Name: transient treatment of human pluripotent stem cells with dmso to promote differentiation
Uploaded: 2019-07-17T14:30:00
Duration: 6 min 55 s
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इस काम के चिकित्सा के स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय स्कूल और एक Siebel फैलोशिप एस सी को सम्मानित से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था.

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

सारांश में, इस प्रोटोकॉल सभी प्राथमिक रोगाणु परतों के लिए pluripotent स्टेम कोशिकाओं (PSCs) के भेदभाव क्षमता को बढ़ाने के लिए एक सरल और सस्ती उपकरण का वर्णन करता है, विशेष जनक कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार, और यहां तक कि कार्यात्मक, परिपक्व सेल प्रकार में इन विट्रो और विवो सेटिंग्स में। इलस्ट्रेटेड विशिष्ट भेदभाव प्रोटोकॉल है कि प्रभावी ढंग से हमारी प्रयोगशाला के रूप में के रूप में अच्छी तरह से दूसरों में पुनरुत्पादित किया गया है, लेकिन पसंद के किसी भी भेदभाव प्रोटोकॉल DMSO उपचार के बाद इस्तेमाल किया जा सकता है. जैसा कि तालिका 1में दर्शाया गया है, अनेक प्रयोगशालाओं ने विभिन्न अन्य समीय सेल प्रकारों को उत्पन्न करने के लिए विभिन्न प्रतिमानों का उपयोग करते हुए क्षणिक डी एमएसओ उपचार के बाद पीएससी विभेदन में वृद्धि का भी प्रदर्शन किया है। इसके अलावा, हालांकि यहाँ तरीकों मानव PSCs के उपयोग का वर्णन, DMSO pretreatment प्रजातियों भर में उपयोग किया जा सकता है और माउस में प्रभावी होना दिखाया गया है, खरगोश, और प्राइमेट PSCs.
हालांकि DMSO की उच्च खुराक cytotoxic होने के लिए जाना जाता है, कम खुराक इस विधि में इस्तेमाल किया (1%-2%) एक क्षणिक अवधि के लिए कम से कम सेल मौत में परिणाम. जबकि समग्र सेल संख्या तुरंत DMSO उपचार के बाद सेल चक्र के G1 चरण में सेल चक्र गिरफ्तारी के DMSO पदोन्नति के कारण कम हो सकता है, पिछले अध्ययनों से पता चलता है कि कोशिकाओं को हटाने के बाद नियंत्रण संस्कृतियों के रूप में संगम के एक ही स्तर तक पहुँचने में सक्षम हैं DMSO3|
प्रतिशत और DMSO pretreatment की अवधि सेल लाइन प्रति अनुकूलित किया जाना चाहिए. उपचार के समय को कोशिकाओं के साइकिल चालन/डबलिंग समय के लिए विचार के साथ समायोजित किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, माउस PSCs आम तौर पर के बारे में 15 ज की बहुत कम साइकिल चालन समय है; इस प्रकार, इन कोशिकाओं के लिए 15 एच के लिए DMSO उपचार पर्याप्त है. कुछ प्रयोगशालाओं ने भी पाया है DMSO उपचार फायदेमंद हो सकता है जब भेदभाव प्रोटोकॉल के दौरान या कम सांद्रता पर जारी रखा (तालिका 1देखें ). यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि कुछ पीएससी लाइनें विशिष्ट वंशों के लिए भेदभाव करने के लिए अधिक संशोधन योग्य हैं। उदाहरण के लिए, HUES6 कोशिकाओं को भेदभाव के लिए कम स्वीकार्य होना दिखाया गया है और इस प्रकार DMSO उपचार के साथ उल्लेखनीय सुधार किया था (चित्र 2) . वैकल्पिक रूप से, चित्र 4 और चित्र 5 में प्रयुक्त HUES8 कोशिकाओं को एंडोडर्मल विभेद की दिशा में उच्च प्रवृत्ति दिखाई गई है; इस प्रकार, निश्चित एंडोडर्म की ओर प्रारंभिक चरणों में भेदभाव के लिए नियंत्रण और DMSO के बीच कम अंतर दिखाए गए थे। फिर भी, DMSO pretreatment की वृद्धि इस सेल लाइन में भेदभाव के बाद के चरणों में मनाया जाता है (चित्र 4बी). DMSO उपचार भी है कि यह दोनों 2 डी और 3 डी सेल संस्कृतियों प्रणालियों में प्रभावी है में बहुमुखी है, यह सेल संस्कृति प्लेटों पर कोटिंग सामग्री के विभिन्न प्रकार के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है, और यह रखरखाव माध्यम के विभिन्न प्रकार में काम करता है कि विकास और विस्तार को बढ़ावा देने के एचपीएससी (उदा., एमटीईएसआर, ई 8, एमईएफ वातानुकूलित मीडिया, आदि)।
अधिक आम तौर पर, इन परिणामों का सुझाव है कि pluripotent स्टेम कोशिकाओं की प्रारंभिक राज्य प्रारंभिक भेदभाव के लिए प्रवृत्ति पर एक मजबूत प्रभाव के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कार्यात्मक सेल प्रकार में टर्मिनल भेदभाव है. हम पहले से पता चला है कि DMSO उपचार hPSCs3,5 में Rb के माध्यम से कार्य करताहै. Rb टर्मिनल भेदभाव को बढ़ावा देने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, सेल अस्तित्व , और कोशिकाओं की आनुवंशिक स्थिरता41,42,43,44, और यह इसलिए कोशिकाओं पर लगातार प्रभाव की व्याख्या कर सकते हैं DMSO से अलग-इलाज hPSCs. विनियमन के इन प्रारंभिक तरीकों को लक्षित भेदभाव के लिए एक बेहतर पथ पर hPSCs जगह और अंततः पुनर्योजी दवा के लिए उनकी उपयोगिता में सुधार हो सकता है.

pluripotent स्टेम कोशिकाओं का उपयोग biomedical अनुसंधान में कई प्रगति के लिए नेतृत्व किया गया है, पुनर्योजी चिकित्सा और स्टेम सेल आधारित उपचार के क्षेत्रों सहित, रोग मॉडलिंग, और दवा स्क्रीनिंग. यह भी अधिक अनुवाद अनुसंधान और व्यक्तिगत चिकित्सा के समग्र संभावना के लिए नेतृत्व किया है. प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSC) प्रौद्योगिकी के आगमन पर 20 साल पहले शोधकर्ताओं को दैहिक ऊतकों से pluripotent स्टेम कोशिकाओं को विकसित करने और उन्हें कार्यात्मक सेल प्रकार में अंतर करने के लिए रोगों की एक किस्म का अध्ययन करने की अनुमति दी है, सहित हृदय, तंत्रिका विज्ञान, और प्रतिरक्षा रोगों. हालांकि स्टेम सेल भेदभाव प्रौद्योगिकी में महत्वपूर्ण प्रगति की गई है, प्रभावी ढंग से मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ESCs) और iPSCs different में स्टेम सेल प्रौद्योगिकी के व्यापक उपयोग को सीमित करने में चुनौतियों अनुसंधान कार्यक्रम. विभिन्न सेल लाइनों और क्लोनों में विरासत परिवर्तनशीलता वांछित लिनेज1के लिए स्टेम सेल लाइनों को अलग करने के लिए बाधाएं पैदा कर रही है। इसके अलावा, परिपक्व, hPSCs से टर्मिनल विभेदित कार्यात्मक कोशिकाओं deriving कई वंशों भर में एक थकाऊ और अक्षम प्रक्रिया बनी हुई है. वास्तव में, एचपीएससी से विभेदित कोशिकाएं प्रायः कार्यात्मक कोशिकाओं2में अंतर करने में असफल हो जाती हैं। रोगियों में उपयोग करने के लिए स्टेम सेल-आधारित उपचारों को आगे बढ़ाने में, एचपीएससी से उत्पन्न होने वाले कोशिकाओं की प्रभावकारिता में सुधार करने और यह सुनिश्चित करने की आवश्यकता है।
हमारी प्रयोगशाला काफी परिपक्व सेल प्रकार में दोनों iPSCs और ESCs differentiating की दक्षता बढ़ाने के लिए एक त्वरित, सस्ती उपकरण की स्थापना की है. हमने पाया है कि आमतौर पर इस्तेमाल किया अभिकर्मक dimethyl sulfoxoxide के साथ hiPSCs और HESCs के pretreatment 24 एच से 48 एच के लिए स्टेम सेल भेदभाव क्षमता में एक उल्लेखनीय सुधार में भेदभाव परिणामों का निर्देश से पहले. DMSO के साथ उपचार सेल चक्र के प्रारंभिक G1 चरण में hiPSCs और hESCs के अनुपात में वृद्धि और रेटिनोब्लास्टोमा प्रोटीन (Rb)3को सक्रिय करता है , सेल प्रसार, अस्तित्व, और भेदभाव4का एक महत्वपूर्ण नियामक . हाल के कार्य में, यह पाया गया है कि एम.बी.एस.ओ. के प्रो-डिफरेंट प्रभावों के लिए आर बी और उसके परिवार के सदस्यों की आवश्यकता होती है, जैसे कि आर बी की क्षणिक निष्क्रियता DMSO के प्रभावों को दबा देती है, जबकि एक क्षणिक तरीके से आरबी के गठन सक्रियण में वृद्धि होती है DMSO के प्रभाव5| भ्रूणीय विकास के दौरान कोशिका चक्र के अनुरूप, ESCs और iPSCs के सेल चक्र एक संक्षिप्त G1 चरण है कि आत्म नवीनीकरण को बढ़ावा देता है की विशेषता है6,7,8. यह संक्षिप्त जी 1 चरण अधिक अप्रतिबंधित प्रसार की अनुमति देता है लेकिन विभेदन4,9 के लिए क्षमता को सीमित करताहै. G1 में विकास गिरफ्तारी को बढ़ावा देने और hESCs और iPSCs के सेल चक्र में जांच की चौकी नियंत्रण को सक्रिय करके, DMSO उपचार सेल भाग्य परिवर्तन के लिए कोशिकाओं के लिए कोशिकाओं के निर्देश भेदभाव के बाद.
तारीख करने के लिए, DMSO pretreatment 30 से अधिक नियंत्रण और रोग विशेष मानव ईएससी और iPSC सेल लाइनों3,5 के रूप में अच्छी तरह से स्टेम कोशिकाओं और अन्य के भेदभाव में सभी तीन रोगाणु परतों के लिए भेदभाव क्षमता में सुधार करने के लिए दिखाया गया है बाद के अध्ययनों में विभिन्न प्रकार के अन्य प्रौढ़ कोशिका प्रकारों के सेल लाइनें10,11,12,13,14,15,16, 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 (तालिका 1) . इसके अलावा, DMSO उपचार गैर मानव प्राथमिक कोशिकाओं 21,23 (उदा., माउस, प्राइमेट, खरगोश) के भेदभाव को बढ़ाने में प्रभावी होना दिखाया गया है, प्रजातियों में साझा तंत्र का सुझाव. अंत में, DMSO pretreatment भी जीन संपादन प्रौद्योगिकी के लिए बढ़ा दिया गया है, एक विशेष अध्ययन से पता चलता है कि 24 h DMSO hESCs/iPSCs के pretreatment काफी क्लस्टर्ड नियमित रूप से अंतराल लघु Palindromic दोहराता है की क्षमता में वृद्धि हुई (CRISPR) /CRISPR-संबद्ध प्रोटीन-9 (Cas9)-अवांछित उत्परिवर्तनों को शामिल किए बिना गैर-कोडिंग डीएनए की मध्यस्थता संपादन दक्षता29| यहां स्टेम सेल जीव विज्ञान में अनुप्रयोगों के लिए HESCs और iPSCs के DMSO pretreatment की एक विस्तृत पद्धति है और भेदभाव का निर्देश दिया.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:651px;" width="651">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">21985023</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">9-Position stir plate&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Chemglass</td>
			<td style="width:135px;">CLS-4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Accutase</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">11105-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Activin A</td>
			<td style="width:135px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>338-AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Advanced RPMI</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">12633012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alk5i II</td>
			<td style="width:135px;">Axxora</td>
			<td style="width:135px;">ALX-270-445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">all-trans retinoic acid&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-Brachyury</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">AF2085</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:215px;">anti-C-peptide</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:135px;">GN-ID4</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-FoxA2</td>
			<td style="width:135px;">Millipore</td>
			<td>07-633</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-Nkx2.2</td>
			<td>University of Iowa, Developmental Hybridoma Bank</td>
			<td>74.5A5</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-Nkx6.1</td>
			<td>University of Iowa, Developmental Hybridoma Bank;&#160;</td>
			<td style="width:135px;">F55A12-supernatant</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-Olig2</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:135px;">MABN50</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-Pax-6</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td style="width:135px;">901301</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-Pdx1</td>
			<td style="width:135px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>AF2419</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-SOX1&#160;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">AF3369</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-SOX17</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">AF1924</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:215px;">B-27 Supplement, minus Vitamin A</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">basic fibroblast growth factor</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>PHG0264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Betacellulin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>50932345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chir99021</td>
			<td style="width:135px;">Stemgent</td>
			<td>04-000-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">CMRL 1066</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">99-603-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:215px;">Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td style="width:135px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:135px;">AMQAF1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:135px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:135px;">G7528&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">DAPI</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:135px;">D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Disposable Spinner Flasks</td>
			<td style="width:135px;">Corning, VWR</td>
			<td style="width:135px;">89089-814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">DMEM/F-12</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">DMSO&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Essential 6 Media</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>A1516501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">FAF-BSA</td>
			<td style="width:135px;">Proliant&#160;</td>
			<td style="width:135px;">68700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">FGF7</td>
			<td style="width:135px;">PeproTech</td>
			<td style="width:135px;">100-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Geltrex</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>A1413202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">GlutaMAX&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Heparin&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:135px;">H3149&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Ultrasensitive Insulin ELISA</td>
			<td>ALPCO Diagnostics</td>
			<td>80-INSHUU-E01.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">ITS-X</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:135px;">51500056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KGF</td>
			<td style="width:135px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">AF-100-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Knockout DMEM</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>10829018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">KnockOut Serum Replacement</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-3,3&#8242;,5-Triiodothyronine (T3)</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:135px;">642245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">LDN193189</td>
			<td style="width:135px;">Stemgent</td>
			<td>04-0074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Matrigel Matrix</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MCDB-131&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Cellgro&#160;</td>
			<td style="width:135px;">15-100-CV&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">MEM NEAA</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:215px;">mTeSR 1</td>
			<td style="width:135px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:135px;">5850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">N2 Supplement</td>
			<td style="width:135px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:135px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:135px;">S3817&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Noggin Fc Chimera Protein</td>
			<td style="width:135px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">3344-NG-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PdBU</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:135px;">524390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Mediatech&#160;</td>
			<td style="width:135px;">30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">RPMI</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sant1</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">S4572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SB431542</td>
			<td style="width:135px;">Stemgent</td>
			<td>04-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Smoothened Agonist, SAG</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td>566660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">StemPro Accutase</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>A1110501&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">TrypLE</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">12604013</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:215px;">Ultra-Low Attachment Microplates</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td>3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Vitamin C</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">A4544&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Wnt3a</td>
			<td style="width:135px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>5036-WN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">XAV 939</td>
			<td style="width:135px;">Tocris</td>
			<td style="width:135px;">3748</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">XXI</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:135px;">565790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Y-27632</td>
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transient treatment of human pluripotent stem cells with dmso to promote differentiation

pluripotent स्टेम सेल (PSCs) के बढ़ते उपयोग के बावजूद, विभिन्न वंशों में कुशलतापूर्वक भ्रूण और प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (ESCs और iPSCs) अलग करने में चुनौतियों रहते हैं. कई भेदभाव प्रोटोकॉल विकसित किया गया है, अभी तक सेल लाइनों में परिवर्तनशीलता और भेदभाव की कम दरों को सफलतापूर्वक इन प्रोटोकॉल को लागू करने में चुनौतियों प्रदान करते हैं. यहाँ वर्णित PSCs के भेदभाव क्षमता को बढ़ाने के लिए एक आसान और सस्ती साधन है. यह पहले से पता चला है कि dimethyl suloxide (DMSO) की एक कम एकाग्रता के साथ स्टेम कोशिकाओं के उपचार काफी निर्देशित भेदभाव के बाद विभिन्न सेल प्रकार के लिए अंतर करने के लिए पीएससी की एक किस्म की प्रवृत्ति बढ़ जाती है। इस तकनीक को अब विभिन्न प्रजातियों में प्रभावी होना दिखाया गया है (जैसे, माउस, प्राइमेट, और मानव) कई वंशों में, न्यूरॉन्स और cortical गोलाभ से लेकर मांसपेशियों की कोशिकाओं और hepatocytes चिकनी करने के लिए. DMSO pretreatment सेल चक्र को विनियमित करने और स्टेम कोशिकाओं प्राइमिंग भेदभाव संकेतों के लिए और अधिक उत्तरदायी होने के द्वारा पीएससी भेदभाव में सुधार. लेकिन यहाँ एक reproduible और व्यापक रूप से लागू करने के लिए और अधिक कुशलता से पसंद के किसी भी वंश के लिए PSCs अंतर का मतलब है के रूप में इस सरल उपकरण का उपयोग करने के लिए विस्तृत पद्धति है.

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Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation

मानव pluripotent स्टेम सेल (HPSCs) से विभेदित सेल प्रकार उत्पन्न महान चिकित्सीय वादा रखती है, लेकिन चुनौतीपूर्ण बनी हुई है. PSCs अक्सर संकेतों का एक उचित सेट के साथ प्रेरित भी जब अंतर करने के लिए एक अंतर्निहित असमर्थता प्रदर्शन. यहाँ वर्णित पीएससी लाइनों की एक किस्म भर में multilineage भेदभाव बढ़ाने के लिए एक सरल उपकरण है.

भेदभाव को बढ़ावा देने के लिए DMSO के साथ मानव Pluripotent स्टेम सेल के क्षणिक उपचार

Despite the growing use of pluripotent stem cells (PSCs), challenges in efficiently differentiating embryonic and induced pluripotent stem cells (ESCs and ...

यह एक सरल उपचार है जिसे किसी भी स्टेम सेल लाइन या भेदभाव के लिए प्राइम सेल के लिए भेदभाव प्रोटोकॉल पर लागू किया जा सकता है। सभी को एक करना है सेल संस्कृति रखरखाव माध्यम में 1-2% पर DMSO जोड़ने के लिए है । इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह एक को भेदभाव के लिए कोशिकाओं को भड़काना द्वारा पसंद के किसी भी वंश में बहुलिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं की भेदभाव क्षमता को काफी बढ़ाने की अनुमति देता है।DMSO उपचार संभावना है कि कोशिकाओं को रोगी से व्युत्पन्न आईपीएससी से अंतर होगा बढ़ जाती है, उंहें सेल रिप्लेसमेंट थेरेपी, रोग मॉडलिंग, और दवा स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया जा करने की अनुमति । यह विनियमन की शुरुआत को जन्म दे सकता है जो भ्रूणीय विकास के दौरान उप-प्रसार, भेदभाव और विनिर्देश को नियंत्रित करता है। हमने यह दर्शाया है कि डीएमएसओ उपचार लगभग 50 मानव भ्रूणीय और प्रेरित प्लूपोटेंट स्टेम सेल लाइनों में भेदभाव में सुधार करता है।जबकि अन्य प्रयोगशालाओं से पता चला है कि यह माउस और रहनुमा जैसी अन्य प्रजातियों की स्टेम कोशिकाओं के लिए फायदेमंद है। भेदभाव की शुरुआत से एक दिन पहले, अपने विशिष्ट रखरखाव माध्यम में 24 घंटे के लिए 1 या 2% की एकाग्रता पर DMSO जोड़ें । DMSO उपचार के 24 घंटे बाद, मध्यम की जगह और अपने सामान्य भेदभाव प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ें।पांडुलिपि के निर्देशों के अनुसार कोशिकाएं उगाएं। जब कोशिकाएं उचित रूप से एक तक पहुंचती हैं, तो उन्हें अलग करें और एक एकल सेल निलंबन तैयार करें। ट्राइपैन ब्लू जैसे व्यवहार्यता मार्कर का उपयोग करके, हीमोसाइटोमीटर या स्वचालित सेल काउंटर के साथ जीवित कोशिकाओं की गणना करें।आदेश में 24 घंटे DMSO पूर्व उपचार के भीतर 80-90% संकुचन प्राप्त करने के लिए, ५००, 000 से १,०,० कोशिकाओं के घनत्व पर एक लेपित छह अच्छी तरह से थाली पर कोशिकाओं को थाली प्रति अच्छी तरह से । कार्बन डाइऑक्साइड इनक्यूबेटर में 24 घंटे के लिए कोशिकाओं को ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें । फिर, मीडिया को आकांक्षी करें और इसे 1-2% DMSO समाधान के साथ बदलें।कोशिकाओं को भेदभाव से पहले 24-28 घंटे के लिए इनक्यूबेट करने की अनुमति दें। यदि 48 घंटे के लिए इनक्यूबेटिंग कर रहे हैं, तो 24 घंटे के बाद मीडिया को नए सिरे से DMSO समाधान के साथ बदलें। 3 डी संस्कृति भेदभाव प्राप्त करने के लिए, कोशिका निलंबन में कोशिकाओं को विकसित और एकत्र करें।लाइव कोशिकाओं की गणना करें और उन्हें रॉक अवरोधक के साथ स्टेम सेल मीडिया में एक अनकोटेड, कम लगाव वाली छह-अच्छी प्लेट में प्लेट करें। आमतौर पर, 3 डी मानव pluripotent स्टेम सेल क्षेत्रों 24 घंटे के भीतर फार्म का होगा । कोशिकाओं को कार्बन डाइऑक्साइड इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करने की अनुमति दें।पांडुलिपि निर्देशों के अनुसार पूर्व-गर्म स्टेम सेल मीडिया में 1-2% DMSO तैयार करें। इनक्यूबेशन के बाद मीडिया को बदलने के लिए, प्लेट को 30 डिग्री से 45 डिग्री कोण तक झुकाएं और सेल क्षेत्रों को कुएं के तल पर बसने की अनुमति दें। कोशिकाओं से मीडिया को आकांक्षी और धीरे से DMSO समाधान में उन्हें फिर से निलंबित।कोशिकाओं को कार्बन डाइऑक्साइड इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 24-48 घंटे के लिए इनक्यूबेट करने की अनुमति दें। 2डी संस्कृतियों के लिए वर्णित डीएमएसओ के साथ प्री-ट्रीट कोशिकाएं, और नोगिन और एसबी431542 स्टॉक समाधान तैयार करें। मीडिया परिवर्तन के तीन से चार दिनों के लिए नॉकआउट डीएमईएम में पर्याप्त 10% नॉकआउट सीरम प्रतिस्थापन, या KOSR तैयार करें।पांडुलिपि में वर्णित पूर्व-गर्म KOSR नॉकआउट डीएमईएम में नोगिन और एसबी 431542 जोड़कर एक्टोडर्मल विभेदन मीडिया तैयार करें। DMSO पूर्व उपचार के बाद, कोशिकाओं से मीडिया को आकांक्षी और प्रत्येक अच्छी तरह से भेदभाव मीडिया के दो मिलीलीटर जोड़ें । कोशिकाओं को एक कार्बन डाइऑक्साइड इनक्यूबेटर में ३७ डिग्री सेल्सियस पर तीन से चार दिनों के लिए इनक्यूबेट करने की अनुमति दें, ताजा भेदभाव कारकों के साथ दैनिक मीडिया की जगह ।डीएमएसओ पूर्व उपचार के परिणामस्वरूप गैर-उपचारित कोशिकाओं की तुलना में कोशिका विकास दर में क्षणिक और खुराक पर निर्भर कमी आती है। यह कमी प्रसार सेल-टू-सेल संपर्क में वृद्धि से जुड़ा हुआ है, जो विशेष रूप से 2% DMSO-इलाज कोशिकाओं में स्पष्ट है। जब कोशिकाओं को तय किया जाता है और प्रत्येक रोगाणु परत के प्रोटोटाइप मार्कर के लिए दाग, यह देखा जा सकता है कि 2% DMSO पूर्व उपचार विभेदित रोगाणु परत कोशिकाओं के अनुपात में वृद्धि हुई है ।उदाहरण के लिए, SOX17 को एंडोडर्म कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए दाग दिया गया था। केंद्रीय तंत्रिका तंत्र जनक कोशिका प्रकारों के लिए भेदभाव पर DMSO के प्रभाव की जांच करने के लिए, मानव प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं या तो तंत्रिका जनक कोशिकाओं या ओलिगोडेन्ड्रोसाइट जनक कोशिकाओं में विभेदित किया जा सकता है । नियंत्रण कोशिकाओं की तुलना में, 2% DMSO पूर्व उपचार तंत्रिका जनक सेल मार्कर Pax6 की अभिव्यक्ति बढ़ जाती है ।इसी तरह, प्री-ट्रीटमेंट ओलिगोडेन्ड्रोसाइट प्रोजेनिटर सेल मार्कर ओलिग 2 को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं के अनुपात को बढ़ाता है। इसके अलावा, प्रारंभिक DMSO उपचार में विवो प्रत्यारोपण के बाद मानव भ्रूण स्टेम सेल व्युत्पन्न सेल समारोह में सुधार । जब विभेदित अग्नाशय जनक कोशिकाओं को इम्यूनोडिफिशिएंसी चूहों में प्रत्यारोपित किया जाता है, तो ग्लूकोज चैलेंज या केसीएल उत्तेजना के जवाब में उनकी कार्यक्षमता का परीक्षण किया जा सकता है।कोशिका कार्यक्षमता में सुधार प्रत्यारोपण के बाद दो सप्ताह से 16 सप्ताह तक स्पष्ट हैं। सबसे महत्वपूर्ण विचार को ध्यान में रखना साइकिल चालन या अपने स्टेम सेल के दोहरीकरण समय है । डीएमएसओ उपचार की लंबाई कोशिकाओं के साइकिलिंग समय के समान होनी चाहिए।प्रारंभिक DMSO उपचार के बाद, एक कैसे सेल प्रसार और सेल चक्र स्टेम सेल में विनियमित कर रहे है समझ सकते हैं, के रूप में उपचार में मदद करता है सेल चक्र के G1 चरण में विकास की गिरफ्तारी को बढ़ावा देने । विभेदित कोशिकाओं का उपयोग रोग से संबंधित तंत्रों को समझने के लिए किया जा सकता है, अन्य कोशिका प्रकारों के साथ सह-संस्कृति के लिए, ट्यूमरजन्यता परख में, और कार्यात्मक परख या प्रत्यारोपण अध्ययन में यह निर्धारित करने के लिए कि विभेदित कोशिकाएं किसी रोग फेनोटाइप को बचा सकती हैं या नहीं।

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Stencil Micropatterning of Human Pluripotent Stem Cells for Probing Spatial Organization of Differentiation Fates

भेदभाव भाग्य के स्थानिक संगठन जांच के लिए मानव स्टेम कोशिकाओं के स्टैंसिल micropatterning

Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

मानव स्टेम कोशिकाओं से cardiomyocytes के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए एक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत छोटे अणु आधारित भेदभाव प्रोटोकॉल का उपयोग

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays

मापने नेटवर्क गतिविधि माइक्रो इलेक्ट्रोड सरणियों पर के लिए प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं का तेजी से neuronal भेदभाव

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

मानव Pluripotent स्टेम सेल से आदिम और निश्चित टेम Progenitors के विभेद का निर्देशन

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Pluripotent के कुशल भेदभाव स्टेम कोशिकाओं को NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; अग्नाशय प्रोजेनिटर्स

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

मानव pluripotent की इन विट्रो भेदभाव में स्टेम कोशिकाओं Trophoblastic में कोशिकाओं

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

मानव भ्रूण या प्रेरित Pluripotent स्टेम कोशिकाओं से रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं के तेजी से, निर्देशित भेदभाव

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a Na&#239;ve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency

Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a NaÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¯ve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency

पारंपरिक मानव Pluripotent के रासायनिक पुनः संस्करण स्टेम कोशिकाओं में सुधार Multilineage भेदभाव शक्ति के साथ एक भोली की तरह राज्य

Na&#239;ve human pluripotent stem cells (N-hPSC) with improved functionality may have a wide impact in regenerative medicine. The goal of this protocol is ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

मानव Pluripotent स्टेम कोशिकाओं से नैदानिक संगत Corneal अंग उपकला स्टेम कोशिकाओं के कुशल और स्केलेबल निर्देशित भेदभाव

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

लिवर सेल में मानव Pluripotent स्टेम सेल के कुशल भेदभाव

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...