen PBS. Inkubieren Sie die Zellen mit 1 ml einer Dissoziationsenzymlösung pro Brunnen für 5-10 Minuten bei 37 °C.</li>
	<li>Waschen und suspendieren Sie die Zellen mit vorgewärmten Stammzellmedien und übertragen Sie sie in ein steriles konisches Rohr mit 5-10 Volumen Stammzellmedien. Folgen Sie den Schritten 1.3-1.7, um die Zellen zu verkleben.</li>
</ol>2. DMSO Vorbehandlung
HINWEIS: Bei der Beschichtung der Zellen für die DMSO-Vorbehandlung vor der Differenzierung sollte die Anfangsbeschichtungszelldichte unter Berücksichtigung der typischen Wachstumsrate der Stammzelllinie sowie des verwendeten Differenzierungsprotokolls optimiert werden. Validieren Sie Diepuripotenz mit herkömmlichen Markern, je nach Bedarf. Die Zellen sollten nach dem anfänglichen Auftauen vor der Differenzierung mindestens 1x-2x durchgesiepft werden.
<ol><li>
2D-Kulturdifferenzierung
	<ol>
<li>Wenn die Zellen eine geeignete Konfluenz erreichen, bereiten Sie beschichtete Platten vor, dissoziieren Sie die Zellen und bereiten Sie eine einzellige Suspension wie oben beschrieben vor.</li>
		<li>Zählen Sie die lebenden Zellen mit einem Hämozytometer oder einem automatischen Zellzähler einschließlich Trypanblau oder einem anderen Lebensfähigkeitsmarker.</li>
		<li>Die Zellen mit dem 10-M-ROCK-Hemmer auf eine beschichtete 6-Well-Platte bei 0,5-1 x 106 Zellen pro Brunnen in Stammzellenmedien geben. HINWEIS: Für die in unserem Labor getesteten Zelllinien führten diese Dichten in der Regel zu 80%-90% Konfluentzellen innerhalb der 24 h DMSO-Vorbehandlung.</li>
		<li>Zellen 24 h bei 37 °C in einem CO2-Inkubator (5% CO2, feuchte Atmosphäre) brüten lassen.</li>
		<li>Bereiten Sie 1%-2% DMSO in vorgewärmten Stammzellenmedien vor (z. B. 100 l DMSO in 10 ml Medien = 1% DMSO-Lösung oder 200 -L DMSO in 10 ml Medien = 2% DMSO-Lösung).</li>
		<li>Nach 24 h Inkubation, aspirieren Sie die Medien aus Zellen und ersetzen Sie es durch DMSO-Lösung.</li>
		<li>Lassen Sie die Zellen vor der Differenzierung 24 h bis 48 h bei 37 °C in einem CO2-Inkubator (5% CO2 , feuchte Atmosphäre) brüten. HINWEIS: Typischerweise ist eine 24-h-DMSO-Behandlung in der Mehrzahl der menschlichen ESC- und iPSC-Linien ausreichend. Zelllinien mit sehr langsamen Wachstumsraten (lange Verdoppelungszeiten) können von der 48-Stunden-Inkubation mit DMSO profitieren. Für eine 48 h Inkubation mit DMSO können Medien nach den ersten 24 h der Behandlung durch frische Stammzellmedien mit 1%-2% DMSO ersetzt werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
3D-Kulturdifferenzierung:
	<ol>
<li>Wenn die Zellen eine geeignete Konfluenz erreichen, dissoziieren und sammeln Sie die Zellen in einer Zellsuspension, wie oben beschrieben.</li>
		<li>Zählen Sie die lebenden Zellen mit einem Hämozytometer oder einem automatischen Zellzähler einschließlich eines Lebensfähigkeitsmarkers.</li>
		<li>Die Zellen in einer unbeschichteten, niedrig aufsatzenden 6-Well-Platte bei 0,5-1 x 106 Zellen pro Brunnen in Stammzellmedien mit 10 M ROCK-Hemmer. HINWEIS: Für die in unserem Labor getesteten Zelllinien führten diese Dichten in der Regel zu einer 3D-hPSC-Kugelbildung innerhalb von 24 h von Einstellzellen.</li>
		<li>Zellen 24 h bei 37 °C in einem CO2-Inkubator (5% CO2, feuchte Atmosphäre) brüten lassen.</li>
		<li>Bereiten Sie 1%-2% DMSO in vorgewärmten Stammzellenmedien vor (z. B. 100 l DMSO in 10 ml Medien = 1% DMSO-Lösung oder 200 l DMSO in 10 ml Medien = 2% DMSO-Lösung).</li>
		<li>Ersetzen Sie die Medien nach Standardverfahren (z. B. kippen Sie die Platte in einem 30°-45°-Winkel, damit sich Zellkugeln am Boden des Brunnens absetzen können; übertragen Sie Zellen in ein steriles konisches Rohr und lassen Sie Zellkugeln sich am Boden des Rohres absetzen; oder sammeln Sie Zellen sanft i n Suspension mit einer 5- oder 10-ml-Pipette in ein steriles konisches Rohr und Zentrifugenzellen bei 300 x g für 5 min bei RT).</li>
		<li>Aspirieren Sie die Medien aus Zellen und ersetzen Sie es durch DMSO-Lösung, Pipettierung sanft.</li>
		<li>Zellen vor der Differenzierung 24 h bis 48 h bei 37 °C in einem CO2-Inkubator (5% CO2, feuchte Atmosphäre) brüten lassen. HINWEIS: Typischerweise ist eine 24-h-DMSO-Behandlung in der Mehrzahl der menschlichen ESC- und iPSC-Linien ausreichend. Zelllinien mit sehr langsamen Wachstumsraten (lange Verdoppelungszeiten) können von der 48-Stunden-Inkubation mit DMSO profitieren. Für eine 48 h Inkubation mit DMSO können Medien nach den ersten 24 h der Behandlung durch frische Stammzellmedien mit 1%-2% DMSO ersetzt werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Differenzierung zu primären Keimschichten
HINWEIS: Im Folgenden werden Methoden beschrieben, die sich zuvor in unserem Labor für PSCs, die in einer Monoschicht auf 6 Brunnenplatten angebaut wurden, als wirksam erwiesen haben. Jedes Differenzierungsprotokoll nach Wahl sollte nach der DMSO-Behandlung verwendet werden, um die Differenzierung in gewünschte Linien zu fördern. Entfernen Sie die DMSO-Lösung nach einer 24-48 h Behandlung und fahren Sie mit der Differenzierung nach Standardprotokollen fort.
<ol><li>
Endoderm-Differenzierung (angepasst von Kroon et al.30)<ol>
<li>Pretreat-Zellen mit DMSO, wie oben beschrieben für 2D-Kulturen.</li>
		<li>Bereiten Sie Wnt3a und Activin A Aktienlösungen vor.</li>
		<li>Bereiten Sie Tag 1 endodermale Differenzierungsmedien vor, indem Sie Wnt3a zu einer Endkonzentration von 20 ng/ml und Activin A auf eine Endkonzentration von 100 ng/ml auf das entsprechende Volumen der vorgewärmten RPMI-Medien einteilen.</li>
		<li>Nach DMSO-Vorbehandlung Medien aus den Zellen aspirieren und durch Day 1-Medien ersetzen (z.B. 2 ml pro Brunnen einer 6-Well-Platte).</li>
		<li>Zellen 24 h bei 37 °C in einem CO2-Inkubator (5% CO2, feuchte Atmosphäre) brüten lassen.</li>
		<li>Bereiten Sie Die Tage 2 und 3 endodermalen Differenzierungsmedien vor, indem Sie Activin A zu einer Endkonzentration von 100 ng/ml auf das entsprechende Volumen der vorgewärmten RPMI-Medien einteilen.</li>
		<li>Medien aus den Zellen ansaugen und durch Day 2-Medien ersetzen (z.B. 2 ml pro Brunnen einer 6-Well-Platte).</li>
		<li>Lassen Sie die Zellen 24 h bei 37 °C in einem CO2-Inkubator (5% CO2, feuchte Atmosphäre) brüten. </li>
		<li>Medien aus den Zellen ansaugen und durch Day 3-Medien ersetzen (z.B. 2 ml pro Brunnen einer 6-Well-Platte).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mesoderm-Differenzierung (angepasst von Zhang et al.31)<ol>
<li>Zurückziehen Sie die Zellen mit DMSO, wie oben beschrieben für 2D-Kulturen.</li>
		<li>Bereiten Sie Wnt3a und Activin A Aktienlösungen vor.</li>
		<li>Bereiten Sie mesodermale Differenzierungsmedien vor, indem Sie Wnt3a zu einer Endkonzentration von 20 ng/ml und Activin A zu einer Endkonzentration von 100 ng/ml auf das entsprechende Volumen der vorgewärmten fortgeschrittenen RPMI-Medien hinzufügen.</li>
		<li>Nach DMSO-Vorbehandlung Medien aus Zellen aspirieren und durch Differenzierungsmedien ersetzen (z.B. 2 ml pro Brunnen einer 6-Well-Platte).</li>
		<li>Zellen 24 h bei 37 °C in einem CO2-Inkubator (5% CO2, feuchte Atmosphäre) brüten lassen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ectoderm-Differenzierung (angepasst von Chambers et al.32)<ol>
<li>Zurückziehen Sie die Zellen mit DMSO, wie oben beschrieben für 2D-Kulturen.</li>
		<li>Bereiten Sie Noggin und SB431542 Aktienlösungen vor.</li>
		<li>Bereiten Sie ektodermale Differenzierungbasismedien vor, indem Sie den Knockout-Serumersatz (KOSR) auf eine endgültige Konzentration von 10% in K.o.-DMEM auflösen. HINWEIS: Bereiten Sie genügend Basismedien für 3-4 Tage Medienwechsel vor.</li>
		<li>Bereiten Sie ektodermale Differenzierungsmedien vor, indem Sie Noggin zu einer Endkonzentration von 500 ng/mL und SB431542 zu einer Endkonzentration von 10 M auf das entsprechende Volumen des vorgewärmten KOSR/Knockout DMEM hinzufügen.</li>
		<li>Nach DMSO-Vorbehandlung Medien aus Zellen aspirieren und durch Differenzierungsmedien ersetzen (z.B. 2 ml pro Brunnen einer 6-Well-Platte).</li>
		<li>Lassen Sie Zellen 3-4 Tage bei 37 °C in einem CO2-Inkubator (5% CO2 , feuchte Atmosphäre) brüten und ersetzen Sie medientäglich durch frisch hinzugefügte Differenzierungsfaktoren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Differenzierung nach Vorläuferzelltypen
Im Folgenden werden Methoden beschrieben, die sich zuvor in unserem Labor für PSCs, die in 2D- oder 3D-Kulturen angebaut wurden, als wirksam erwiesen haben. Jedes Differenzierungsprotokoll nach Wahl sollte nach der DMSO-Behandlung verwendet werden, um die Differenzierung in gewünschte Linien zu fördern. Entfernen Sie die DMSO-Lösung nach einer 24-48 h Behandlung und fahren Sie mit der Differenzierung nach Standardprotokollen fort.
<ol><li>Neurale Vorläuferzelldifferenzierung (angepasst von Tchieu et al.33)<ol>
<li>Bereiten Sie 6 Wellplatten durch Beschichtung mit einer pluripotenten Stammzell-qualifizierten reduzierten WachstumsfaktorMatrix oder Substrat, nach DenerAnleitung des Herstellers, für mindestens 1 h in einem CO2-Inkubator (5% CO2, feuchte Atmosphäre). Beschichtete Platten können bis zu 1 Woche bei 4 °C eingewickelt und gelagert werden.</li>
		<li>Platten-PSCs, wie oben beschrieben, bei einer Dichte von 0,5-1 x 106 Zellen pro Brunnen in Stammzellmedien, die einen ROCK-Hemmer enthalten.</li>
		<li>Pretreat-Zellen mit DMSO, wie oben beschrieben für 2D-Kulturen.</li>
		<li>Bereiten Sie kleine chemische Inhibitoren LDN193189, SB431542 und XAV939 Stocklösungen vor.</li>
		<li>Bereiten Sie Tage 1-3 Neuroektoderm Differenzierung Medien durch Ergänzung Essential 6 Media mit 500 nM LDN193189, 10 M SB431542 und 2 M XAV939.</li>
		<li>Nach DMSO-Vorbehandlung die Medien aspirieren und durch Tage 1-3 Neuroektodermmedien ersetzen (z.B. 2 ml pro Brunnen einer 6-Well-Platte). Wechseln Sie täglich die Medien.</li>
		<li>Bereiten Sie Tage 4-12 Neuroektoderm Differenzierung Medien durch Ergänzung Essential 6 Media mit 500 nM LDN193189 und 10 M SB431542.</li>
		<li>An Tag 4 der Differenzierung, aspirieren Sie die Medien und ersetzen Sie durch Tage 4-12 Neurodektoderm Medien. Ändern Sie die Medien täglich.</li>
		<li>Nach 12 Tagen Differenzierung sollten differenzierte Zellen geeignete Marker von neuronalen Vorläuferzellen (NPCs) ausdrücken. NPCs können in neuronalen Medien, die DMEM/F-12, 2% B-27, 1% N-2 enthalten, weiter gepflegt und mit dem 10-g/ml-Basis-Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) ergänzt werden. Durchgehen sie die NPCs, wenn sie mit einer Zellablösung konfluent sind, und beschichten Sie NPCs mit 0,5-1 x 106 Zellen pro Bohrkörper.</li>
	</ol></li>
	<li>Oligodendrozyten-Vorläuferzelldifferenzierung (angepasst von Douvaras und Fossati34)<ol>
<li>Die PSCs wie oben beschrieben mit einer Dichte von 1 x 105 pro Brunnen auf beschichteten 6 Wellplatten in Stammzellmedien, die einen ROCK-Inhibitor enthalten, verplatten.</li>
		<li>Pretreat-Zellen mit DMSO, wie oben beschrieben für 2D-Kulturen.</li>
		<li>Bereiten Sie SB431542, LDN193189, All-Trans-Retinsäure (RA) und geglättete Agonisten (SAG) Lagerlösungen vor.</li>
		<li>Bereiten Sie Tage 0–8 Differenzierungsmedien vor, indem Sie DMEM/F-12 mit 10 M SB431542, 250 nM LDN193189 und 100 nM RA ergänzen.</li>
		<li>Nach DMSO-Vorbehandlung, inkubieren Zellen mit Differenzierungsmedien für 8 Tage, wechselnde Medien täglich mit frisch hinzugefügten Differenzierungsfaktoren (z.B. 2 ml pro Brunnen einer 6-Well-Platte).</li>
		<li>Ersetzen Sie am 8. Tag die Medien durch DMEM/F-12, das 1x MEM-nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA) Lösung, 1X L-Glutamin, 2-Mercaptoethanol, Penicillin/Streptomycin und 1x N-2 enthält, die 100 nM RA und 1 M SAG ergänzen. Ändern Sie die Medien täglich.</li>
		<li>Nach 12 Tagen Differenzierung sollten differenzierte Zellen geeignete Marker von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPCs) ausdrücken.</li>
	</ol></li>
	<li>Endokrine Vorläuferzelldifferenzierung (angepasst von Pagliuca et al.35)<ol>
<li>Seed PSCs bei 6 x 105 Zellen/ml in Stammzellenmedien plus 10 'M ROCK-Inhibitor in 500 ml Spinnerkolben, die auf einer 9-Positionen-Rührplatte mit einer Rotationsrate von 70 U/min in einem 37 °C-Inkubator, 5% CO2 und 100% Luftfeuchtigkeit platziert werden.</li>
		<li>Lassen Sie Cluster am unteren Rand des Kolbens absetzen, die Medien aspirieren und dann mit 1%-2% DMSO pretreaten.</li>
		<li>Bereiten Sie Activin A, Chir99021, KGF, Sant1, All-Trans-Retinoinsäure (RA), LDN193189, PdBU, XXI, Alk51, T3 und Betacelluin-Lagerlösungen vor.</li>
		<li>Vorbereiten von Differenzierungsbasismedien basierend auf der Formulierung in Tabelle 3.</li>
		<li>Nach DMSO-Vorbehandlung, Aspirat-Medien und ersetzen durch S1-Medien ergänzt durch 100 ng/ml Activin A und 3 mM Chir99021 (z.B. 500 ml pro Kolben). Inkubation für 24 h zulassen.</li>
		<li>Ersetzen Sie am 2. Tag Medien durch S1-Medien, die durch 100 ng/ml Activin A ergänzt werden. Inkubation für 2 Tage zulassen.</li>
		<li>Ersetzen Sie am 4. Tag Medien durch S2-Medien, die durch 50 ng/mL KGF ergänzt werden. Inkubation für 3 Tage zulassen, Medienwechsel nach den ersten 2 Tagen (Tag 6).</li>
		<li>Ersetzen Sie am 7. Tag Medien durch S3-Medien, ergänzt durch 50 ng/mL KGF, 0,25 mM Sant1, 2 mM RA und 200 nM LDN193189. Inkubation für 24 h zulassen.</li>
		<li>Ersetzen Sie am 8. Tag Medien durch S3-Medien, ergänzt durch 50 ng/mL KGF, 0,25 mM Sant1, 2 mM RA, 200 nM LDN193189 und 500 nM PdBU. Inkubation für 24 h zulassen.</li>
		<li>Ersetzen Sie am 9. Tag Medien durch S3-Medien, ergänzt durch 50 ng/mL KGF, 0,25 mM Sant1 und 100 nM RA. Inkubation für 5 Tage zulassen, Medienwechseln alle 2 Tage (Tag 11 und 13).</li>
		<li>Ersetzen Sie an den Tagen 14 und 16 Medien durch S5-Medien, die mit 0,25 mM Sant1, 100 nM RA, 1 mM XXI, 10 mM Alk5i II, 1 mM T3 und 20 ng/mL Betacellulin (4 Tage Gesamtinkubation) ergänzt werden.</li>
		<li>Ersetzen Sie an den Tagen 18 und 20 Medien durch S5-Medien, die mit 25 nM RA, 1 mM XXI, 10 mM Alk5i II, 1 mM T3 und 20 ng/mL Betacellulin ergänzt werden.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Immunzytochemische Validierung der Differenzierung
HINWEIS: Die folgenden Methoden beschreiben ein allgemeines immunzytochemisches Protokoll, das bei Bedarf angepasst werden kann. Primäre Antikörper sind solche, die zuvor in unserem Labor validiert wurden. Es können auch andere Techniken zur Validierung der Differenzierung eingesetzt werden (z. B. Durchflusszytometrie, qPCR, RNA-Sequenzierung, Western Blotting, funktionelle Assays usw.).
<ol><li>
Immunlabeling-Zellen
	<ol>
<li>Für 3D-Kulturen in Suspension, Platte ganze Zellcluster oder Cluster in einzellige Suspension auf beschichteten Platten für 18-24 h vor der Fixierung dispergiert.</li>
		<li>Medien aus anhaftenden Zellen ansaugen und kurz mit PBS bei RT auf einem Shaker waschen.</li>
		<li>Zur Zellfixierung, Aspirieren PBS und inkubieren Zellen mit 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS für 20 min bei RT auf Shaker. ACHTUNG: PFA-Bestände sollten aufgrund ihrer Toxizität unter einer Dunstabzugshaube hergestellt werden. Nicht einatmen und tragen Sie keine geeignete persönliche Schutzausrüstung.</li>
		<li>PfA entfernen und im richtigen chemischen Abfallbehälter entsorgen.</li>
		<li>Waschen Sie Zellen 3x mit PBS für mindestens 5 min pro Wäsche bei RT auf einem Shaker.</li>
		<li>Zur Zellpermeabilisation und -blockierung, inkubieren Zellen mit 5% Eselserum in 0,3% Triton-x 100/PBS für 1 h bei RT auf einem Shaker hergestellt.</li>
		<li>Bereiten Sie die primäre Antikörperlösung in derselben Lösung vor, die für die Permeabilisierung/Blockierung verwendet wird.</li>
		<li>Inkubieren Sie in Primärantikörperlösung über Nacht bei 4 °C auf Shaker.</li>
		<li>Nach der nächtlichen Inkubation die Zellen 3x mit PBS für mindestens 5 min pro Wäsche bei RT auf einem Shaker waschen.</li>
		<li>Bereiten Sie sekundäre Antikörperlösung in Permeabilisation /Blocking-Lösung vor.</li>
		<li>In sekundäre Antikörperlösung für 1 h bei RT auf einem Shaker inkubieren lassen.</li>
		<li>Aspirieren Sekundärantikörperlösung und Waschzellen 3x mit PBS für mindestens 5 min pro Wäsche bei RT auf einem Shaker.</li>
		<li>Inkubieren Sie Zellen mit DAPI oder einem anderen bevorzugten Marker für die entsprechende Inkubationszeit, und spülen Sie sie in PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bildquantifizierung
	<ol>
<li>Erfassen Sie mindestens drei Bilder pro Zustand auf einem Fluoreszenzmikroskop und/oder mit einer hochgehaltigen Screening-Plattform.</li>
		<li>Quantifizieren Sie den Prozentualen Anteil der positiven Zellen für jeden Marker, indem Sie die Gesamtzahl der Antikörper-gefärbten Zellen und die Gesamtzahl der Zellzahlen (basierend auf DAPI/Hoechst-Kernfärbung) mit unvoreingenommener Bildgebungssoftware (z. B. ImageJ) oder einer automatisierten Screening-Plattform für Analysen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Zusammenfassend beschreibt dieses Protokoll ein einfaches und kostengünstiges Werkzeug zur Verbesserung der Differenzierungskapazität von pluripotenten Stammzellen (PSCs) zu allen primären Keimschichten, verschiedenen Arten spezialisierter Vorläuferzellen und sogar funktionellen, ausgereiften Zelltypen in in vitro. und in vivo-Einstellungen. Illustriert sind spezifische Differenzierungsprotokolle, die sowohl in unserem Labor als auch in anderen effektiv reproduziert wurden, aber jedes Differenzierungsprotokoll nach der DMSO-Behandlung verwendet werden kann. Wie in Tabelle 1dargestellt, haben eine Reihe von Laboratorien auch eine Verbesserung der PSC-Differenzierung nach vorübergehender DMSO-Behandlung unter Verwendung verschiedener Paradigmen zur Generierung verschiedener anderer Terminalzelltypen gezeigt. Obwohl die hier beschriebenen Methoden die Verwendung menschlicher PSCs beschreiben, kann die DMSO-Vorbehandlung artübergreifend eingesetzt werden und hat sich bei Maus-, Kaninchen- und Primaten-PSCs als wirksam erwiesen.
Obwohl höhere Dosen von DMSO bekannt ermaßen zytotoxisch sind, sind die niedrigen Dosen, die bei dieser Methode verwendet werden (1%-2%) für einen vorübergehenden Zeitraum zu einem minimalen Zelltod führen. Während die Gesamtzellzahlen unmittelbar nach der DMSO-Behandlung aufgrund der DMSO-Förderung des Zellzyklusstillstands in der G1-Phase des Zellzyklus abnehmen können, zeigen frühere Studien, dass Zellen in der Lage sind, das gleiche Maß an Konfluenz wie Kontrollkulturen nach Entfernung von DMSO3.
Der Prozentsatz und die Dauer der DMSO-Vorbehandlung sollten pro Zelllinie optimiert werden. Die Behandlungszeit sollte unter Berücksichtigung der Zyklus-/Verdoppelungszeit der Zellen angepasst werden. Beispielsweise haben Maus-PSCs in der Regel viel kürzere Zykluszeiten von etwa 15 h; daher ist eine DMSO-Behandlung für 15 h für diese Zellen ausreichend. Einige Labore haben auch festgestellt, dass die DMSO-Behandlung vorteilhaft ist, wenn sie während des Differenzierungsprotokolls oder in niedrigeren Konzentrationen fortgesetzt wird (siehe Tabelle 1). Es sei darauf hingewiesen, dass einige PSC-Linien besser für die Differenzierung nach bestimmten Linien geändert werden können. Zum Beispiel haben sich HUES6-Zellen als weniger differenziell erwiesen und hatten daher eine deutliche Verbesserung mit der DMSO-Behandlung (Abbildung 2). Alternativ haben HUES8-Zellen, die in Abbildung 4 und Abbildung 5 verwendet werden, eine höhere Neigung zur endodermalen Differenzierung; daher wurden in den Anfangsphasen weniger Unterschiede zwischen Kontrolle und DMSO zur Differenzierung in Richtung endgültiger Endoderm festgestellt. Nichtsdestotrotz wird die Verbesserung der DMSO-Vorbehandlung in späteren Stadien der Differenzierung in dieser Zelllinie beobachtet (Abbildung 4B). Die DMSO-Behandlung ist auch vielseitig, da sie sowohl in 2D- als auch in 3D-Zellkulturen wirksam ist, sie kann mit verschiedenen Arten von Beschichtungsmaterial auf Zellkulturplatten verwendet werden, und sie arbeitet in verschiedenen Arten von Wartungsmedien, die das Wachstum und die Expansion von hPSCs (z. B. mTeSR, E8, MEF-konditionierte Medien usw.).
Allgemeiner betrachtet deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass der Ausgangszustand pluripotenter Stammzellen einen starken Einfluss auf die Neigung zur anfänglichen Differenzierung sowie zur terminalen Differenzierung in funktionelle Zelltypen hat. Wir haben bereits gezeigt, dass die DMSO-Behandlung durch Rb in hPSCs3,5funktioniert. Rb spielt eine wichtige Rolle bei der Förderung der terminalen Differenzierung, des Zellüberlebens und der genetischen Stabilität der Zellen41,42,43,44, und es kann daher die anhaltenden Auswirkungen auf Zellen erklären dmSO-behandelten hPSCs unterschieden. Die Ausrichtung auf diese frühen Regulierungsweisen kann hPSCs auf einen besseren Weg zur Differenzierung bringen und letztlich ihren Nutzen für die regenerative Medizin verbessern.

Der Einsatz pluripotenter Stammzellen hat zu zahlreichen Fortschritten in der biomedizinischen Forschung geführt, darunter die Bereiche regenerative Medizin und stammzellbasierte Therapien, Krankheitsmodellierung und Arzneimittelscreening. Es hat auch zu der allgemeinen Aussicht auf mehr übersetzbare Forschung und personalisierte Medizin geführt. Das Aufkommen der induzierten pluripotenten Stammzelltechnologie (iPSC) vor über 20 Jahren hat es Forschern ermöglicht, pluripotente Stammzellen aus somatischen Geweben zu entwickeln und sie in funktionelle Zelltypen zu differenzieren, um eine Vielzahl von Pathologien zu untersuchen, einschließlich Herz-Kreislauf-, neurologischen und immunologischen Erkrankungen. Obwohl bei der Stammzelldifferenzierungstechnologie erhebliche Fortschritte erzielt wurden, bestehen nach wie vor Herausforderungen bei der effektiven Differenzierung menschlicher embryonaler Stammzellen (hESCs) und iPSCs, wodurch der weit verbreitete Einsatz von Stammzelltechnologie in verschiedenen Forschungsprogramme. Die inhärente Variabilität zwischen verschiedenen Zelllinien und Klonen stellt weiterhin Hindernisse für die Unterscheidung von Stammzelllinien auf gewünschte Linages1dar. Darüber hinaus bleibt die Ableitung ausgereifter, terminal differenzierter Funktionszellen aus hPSCs ein mühsamer und ineffizienter Prozess über viele Linien hinweg. Tatsächlich können sich Zellen, die von hPSCs unterschieden, oft nicht endlos in funktionelle Zellen differenzieren2. Bei weiteren, auf Stammzellen basierenden Therapien zur Anwendung bei Patienten ist es notwendig, die Wirksamkeit von Zellen, die aus hPSCs erzeugt werden, zu verbessern und sicherzustellen.
Unser Labor hat ein schnelles, kostengünstiges Tool entwickelt, um die Effizienz der Unterscheidung von iPSCs und ESCs in ausgereifte Zelltypen deutlich zu verbessern. Wir fanden heraus, dass die Vorbehandlung von HiPSCs und hESCs mit dem häufig verwendeten Reagenz Dimethylsulfoxid (DMSO) für 24 h bis 48 h vor der gerichteten Differenzierung zu einer deutlichen Verbesserung der Stammzelldifferenzierungskapazität führt. Die Behandlung mit DMSO erhöht den Anteil von HiPSCs und hESCs in der frühen G1-Phase des Zellzyklus und aktiviert das Retinoblastom-Protein (Rb)3, einen kritischen Regulator für Zellproliferation, Überleben und Differenzierung4. In neueren Arbeiten wurde festgestellt, dass Rb und seine Familienmitglieder für die Pro-Differenzierungseffekte von DMSO erforderlich sind, so dass die vorübergehende Inaktivierung von Rb die Wirkungen von DMSO unterdrückt, während die konstitutive Aktivierung von Rb in vorübergehender Weise Wirkungen von DMSO5. Analog zum Zellzyklus während der embryonalen Entwicklung ist der Zellzyklus von ESCs und iPSCs durch eine abgekürzte G1-Phase gekennzeichnet, die die Selbsterneuerungfördert 6,7,8. Diese abgekürzte G1-Phase ermöglicht eine uneingeschränktere Proliferation, begrenzt aber das Differenzierungspotenzial4,9. Durch die Förderung des Wachstumsstillstands in G1 und die Aktivierung von Checkpoint-Kontrollen im Zellzyklus von hESCs und iPSCs grundiert die DMSO-Behandlung Zellen für Zellschicksale nach gezielter Differenzierung.
Bisher hat sich gezeigt, dass die DMSO-Vorbehandlung die Differenzierungsfähigkeit zu allen drei Keimschichten in über 30 kontroll- und krankheitsspezifischen menschlichen ESC- und iPSC-Zelllinien3,5 sowie die Differenzierung von Stammzellen und anderen Zelllinien zu einer Vielzahl anderer ausgereifter Zelltypen in nachfolgenden Studien10,11,12,13,14,15,16, 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 (Tabelle 1). Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass die DMSO-Behandlung wirksam ist, um die Differenzierung der nichtmenschlichen Primärzellen21,23 (z. B. Maus, Primaten, Kaninchen) zu verbessern, was auf gemeinsame Mechanismen zwischen den Arten hindeutet. Schließlich wurde die DMSO-Vorbehandlung auch auf die Gen-Editing-Technologie ausgedehnt, wobei eine spezielle Studie zeigte, dass die 24-h-DMSO-Vorbehandlung von hESCs/iPSCs die Fähigkeit von Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) signifikant erhöhte. /CRISPR-assoziiertes Protein-9 (Cas9)-vermittelte Bearbeitungseffizienz von nicht-kodierender DNA ohne unbeabsichtigte Mutationen29. Hier ist eine detaillierte Methodik der DMSO-Vorbehandlung von hESCs und iPSCs für Anwendungen in der Stammzellbiologie und gezielten Differenzierung vorgesehen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:651px;" width="651">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">21985023</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">9-Position stir plate&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Chemglass</td>
			<td style="width:135px;">CLS-4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Accutase</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">11105-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Activin A</td>
			<td style="width:135px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>338-AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Advanced RPMI</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">12633012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alk5i II</td>
			<td style="width:135px;">Axxora</td>
			<td style="width:135px;">ALX-270-445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">all-trans retinoic acid&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-Brachyury</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">AF2085</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:215px;">anti-C-peptide</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:135px;">GN-ID4</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-FoxA2</td>
			<td style="width:135px;">Millipore</td>
			<td>07-633</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-Nkx2.2</td>
			<td>University of Iowa, Developmental Hybridoma Bank</td>
			<td>74.5A5</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-Nkx6.1</td>
			<td>University of Iowa, Developmental Hybridoma Bank;&#160;</td>
			<td style="width:135px;">F55A12-supernatant</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-Olig2</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:135px;">MABN50</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-Pax-6</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td style="width:135px;">901301</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-Pdx1</td>
			<td style="width:135px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>AF2419</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-SOX1&#160;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">AF3369</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-SOX17</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">AF1924</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:215px;">B-27 Supplement, minus Vitamin A</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">basic fibroblast growth factor</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>PHG0264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Betacellulin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>50932345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chir99021</td>
			<td style="width:135px;">Stemgent</td>
			<td>04-000-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">CMRL 1066</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">99-603-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:215px;">Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td style="width:135px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:135px;">AMQAF1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:135px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:135px;">G7528&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">DAPI</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:135px;">D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Disposable Spinner Flasks</td>
			<td style="width:135px;">Corning, VWR</td>
			<td style="width:135px;">89089-814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">DMEM/F-12</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">DMSO&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Essential 6 Media</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>A1516501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">FAF-BSA</td>
			<td style="width:135px;">Proliant&#160;</td>
			<td style="width:135px;">68700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">FGF7</td>
			<td style="width:135px;">PeproTech</td>
			<td style="width:135px;">100-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Geltrex</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>A1413202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">GlutaMAX&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Heparin&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:135px;">H3149&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Ultrasensitive Insulin ELISA</td>
			<td>ALPCO Diagnostics</td>
			<td>80-INSHUU-E01.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">ITS-X</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:135px;">51500056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KGF</td>
			<td style="width:135px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">AF-100-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Knockout DMEM</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>10829018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">KnockOut Serum Replacement</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-3,3&#8242;,5-Triiodothyronine (T3)</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:135px;">642245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">LDN193189</td>
			<td style="width:135px;">Stemgent</td>
			<td>04-0074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Matrigel Matrix</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MCDB-131&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Cellgro&#160;</td>
			<td style="width:135px;">15-100-CV&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">MEM NEAA</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:215px;">mTeSR 1</td>
			<td style="width:135px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:135px;">5850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">N2 Supplement</td>
			<td style="width:135px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:135px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:135px;">S3817&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Noggin Fc Chimera Protein</td>
			<td style="width:135px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">3344-NG-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PdBU</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:135px;">524390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Mediatech&#160;</td>
			<td style="width:135px;">30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">RPMI</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sant1</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">S4572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SB431542</td>
			<td style="width:135px;">Stemgent</td>
			<td>04-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Smoothened Agonist, SAG</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td>566660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">StemPro Accutase</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>A1110501&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">TrypLE</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">12604013</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:215px;">Ultra-Low Attachment Microplates</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td>3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Vitamin C</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">A4544&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Wnt3a</td>
			<td style="width:135px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>5036-WN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">XAV 939</td>
			<td style="width:135px;">Tocris</td>
			<td style="width:135px;">3748</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">XXI</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:135px;">565790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Y-27632</td>
			<td style="width:135px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:135px;">72302</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transient treatment of human pluripotent stem cells with dmso to promote differentiation

Trotz des zunehmenden Einsatzes pluripotenter Stammzellen (PSCs) bleiben Herausforderungen bei der effizienten Differenzierung embryonaler und induzierter pluripotenter Stammzellen (ESCs und iPSCs) über verschiedene Abstammungslinien bestehen. Zahlreiche Differenzierungsprotokolle wurden entwickelt, doch Variabilität über Zelllinien hinweg und niedrige Differenzierungsraten stellen herausforderunglichen Herausforderungen bei der erfolgreichen Implementierung dieser Protokolle dar. Hier wird beschrieben, dass die Differenzierungskapazität von PSCs einfach und kostengünstig verbessert werden kann. Es wurde bereits gezeigt, dass die Behandlung von Stammzellen mit einer geringen Konzentration von Dimethylsulfoxid (DMSO) die Neigung einer Vielzahl von PSCs, sich nach gezielter Differenzierung zu verschiedenen Zelltypen zu unterscheiden, signifikant erhöht. Diese Technik hat sich nun bei verschiedenen Arten (z. B. Maus, Primaten und Mensch) in mehreren Linien bewährt, von Neuronen und kortikalen Sphäroiden bis hin zu glatten Muskelzellen und Hepatozyten. Die DMSO-Vorbehandlung verbessert die PSC-Differenzierung, indem sie den Zellzyklus reguliert und Stammzellen grundiert, um besser auf Differenzierungssignale reagieren zu können. Hier ist die detaillierte Methodik für die Verwendung dieses einfachen Werkzeugs als reproduzierbares und weit verbreitetes Mittel zur effizienteren Unterscheidung von PSCs zu jeder Linie ihrer Wahl.

Watch this Scientific Journal Video about Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation at JoVE.com

Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation

Die Generierung differenzierter Zelltypen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) ist sehr therapeutisches Versprechen, bleibt aber herausfordernd. PSCs weisen oft eine inhärente Unfähigkeit auf, sich zu differenzieren, selbst wenn sie mit einem richtigen Satz von Signalen stimuliert werden. Hier wird ein einfaches Tool beschrieben, um die Differenzierung mehrerer Linien über eine Vielzahl von PSC-Linien hinweg zu verbessern.

Transiente Behandlung von humanen pluripotenten Stammzellen mit DMSO zur Förderung der Differenzierung

Despite the growing use of pluripotent stem cells (PSCs), challenges in efficiently differentiating embryonic and induced pluripotent stem cells (ESCs and ...

Es ist eine einfache Behandlung, die auf jede Stammzelllinie oder jedes Differenzierungsprotokoll angewendet werden kann, um Zellen zur Differenzierung zu primieren. Alles, was man tun muss, ist DMSO bei 1-2% in das Zellkultur-Wartungsmedium hinzuzufügen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass man das Differenzierungspotenzial pluripotenter Stammzellen in jede Linie der Wahl deutlich erhöhen kann, indem Zellen zur Differenzierung grundiert werden.Die DMSO-Behandlung erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass sich Zellen von vom Patienten abgeleiteten iPSCs unterscheiden, sodass sie für die Zellersatztherapie, die Krankheitsmodellierung und das Arzneimittelscreening verwendet werden können. Sie kann zu einem frühen Beginn der Regulierung führen, die die Unterproliferation, Differenzierung und Spezifikation während der embryonalen Entwicklung kontrolliert. Wir haben gezeigt, dass die DMSO-Behandlung die Differenzierung in fast 50 menschlichen embryonalen und induzierten pluripotenten Stammzelllinien verbessert.Während andere Laboratorien gezeigt haben, dass es vorteilhaft für Stammzellen anderer Arten, wie Maus und Primaten. Einen Tag vor Beginn der Differenzierung DMSO mit einer Konzentration von 1 oder 2% für 24 Stunden in Ihr typisches Wartungsmedium hinzufügen. 24 Stunden nach der DMSO-Behandlung, ersetzen Sie Medium und fahren Sie mit Ihrem üblichen Differenzierungsprotokoll fort.Wachsen Sie Zellen nach Manuskriptrichtungen. Wenn die Zellen eine geeignete Konfluenz erreichen, dissoziieren Sie sie und bereiten Sie eine Einzelzellsuspension vor. Zählen Sie die lebenden Zellen mit einem Hämozytometer oder einem automatischen Zellzähler, wobei sie einen Lebensfähigkeitsmarker wie Trypanblau verwenden.Um innerhalb der 24-Stunden-DMSO-Vorbehandlung 80-90%ige Konfluenz zu erreichen, die Zellen auf eine beschichtete Sechs-Bohrplatte mit einer Dichte von 500 000 bis 1 Million Zellen pro Brunnen zu verschichten. Inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einem Kohlendioxid-Inkubator. Dann aspirieren Sie die Medien und ersetzen Sie sie durch eine 1-2%DMSO-Lösung.Lassen Sie die Zellen 24-28 Stunden vor der Differenzierung inkubieren. Wenn Sie 48 Stunden inkubieren, ersetzen Sie das Medium nach 24 Stunden durch eine frische DMSO-Lösung. Um eine Differenzierung der 3D-Kultur zu erreichen, wachsen und sammeln Sie die Zellen in einer Zellsuspension.Zählen Sie die lebenden Zellen und verschichten Sie sie in einer unbeschichteten, niedrig anbringenden Sechs-Well-Platte in Stammzellmedien mit ROCK-Hemmer. Typischerweise bilden sich innerhalb von 24 Stunden 3D-Human-Pluripotente Stammzellenkugeln. Lassen Sie die Zellen 24 Stunden bei 37 Grad Celsius in einem Kohlendioxid-Inkubator brüten.Bereiten Sie 1-2%DMSO in vorgewärmten Stammzellmedien nach Manuskriptanweisungen vor. Um das Medium nach der Inkubation zu ersetzen, neigen Sie die Platte in einen Winkel von 30 Grad bis 45 Grad und lassen Sie Zellkugeln am Boden des Brunnens absetzen. Die Medien aus den Zellen aussaugen und in der DMSO-Lösung sanft wieder aufhängen.Lassen Sie die Zellen 24-48 Stunden bei 37 Grad Celsius in einem Kohlendioxid-Inkubator brüten. Vorbehandlung von Zellen mit DMSO, wie für 2D-Kulturen beschrieben, und bereiten Noggin- und SB431542-Aktienlösungen vor. Bereiten Sie genügend 10%Knockout Serum Ersatz, oder KOSR, in Knockout DMEM für drei bis vier Tage medienverändern.Bereiten Sie ektodermale Differenzierungsmedien vor, indem Sie Noggin und SB431542 zu vorgewärmten KOSR Knockout DMEM hinzufügen, wie im Manuskript beschrieben. Nach DMSO-Vorbehandlung, aspirieren Medien aus Zellen und fügen Sie zwei Milliliter Differenzierungsmedien zu jedem Brunnen. Lassen Sie die Zellen drei bis vier Tage bei 37 Grad Celsius in einem Kohlendioxid-Inkubator brüten und ersetzen Sie die Medien täglich durch frische Differenzierungsfaktoren.Die DMSO-Vorbehandlung führt zu einer vorübergehenden und dosisabhängigen Abnahme der Zellwachstumsrate im Vergleich zu nicht behandelten Zellen. Diese Abnahme der Proliferation ist mit einer Zunahme des Zell-zu-Zell-Kontakts verbunden, der besonders ausgeprägt in den 2%DMSO-behandelten Zellen ist. Wenn die Zellen für prototypische Marker jeder Keimschicht fixiert und gebeizt werden, kann man sehen, dass 2%DMSO-Vorbehandlungzunahmen zu einem erhöhten Anteil differenzierter Keimschichtzellen führen.SoX17 wurde beispielsweise gebeizt, um Endodermzellen zu visualisieren. Um die Wirkung von DMSO auf die Differenzierung zu Vorläuferzelltypen des zentralnervensystemischen Systems zu untersuchen, könnten vom Menschen induzierte pluripotente Stammzellen entweder in neuronale Vorläuferzellen oder Oligodendrozyten-Vorläuferzellen unterschieden werden. Im Vergleich zu Kontrollzellen erhöht 2%DMSO-Vorbehandlung die Expression des neuronalen Vorläuferzellmarkers Pax6.In ähnlicher Weise erhöht die Vorbehandlung den Anteil der Zellen, die Oligodendrozyten-Vorläuferzellmarker Olig2 exdrücken. Darüber hinaus verbessert die anfängliche DMSO-Behandlung die funktion der menschlichen embryonalen Stammzellen nach in-vivo-Transplantation. Wenn differenzierte Pankreas-Vorläuferzellen in immundefiziente Mäuse transplantiert werden, kann ihre Funktionalität als Reaktion auf eine Glukose-Herausforderung oder KCl-Stimulation getestet werden.Verbesserungen in der Zellfunktionalität sind von zwei Wochen bis 16 Wochen nach der Transplantation erkennbar. Die wichtigste Berücksichtigung ist die Zyklus- oder Verdoppelungszeit Ihrer Stammzellen. Die Dauer der DMSO-Behandlung sollte die gleiche sein wie die Zykluszeit der Zellen.Nach der ersten DMSO-Behandlung kann man verstehen, wie die Zellproliferation und der Zellzyklus in Stammzellen reguliert werden, da die Behandlung dazu beiträgt, den Wachstumsstillstand in der G1-Phase des Zellzyklus zu fördern. Die differenzierten Zellen können verwendet werden, um krankheitsbedingte Mechanismen zu verstehen, zur Kokultivierung mit anderen Zelltypen, in Tumorigenitäts-Assays und in funktionellen Assays oder Transplantationsstudien, um festzustellen, ob die differenzierten Zellen einen Krankheitsphänotyp retten können.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Stencil Micropatterning of Human Pluripotent Stem Cells for Probing Spatial Organization of Differentiation Fates

Stencil Mikrostrukturierung von humanen pluripotenten Stammzellen für die Sondierung räumliche Organisation Differenzierung Fates

Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Die Großproduktion von Kardiomyozyten aus humanen pluripotenten Stammzellen hochreproduzierbarer Kleinmolekül-basierte Differenzierung Protokoll

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays

Schnelle Neuronale Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen zur Messung der Netzwerkaktivität auf Micro-Elektroden-Arrays

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Differenzierung der Primitive und Definitive hämatopoetischen Vorläuferzellen aus menschlichen pluripotente Stammzellen gerichtet

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Effiziente Differenzierung von pluripotenten Stammzellen zu NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; Pancreatic Vorläufern

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In vitro Differenzierung von humanen pluripotenten Zellen in Trophoblastische Stammzellen

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Schnelle, gezielte Differenzierung der retinalen Pigment epithelialen Zellen aus menschlichen embryonalen oder induzierte pluripotente Stammzellen

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a Na&#239;ve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency

Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a NaÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¯ve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency

Chemischen Rückfall von herkömmlichen menschlichen pluripotenten Stammzellen in eine naiv-artigen Zustand mit verbesserten Multilineage Differenzierung Potenz

Na&#239;ve human pluripotent stem cells (N-hPSC) with improved functionality may have a wide impact in regenerative medicine. The goal of this protocol is ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Effiziente und skalierbare gerichtete Differenzierung von klinisch kompatibel Hornhaut limbischen epithelialen Stammzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...