Name: transient treatment of human pluripotent stem cells with dmso to promote differentiation
Uploaded: 2019-07-17T14:30:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי מענקים מאוניברסיטת סטנפורד בית הספר לרפואה ומלגת חברת Siebel הוענק ל-S. C.

. למחברים אין מה לגלות

לסיכום, פרוטוקול זה מתאר כלי פשוט וזול כדי לשפר את יכולת הבידול של תאי גזע רב עוצמה (PSCs) לכל שכבות הנבט הראשי, סוגים שונים של תאים מיוחדים המתמחה, ואפילו סוגי תאים בוגרים פונקציונלי ב מבחנה ובהגדרות vivo. מומחשים הם פרוטוקולי בידול ספציפיים אשר שוחזרו ביעילות במעבדה שלנו, כמו גם אחרים, אבל כל פרוטוקול הבחנה של בחירה ניתן להשתמש בעקבות הטיפול DMSO. כפי שמוצג בטבלה 1, מספר מעבדות הפגינו גם שיפור של בידול PSC לאחר הטיפול הארעי dmso באמצעות תבניות שונות כדי ליצור סוגים שונים של תאים מסופים אחרים. יתר על כן, למרות השיטות כאן לתאר את השימוש האנושי PSCs, pretreatment טרום טיפול יכול להיות מנוצל על פני מינים, הוכח להיות יעיל בעכבר, ארנב, ו פרימטים PSCs.
למרות מינונים גבוהים יותר של DMSO ידועים להיות ציטוטוקסיני, המינון הנמוך המשמש בשיטה זו (1%-2%) לתוצאה של תקופה ארעית במוות תאים מינימלי. בעוד מספרי התאים הכוללים מיד לאחר טיפול DMSO עלול לרדת בשל הקידום DMSO של מעצר מחזור התא בשלב G1 של מחזור התא, מחקרים קודמים מראים כי התאים מסוגלים להגיע לאותה רמה של שליטה כמו תרבויות בקרה לאחר ההסרה של . היחידה3
האחוז והמשך של טיפול מקדים DMSO צריך להיות ממוטב עבור קו התא. יש לכוונן את זמן הטיפול בהתחשב בזמן הרכיבה וההכפלה של התאים. לדוגמה, העכבר PSCs בדרך כלל יש זמני אופניים קצרים הרבה יותר של כ 15 h; לכן, טיפול DMSO עבור 15 h עבור תאים אלה הוא מספיק. מעבדות מסוימות מצאו גם את הטיפול DMSO להיות מועילים כאשר המשך במהלך הליך בידול או בריכוזים נמוכים (ראה שולחן 1). יש לציין כי כמה קווי PSC יותר amendable לבידול לקווים ספציפיים. לדוגמה, תאים HUES6 הוכחו להיות מתירני פחות כדי בידול ולכן היה מסומן שיפור עם טיפול DMSO (איור 2). לחילופין, HUES8 תאים בשימוש באיור 4 איור 5 הוכחו יש נטייה גבוהה יותר לכיוון בידול אנדועורי; כך, פחות הבדלים הוכחו בין שליטה ו DMSO לבידול בשלבים הראשוניים לכיוון האנדובית מוחלט. עם זאת, השיפור של טרום הטיפול DMSO הוא נצפתה בשלבים מאוחרים יותר של בידול קו זה (איור 4ב). הטיפול DMSO הוא גם רב-תכליתי בכך שהוא יעיל הן 2D ו-3D מערכות תרבויות תא, זה יכול לשמש עם סוגים שונים של חומר ציפוי על לוחות תרבות התא, וזה עובד בסוגים שונים של מדיום תחזוקה לקדם צמיחה והתרחבות של hPSCs (למשל, mTeSR, E8, מדיה ממוזג MEF, וכו ').
באופן כללי יותר, תוצאות אלה מראים כי המצב ההתחלתי של תאים גזע pluripotent יש השפעה חזקה על הנטייה לבידול הראשונית, כמו גם בידול מסוף לתוך סוגי תאים פונקציונליים. הצגנו בעבר כי הטיפול dmso פונקציות דרך Rb ב hPSCs3,5. Rb משחק תפקיד חשוב בקידום בידול מסוף, הישרדות התא, ואת היציבות הגנטית של תאים41,42,43,44, ולכן זה יכול להסביר את ההשפעות המתמדת על תאים הובחנים מ-DMSO-מטופלים hPSCs. מיקוד אלה מצבים מוקדמים של רגולציה עשוי למקם hPSCs על מסלול טוב יותר עבור בידול ובסופו של דבר לשפר את השירות שלהם לרפואה רגנרטיבית.

השימוש בתאי גזע פלאוריטי הוביל התקדמויות רבות במחקר ביו, כולל שדות של רפואה רגנרטיבית ו-תא גזע טיפולים מבוססי, דוגמנות מחלות, והקרנת סמים. זה גם הוביל לאפשרות הכללית של מחקר לתרגום יותר ורפואה אישית. הופעתו של תא גזע המושרה pluripotent (iPSC) הטכנולוגיה לפני 20 שנה הרשו לחוקרים לפתח תאים גזע pluriפוטנטי מרקמות סומטיים ולהבדיל אותם לתוך סוגי תאים פונקציונליים ללמוד מגוון של פתווגיות, כולל מחלות לב וכלי דם, נוירולוגיות ואימונולוגיים. למרות צעדים משמעותיים נעשו בטכנולוגיית גזע תא בידול, אתגרים ביעילות מבדילים בתאי גזע האדם העובריים (hESCs) ו iPSCs עדיין להתמיד, הגבלת השימוש הנרחב של הטכנולוגיה תא גזע על פני שונים תוכניות מחקר. השונות הטבועה בין קווי תאים שונים ושיבוטים ממשיכה להציב מכשולים להבדיל קווי גזע התאים הרצוי לינינים1. יתר על כן, הנובעות בוגרת, תאים פונקציונליים מובחנים סופני מ hPSCs נשאר תהליך מייגע ובלתי יעיל על פני ליננים רבים. למעשה, תאים הבדיל מ hPSCs לעתים קרובות להיכשל סופני להבדיל תאים פונקציונליים2. ב הנעה נוספת מבוססי תא גזע טיפולים להשתמש בחולים, יש צורך לשפר ולהבטיח את היעילות של תאים הנוצרים מ hPSCs.
המעבדה שלנו הקימה כלי מהיר, זול כדי לשפר באופן משמעותי את היעילות של ההבחנה הן iPSCs ו ESCs לתוך סוגי תאים בוגרים. מצאנו כי טרום טיפול של hiPSCs ו hESCs עם מאוד נפוץ diמתיל סולפוקסיד (DMSO) עבור 24 h כדי 48 h לפני בימוי תוצאות בידול בשיפור מסומן ביכולת בידול תא גזע. טיפול עם DMSO מגביר את הפרופורציה של hiPSCs ו hESCs בשלב מוקדם G1 של מחזור התא ומפעילה את חלבון retinנובלסטומה (Rb)3, וסת קריטי של התפשטות התא, הישרדות, ובידול4. בעבודה יותר לאחרונה, זה נמצא כי Rb ואת בני משפחתה נדרשים עבור השפעות פרו בידול של DMSO, כגון הפעלה ארעית של Rb מדכאת את ההשפעות של DMSO, בעוד הפעלה חוקתית של Rb באופן ארעי מגביר . ההשפעות של DMSO5 מקביל למחזור התאים במהלך פיתוח עובריים, מחזור התא של escs ו-iPSCs מאופיין בשלב מקוצר של G1 המקדם התחדשות עצמית6,7,8. שלב זה מקוצר G1 מאפשר התפשטות בלתי מוגבלת יותר, אך מגביל את הפוטנציאל לבידול4,9. על-ידי קידום מעצר גדילה ב-G1 והפעלת פקדי מחסום במחזור התא של hESCs ו iPSCs, התאים הראשוניים DMSO הטיפול עבור שינויי הגורל התא בעקבות בידול מכוון.
עד כה, dmso טרום טיפול הוכח לשפר את יכולת הבידול לכל שלוש שכבות הנבט ביותר מ 30 שליטה ומחלות ספציפיים האדם ESC ו ipsc קווי התא3,5 , כמו גם את הבידול של תאי גזע ואחרים קווי תאים למגוון סוגים אחרים של תאים בוגרים במחקרים הבאים10,11,12,13,14,15,16 , מיכל בן 17 , מיכל בן 18 , מיכל בן 19 , מיכל בן 20 , מיכל בן 21 , מיכל בן 22 , מיכל בן 23 , בת 24 , מיכל בן 25 , מיכל בן 26 , בן 27 , 28 (טבלה 1). יתר על כן, הטיפול dmso הוכח להיות יעיל בשיפור הבידול של תאים ראשוניים לא אנושיים21,23 (למשל, עכבר, פרימטים, ארנב), מציע מנגנונים משותפים על פני מינים. לבסוף, הטיפול הקדם DMSO הורחב גם לטכנולוגיה לעריכת גנים, עם מחקר אחד מסוים מראה כי 24 h DMSO טרום טיפול של hESCs/iPSCs הגדילה באופן משמעותי את היכולת של אשכולות קבועים מקובצים באופן קבוע Interinggspic הקצר (קריספאר) /כריסטין הקשורה חלבון-9 (Cas9)-תיווך עריכת יעילות של DNA שאינו קידוד מבלי לשלב מוטציות לא מכוונות29. בתנאי כאן היא מתודולוגיה מפורטת של טרום הטיפול DMSO של hESCs ו iPSCs עבור יישומים בביולוגיה תא גזע ובידול מכוון.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:651px;" width="651">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">21985023</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">9-Position stir plate&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Chemglass</td>
			<td style="width:135px;">CLS-4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Accutase</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">11105-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Activin A</td>
			<td style="width:135px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>338-AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Advanced RPMI</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">12633012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alk5i II</td>
			<td style="width:135px;">Axxora</td>
			<td style="width:135px;">ALX-270-445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">all-trans retinoic acid&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-Brachyury</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">AF2085</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:215px;">anti-C-peptide</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:135px;">GN-ID4</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-FoxA2</td>
			<td style="width:135px;">Millipore</td>
			<td>07-633</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-Nkx2.2</td>
			<td>University of Iowa, Developmental Hybridoma Bank</td>
			<td>74.5A5</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-Nkx6.1</td>
			<td>University of Iowa, Developmental Hybridoma Bank;&#160;</td>
			<td style="width:135px;">F55A12-supernatant</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-Olig2</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:135px;">MABN50</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-Pax-6</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td style="width:135px;">901301</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-Pdx1</td>
			<td style="width:135px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>AF2419</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-SOX1&#160;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">AF3369</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-SOX17</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">AF1924</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:215px;">B-27 Supplement, minus Vitamin A</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">basic fibroblast growth factor</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>PHG0264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Betacellulin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>50932345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chir99021</td>
			<td style="width:135px;">Stemgent</td>
			<td>04-000-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">CMRL 1066</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">99-603-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:215px;">Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td style="width:135px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:135px;">AMQAF1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:135px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:135px;">G7528&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">DAPI</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:135px;">D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Disposable Spinner Flasks</td>
			<td style="width:135px;">Corning, VWR</td>
			<td style="width:135px;">89089-814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">DMEM/F-12</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">DMSO&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Essential 6 Media</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>A1516501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">FAF-BSA</td>
			<td style="width:135px;">Proliant&#160;</td>
			<td style="width:135px;">68700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">FGF7</td>
			<td style="width:135px;">PeproTech</td>
			<td style="width:135px;">100-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Geltrex</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>A1413202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">GlutaMAX&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Heparin&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:135px;">H3149&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Ultrasensitive Insulin ELISA</td>
			<td>ALPCO Diagnostics</td>
			<td>80-INSHUU-E01.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">ITS-X</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:135px;">51500056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KGF</td>
			<td style="width:135px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">AF-100-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Knockout DMEM</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>10829018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">KnockOut Serum Replacement</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-3,3&#8242;,5-Triiodothyronine (T3)</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:135px;">642245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">LDN193189</td>
			<td style="width:135px;">Stemgent</td>
			<td>04-0074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Matrigel Matrix</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MCDB-131&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Cellgro&#160;</td>
			<td style="width:135px;">15-100-CV&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">MEM NEAA</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:215px;">mTeSR 1</td>
			<td style="width:135px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:135px;">5850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">N2 Supplement</td>
			<td style="width:135px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:135px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:135px;">S3817&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Noggin Fc Chimera Protein</td>
			<td style="width:135px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">3344-NG-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PdBU</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:135px;">524390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Mediatech&#160;</td>
			<td style="width:135px;">30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">RPMI</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sant1</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">S4572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SB431542</td>
			<td style="width:135px;">Stemgent</td>
			<td>04-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Smoothened Agonist, SAG</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td>566660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">StemPro Accutase</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>A1110501&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">TrypLE</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">12604013</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:215px;">Ultra-Low Attachment Microplates</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td>3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Vitamin C</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">A4544&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Wnt3a</td>
			<td style="width:135px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>5036-WN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">XAV 939</td>
			<td style="width:135px;">Tocris</td>
			<td style="width:135px;">3748</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">XXI</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:135px;">565790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Y-27632</td>
			<td style="width:135px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:135px;">72302</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transient treatment of human pluripotent stem cells with dmso to promote differentiation

למרות השימוש הגוברת של תאי גזע pluriפוטנטי (PSCs), אתגרים ביעילות מבדילים עובריים ומושרה בתאי גזע pluriפוטנטי (ESCs ו-iPSCs) ברחבי ליננים שונים להישאר. פרוטוקולים רבים של בידול פותחו, אך השונות באמצעות קווי התאים ושיעורי בידול נמוכים להקנות אתגרים בהצלחה יישום פרוטוקולים אלה. המתואר כאן הוא אמצעי קל וזול כדי לשפר את יכולת הבידול של PSCs. זה כבר הוכח כי טיפול בתאי גזע עם ריכוז נמוך של diמתיל סולפוקסיד (DMSO) מגביר באופן משמעותי את הנטייה של מגוון רחב של PSCs להבדיל בין סוגי תאים שונים לאחר בידול מכוון. טכניקה זו הוכח כעת להיות יעיל על פני מינים שונים (למשל, העכבר, הפרימטים, והאנושי) לתוך מספר רב של הגילאים, החל נוירונים והרורואידים הקליפת הגוף תאים שרירים חלקה והפטציטים. טרום טיפול DMSO משפר PSC בידול על ידי ויסות מחזור התא לקרקע התאים גזע להיות מגיב יותר אותות בידול. בתנאי כאן הוא מתודולוגיה מפורטת לשימוש בכלי זה פשוט כאמצעי הניתן ליישום והחלים נרחב כדי להבדיל ביתר יעילות PSCs לכל השושלת של בחירה.

Watch this Scientific Journal Video about Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation at JoVE.com

Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation

יצירת סוגי תאים הבדיל מתאי גזע האדם הרב עוצמה (hPSCs) מחזיק הבטחה טיפולית גדולה אך נשאר מאתגר. PSCs לעתים קרובות מפגין חוסר יכולת מובנית להבדיל גם כאשר מגורה עם קבוצה נאותה של אותות. מתוארים כאן הוא כלי פשוט כדי לשפר בידול רב היוחסין על פני מגוון של קווי PSC.

הטיפול הארעי של תאי גזע בעלי עוצמה אנושית עם DMSO כדי לקדם בידול

Despite the growing use of pluripotent stem cells (PSCs), challenges in efficiently differentiating embryonic and induced pluripotent stem cells (ESCs and ...

זהו טיפול פשוט שניתן להחיל על כל קו תא גזע או פרוטוקול התברואה לתאים ראשוניים להתברות. כל מה שאנחנו צריכים לעשות הוא להוסיף DMSO ב 1-2% לתוך מדיום תחזוקת תרבות התא. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת להגדיל באופן משמעותי את פוטנציאל ההידול של תאי גזע פלוריפוטנטיים לכל שושלת בחירה על ידי תאים ראשונים להתבולל.טיפול DMSO מגדיל את הסיכוי שתאים יבדילו מ- iPSCs שמקורם בחולה, ויאפשרו להם לשמש לטיפול בתחליפי תאים, מידול מחלות והקרנת תרופות. זה יכול ללדת את תחילתה המוקדמת של רגולציה השליטה תת התפשטות, התברואה, ומפרט במהלך התפתחות עוברית. הוכחנו כי הטיפול ב- DMSO משפר את ההידול בכמעט 50 קווי תאי גזע עובריים ומושרים אנושיים.בעוד מעבדות אחרות הראו כי זה מועיל עבור תאי גזע של מינים אחרים, כגון עכבר ופרימט. יום אחד לפני תחילת ההתביור, הוסף DMSO בריכוז של 1 או 2% למשך 24 שעות לתוך אמצעי התחזוקה הטיפוסי שלך. 24 שעות לאחר הטיפול ב- DMSO, החלף את המדיום והמשך בפרוטוקול ההידול הרגיל שלך.לגדל תאים על פי הוראות כתב יד. כאשר התאים מגיעים לקונפליה מתאימה, נתק אותם והכן השעיה של תא יחיד. לספור את התאים החיים עם המוציטמטר או מונה תא אוטומטי, באמצעות סמן הכדאיות כגון כחול trypan.על מנת להשיג 80-90% confluency בתוך 24 שעות ביממה DMSO טרום טיפול, צלחת התאים על צלחת מצופה שש באר בצפיפות של 500, 000 כדי 1 מיליון תאים ל הבאר. דגירה התאים במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור פחמן דו חמצני. לאחר מכן, שאפו את המדיה והחליפו אותה בפתרון DMSO של 1-2%..אפשר לתאים דגירה במשך 24-28 שעות לפני ההידול. אם הדגירה למשך 48 שעות, החלף את המדיה לאחר 24 שעות בפתרון DMSO טרי. כדי להשיג התמדה תרבותית תלת-מימדית, לגדול ולאסוף את התאים בהשעיית תא.לספור את התאים החיים צלחת אותם לא מצופה, קובץ מצורף נמוך שש בארות צלחת במדיה תאי גזע עם מעכבי רוק. בדרך כלל, כדורי תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים תלת-מימדיים ייווצירו תוך 24 שעות. אפשר לתאים להתמהמה במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור פחמן דו חמצני.הכינו 1-2%DMSO במדיה של תאי גזע מחוממים מראש בהתאם לכיווני כתב היד. כדי להחליף את המדיה לאחר הדגירה, הטה את הצלחת לזווית של 30 מעלות עד 45 מעלות ואפשר לכדורי התא להתיישב בתחתית הבאר. שאפו את המדיה מהתאים והשעו אותם מחדש בעדינות בפתרון DMSO.אפשר לתאים להתבגר במשך 24-48 שעות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור פחמן דו חמצני. טרום לטפל בתאים עם DMSO כמתואר עבור תרבויות 2D, ולהכין noggin ו SB431542 פתרונות מלאי. הכינו מספיק החלפת סרום של 10%, או KOSR, בנוקאאוט DMEM למשך שלושה עד ארבעה ימים של שינוי מדיה.הכן מדיית בידול אקטודרמלית על-ידי הוספת נוגין ו- SB431542 ל- DMEM נוקאאוט KOSR מחומם מראש כמתואר בכתב היד. לאחר טיפול מקדים ב- DMSO, שאפו מדיה מתאים והוסיפו שני מיליליטר של מדיית התברואה לכל באר. אפשר לתאים להחגור במשך שלושה עד ארבעה ימים ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור פחמן דו חמצני, החלפת מדיה מדי יום עם גורמי הידול טריים.תוצאות טרום טיפול DMSO בירידה ארעית ותלוית מינון בקצב צמיחת התאים בהשוואה לתאים שאינם מטופלים. ירידה זו קשורה לעלייה במגע בין תא לתא, אשר בולט במיוחד בתאים שטופלו ב- 2%DMSO. כאשר התאים קבועים ומוכתמים עבור סמנים prototypic של כל שכבת נבט, ניתן לראות כי 2%DMSO טרום טיפול תוצאות שיעור מוגבר של תאים שכבת נבט מובחן.לדוגמה, SOX17 היה מוכתם כדי לדמיין תאי אנדודרמה. על מנת לחקור את ההשפעה של DMSO על הבחנה לסוגי תאי אבי מערכת העצבים המרכזית, תאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי האדם יכולים להיות מובחנים לתאי אבי עצביים או לתאי אבי אוליגודנדרוציטים. בהשוואה לתאי בקרה, 2%DMSO טרום טיפול מגביר את הביטוי של סמן תא אבי עצבי Pax6.באופן דומה, טרום הטיפול מגדיל את שיעור התאים המבטאים אוליגודנדרוציטים סמן תאים אוליג2. יתר על כן, טיפול DMSO ראשוני משפר את תפקוד התאים האנושיים שמקורם בתאי גזע עובריים לאחר השתלת in-vivo. כאשר תאי אבות לבלב מובחנים מושתלים בעכברים immunodeficient, הפונקציונליות שלהם יכולה להיבדק בתגובה לאתגר גלוקוז או גירוי KCl.שיפורים בפונקציונליות התא ניכרים משבועיים עד 16 שבועות לאחר ההשתלה. השיקול החשוב ביותר שיש לקחת בחשבון הוא זמן רכיבה על אופניים או הכפלה של תאי הגזע שלך. אורך הטיפול ב- DMSO צריך להיות זהה לזמן רכיבה על אופניים של התאים.לאחר הטיפול הראשוני DMSO, אפשר להבין כיצד התפשטות התא ואת מחזור התא מוסדר בתאי גזע, כמו הטיפול מסייע לקדם מעצר צמיחה בשלב G1 של מחזור התא. התאים המובחנים יכולים לשמש להבנת מנגנונים הקשורים למחלות, לשיתוף עם סוגי תאים אחרים, בתקנות גידול, ובביקורים תפקודיים או מחקרי השתלה כדי לקבוע אם התאים המובחנים יכולים להציל פנוטיפ מחלה.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Stencil Micropatterning of Human Pluripotent Stem Cells for Probing Spatial Organization of Differentiation Fates

סטנסיל micropatterning של תאי גזע האנושי pluripotent עבור גשוש הארגון המרחבי של גורל הבידול

Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

ייצור בקנה מידה גדולה של cardiomyocytes מתאי גזע פלוריפוטנטיים אדם באמצעות פרוטוקול בידול מולקולה קטן המבוססת לשחזור ביותר

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays

בידול העצבי המהיר של גזע תאים המושרה pluripotent למדידת פעילות רשת על מערכי מייקרו-אלקטרודה

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

ביים הבידול של אבות Hematopoietic פרימיטיבי, מהווים הסופית מתאי גזע Pluripotent אנושי

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

בידול יעיל של pluripotent בתאי גזע כדי NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; אבות הלבלב

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

במבחנה בידול של האדם pluripotent בתאי גזע לתאי Trophoblastic

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

הבידול מהירה, מכוונת של תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית מתאי גזע Pluripotent האנושי עובריים או מושרה

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a Na&#239;ve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency

Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a NaÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¯ve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency

לדוגמות כימיים בתאי גזע Pluripotent האנושית המקובלת למצב תמים כמו עם העוצמה התמיינות משופרת Multilineage

Na&#239;ve human pluripotent stem cells (N-hPSC) with improved functionality may have a wide impact in regenerative medicine. The goal of this protocol is ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

יעיל ומדרגי הבידול בבימויו של קלינית הקרנית Limbal אפיתל תאי גזע מתאימים מתאי גזע Pluripotent אנושי

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

יעיל הבידול של תאים האדם Pluriפוטנטי לתוך תאי הכבד

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...