Name: transient treatment of human pluripotent stem cells with dmso to promote differentiation
Uploaded: 2019-07-17T14:30:00
Duration: 6 min 55 s
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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Stanford University School of Medicine e di una Siebel Fellowship assegnata a S. C.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In sintesi, questo protocollo descrive uno strumento semplice e poco costoso per migliorare la capacità di differenziazione delle cellule staminali pluripotenti (PSC) a tutti gli strati germinali primari, vari tipi di cellule progenitrici specializzate e persino tipi di cellule mature funzionali in vitro e in vivo. Illustrati sono protocolli di differenziazione specifici che sono stati riprodotti efficacemente nel nostro laboratorio e altri, ma qualsiasi protocollo di differenziazione scelto dopo il trattamento DMSO. Come mostrato nella Tabella 1, alcuni laboratori hanno anche dimostrato un miglioramento della differenziazione del PSC dopo il trattamento DMSO transitorio utilizzando diversi paradigmi per generare vari altri tipi di cellule terminali. Inoltre, anche se i metodi qui descritti l'uso di PSC umani, il pretrattamento DMSO può essere utilizzato in tutte le specie e ha dimostrato di essere efficace nei PSC di topo, coniglio e primati.
Anche se dosi più elevate di DMSO sono noti per essere citotossico, le basse dosi utilizzate in questo metodo (1%-2%) per un periodo transitorio si traducono in una morte minima delle cellule. Mentre il numero complessivo di cellule immediatamente dopo il trattamento DMSO può diminuire a causa della promozione DMSO dell'arresto del ciclo cellulare nella fase G1 del ciclo cellulare, studi precedenti dimostrano che le cellule sono in grado di raggiungere lo stesso livello di confluenza delle colture di controllo dopo la rimozione DMSO3.
La percentuale e la durata del pretrattamento DMSO devono essere ottimizzate per ogni linea cellulare. Il tempo di trattamento deve essere regolato tenendo conto del tempo di ciclismo/raddoppio delle cellule. Ad esempio, i PSC del mouse hanno in genere tempi di ciclo molto più brevi di circa 15 h; pertanto, il trattamento DMSO per 15 h per queste cellule è sufficiente. Alcuni laboratori hanno anche ritenuto che il trattamento DMSO sia vantaggioso se continuato durante il protocollo di differenziazione o a concentrazioni più basse (cfr. tabella 1). Va notato che alcune linee PSC sono più modificabili alla differenziazione a specifici lignaggi. Ad esempio, le cellule HUES6 hanno dimostrato di essere meno permissive alla differenziazione e quindi hanno avuto un netto miglioramento con il trattamento DMSO (Figura 2). In alternativa, è stato dimostrato che le celle HUES8 utilizzate nella Figura 4 e nella Figura 5 hanno una maggiore propensione verso la differenziazione endodermica; pertanto, sono state mostrate meno differenze tra controllo e DMSO per la differenziazione nelle fasi iniziali verso l'endodermo definitivo. Tuttavia, il miglioramento del pretrattamento DMSO è osservato nelle fasi successive di differenziazione in questa linea cellulare (Figura 4B). Il trattamento DMSO è anche versatile in quanto è efficace sia nei sistemi di colture cellulari 2D che 3D, può essere utilizzato con vari tipi di materiale di rivestimento su piastre di coltura cellulare e funziona in diversi tipi di mezzi di manutenzione che promuovono la crescita e l'espansione di hPSC (ad es. mTeSR, E8, supporti condizionati MEF, ecc.).
Più in generale, questi risultati suggeriscono che lo stato iniziale delle cellule staminali pluripotenti ha una forte influenza sulla propensione alla differenziazione iniziale e la differenziazione terminale nei tipi di cellule funzionali. Abbiamo dimostrato in precedenza che il trattamento DMSO funziona attraverso Rb in hPSCs3,5. Rb svolge un ruolo importante nel promuovere la differenziazione terminale, la sopravvivenza cellulare, e la stabilità genetica delle cellule41,42,43,44, e può quindi spiegare gli effetti persistenti sulle cellule differenziati dagli hPSC trattati con DMSO. Il targeting di queste prime modalità di regolazione può collocare gli hPSC su una traiettoria migliore per la differenziazione e, in ultima analisi, migliorare la loro utilità per la medicina rigenerativa.

L'uso di cellule staminali pluripotenti ha portato a numerosi progressi nella ricerca biomedica, tra cui i campi della medicina rigenerativa e delle terapie basate su cellule staminali, la modellazione delle malattie e lo screening farmacologico. Ha anche portato alla prospettiva generale di una ricerca più traducibile e di una medicina personalizzata. L'avvento della tecnologia indotta di cellule staminali pluripotenti (iPSC) oltre 20 anni fa ha permesso ai ricercatori di sviluppare cellule staminali pluripotenti da tessuti somatici e differenziarle in tipi di cellule funzionali per studiare una varietà di patologie, tra cui malattie cardiovascolari, neurologiche e immunologiche. Sebbene siano stati compiuti progressi significativi nella tecnologia di differenziazione delle cellule staminali, persistono sfide nel differenziare efficacemente le cellule staminali embrionali umane (hESC) e gli iPSC, limitando l'uso diffuso della tecnologia delle cellule staminali tra programmi di ricerca. La variabilità intrinseca attraverso diverse linee cellulari e cloni continua a rappresentare ostacoli per differenziare le linee di cellule staminali ai linages desiderati1. Inoltre, derivare cellule funzionali mature e differenziate terminalmente da hPSC rimane un processo noioso e inefficiente attraverso molti lignaggi. Infatti, le cellule differenziate dagli hPSC spesso non si differenziano terminalmente in celle funzionali2. Nell'ulteriore spostamento delle terapie basate sulle cellule staminali da utilizzare nei pazienti, è necessario migliorare e garantire l'efficacia delle cellule generate dagli hPSC.
Il nostro laboratorio ha creato uno strumento rapido ed economico per migliorare significativamente l'efficienza di differenziare sia gli iPSC che gli ESC in tipi di cellule mature. Abbiamo scoperto che il pretrattamento di hiPSC e hESC con il solfuro ditilico (DMSO) reagente comunemente usato per 24 h a 48 h prima dei risultati diretti di differenziazione comporta un netto miglioramento della capacità di differenziazione delle cellule staminali. Il trattamento con DMSO aumenta la percentuale di hiPSC e hESC nella prima fase G1 del ciclo cellulare e attiva la proteina del retinoblastoma (Rb)3, un regolatore critico della proliferazione cellulare, della sopravvivenza e della differenziazione4. Nel lavoro più recente, si è scoperto che Rb e i suoi familiari sono necessari per gli effetti pro-differenziazione della DMSO, in modo tale che l'inattivazione transitoria di Rb sopprime gli effetti del DMSO, mentre l'attivazione coniugale di Rb in modo transitorio migliora Effetti di DMSO5. Analogo al ciclo cellulare durante lo sviluppo embrionale, il ciclo cellulare di ESC e iPSC è caratterizzato da una fase G1 abbreviata che promuove l'auto-rinnovamento6,7,8. Questa fase G1 abbreviata consente una proliferazione più illimitata ma limita il potenziale di differenziazione4,9. Promuovendo l'arresto della crescita nel G1 e attivando i controlli dei checkpoint nel ciclo cellulare di hESC e iPSC, il trattamento DMSO primes cellule per i cambiamenti del destino cellulare a seguito di differenziazione diretta.
Ad oggi, il pretrattamento DMSO ha dimostrato di migliorare la capacità di differenziazione a tutti e tre gli strati germinali in oltre 30 linee di controllo e cellule umane specifiche della malattia3,5, nonché la differenziazione delle cellule staminali e di altri linee cellulari a una varietà di altri tipi di cellule mature negli studi successivi10,11,12,13,14,15,16, 17 mi lato , 18 mi lato , 19 del 12 , 20 anni , 21 Mieto , 22 Milia , 23 del 23 o , 24 Mi lasa' di , 25 mi lato , 26 del sistema di , 27 mi lapiùdel , 28 (Tabella 1). Inoltre, il trattamento Con DMSO ha dimostrato di essere efficace nel migliorare la differenziazione delle cellule primarie non umane21,23 (ad esempio, topo, primate, coniglio), suggerendo meccanismi condivisi tra le specie. Infine, il pretrattamento DMSO è stato esteso anche alla tecnologia di editing genetico, con uno studio particolare che mostra che il pretrattamento DMSO di 24 h di hESC/iPSC ha aumentato significativamente la capacità delle ripetizioni palindromiche brevi a pacchetto (CRISPR) /CRISPR-associate proteina 9 (Cas9) mediato efficienza di editing del DNA non codificante senza incorporare mutazioni indesiderate29. A condizione qui è fornita una metodologia dettagliata del pretrattamento DMSO di HESC e iPSC per applicazioni in biologia delle cellule staminali e differenziazione diretta.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:651px;" width="651">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">21985023</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">9-Position stir plate&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Chemglass</td>
			<td style="width:135px;">CLS-4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Accutase</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">11105-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Activin A</td>
			<td style="width:135px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>338-AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Advanced RPMI</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">12633012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alk5i II</td>
			<td style="width:135px;">Axxora</td>
			<td style="width:135px;">ALX-270-445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">all-trans retinoic acid&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-Brachyury</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">AF2085</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:215px;">anti-C-peptide</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:135px;">GN-ID4</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-FoxA2</td>
			<td style="width:135px;">Millipore</td>
			<td>07-633</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-Nkx2.2</td>
			<td>University of Iowa, Developmental Hybridoma Bank</td>
			<td>74.5A5</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-Nkx6.1</td>
			<td>University of Iowa, Developmental Hybridoma Bank;&#160;</td>
			<td style="width:135px;">F55A12-supernatant</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-Olig2</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:135px;">MABN50</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-Pax-6</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td style="width:135px;">901301</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-Pdx1</td>
			<td style="width:135px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>AF2419</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-SOX1&#160;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">AF3369</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-SOX17</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">AF1924</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:215px;">B-27 Supplement, minus Vitamin A</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">basic fibroblast growth factor</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>PHG0264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Betacellulin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>50932345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chir99021</td>
			<td style="width:135px;">Stemgent</td>
			<td>04-000-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">CMRL 1066</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">99-603-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:215px;">Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td style="width:135px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:135px;">AMQAF1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:135px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:135px;">G7528&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">DAPI</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:135px;">D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Disposable Spinner Flasks</td>
			<td style="width:135px;">Corning, VWR</td>
			<td style="width:135px;">89089-814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">DMEM/F-12</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">DMSO&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Essential 6 Media</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>A1516501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">FAF-BSA</td>
			<td style="width:135px;">Proliant&#160;</td>
			<td style="width:135px;">68700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">FGF7</td>
			<td style="width:135px;">PeproTech</td>
			<td style="width:135px;">100-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Geltrex</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>A1413202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">GlutaMAX&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Heparin&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:135px;">H3149&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Ultrasensitive Insulin ELISA</td>
			<td>ALPCO Diagnostics</td>
			<td>80-INSHUU-E01.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">ITS-X</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:135px;">51500056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KGF</td>
			<td style="width:135px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">AF-100-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Knockout DMEM</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>10829018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">KnockOut Serum Replacement</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-3,3&#8242;,5-Triiodothyronine (T3)</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:135px;">642245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">LDN193189</td>
			<td style="width:135px;">Stemgent</td>
			<td>04-0074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Matrigel Matrix</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MCDB-131&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Cellgro&#160;</td>
			<td style="width:135px;">15-100-CV&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">MEM NEAA</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:215px;">mTeSR 1</td>
			<td style="width:135px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:135px;">5850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">N2 Supplement</td>
			<td style="width:135px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:135px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:135px;">S3817&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Noggin Fc Chimera Protein</td>
			<td style="width:135px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">3344-NG-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PdBU</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:135px;">524390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Mediatech&#160;</td>
			<td style="width:135px;">30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">RPMI</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sant1</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">S4572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SB431542</td>
			<td style="width:135px;">Stemgent</td>
			<td>04-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Smoothened Agonist, SAG</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td>566660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">StemPro Accutase</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>A1110501&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">TrypLE</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">12604013</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:215px;">Ultra-Low Attachment Microplates</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td>3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Vitamin C</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">A4544&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Wnt3a</td>
			<td style="width:135px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>5036-WN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">XAV 939</td>
			<td style="width:135px;">Tocris</td>
			<td style="width:135px;">3748</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">XXI</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:135px;">565790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Y-27632</td>
			<td style="width:135px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:135px;">72302</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transient treatment of human pluripotent stem cells with dmso to promote differentiation

Nonostante il crescente uso di cellule staminali pluripotenti (PSC), permangono sfide nel differenziare in modo efficiente le cellule staminali pluripotenti embrionali e indotte (ESC e iPSC) attraverso vari lignaggi. Sono stati sviluppati numerosi protocolli di differenziazione, ma la variabilità attraverso le linee cellulari e i bassi tassi di differenziazione richiedono difficoltà nell'implementazione di questi protocolli. Descritto qui è un mezzo facile ed economico per migliorare la capacità di differenziazione dei PSC. È stato precedentemente dimostrato che il trattamento delle cellule staminali con una bassa concentrazione di solforo dimetilo (DMSO) aumenta significativamente la propensione di una varietà di PSC a differenziarsi a diversi tipi di cellule in seguito alla differenziazione diretta. Questa tecnica ha dimostrato ora di essere efficace in diverse specie (ad esempio, topo, primate e umani) in più lignaggi, che vanno dai neuroni e sferoidi corticali alle cellule muscolari lisce e gli epatociti. Il pretrattamento DMSO migliora la differenziazione del PSC regolando il ciclo cellulare e innescondo le cellule staminali in modo che siano più reattive ai segnali di differenziazione. Qui è fornita la metodologia dettagliata per l'utilizzo di questo semplice strumento come mezzo riproducibile e ampiamente applicabile per differenziare in modo più efficiente i PSC a qualsiasi lignaggio di scelta.

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La generazione di tipi di cellule differenziate dalle cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) mantiene grandi promesse terapeutiche, ma rimane impegnativo. I PSC spesso presentano un'inerente a differenziarsi anche se stimolati con un set adeguato di segnali. Descritto qui è un semplice strumento per migliorare la differenziazione multilineage attraverso una varietà di linee PSC.

Trattamento transitorio delle cellule staminali pluripotenti umane con DMSO per promuovere la differenziazione

Despite the growing use of pluripotent stem cells (PSCs), challenges in efficiently differentiating embryonic and induced pluripotent stem cells (ESCs and ...

È un trattamento semplice che può essere applicato a qualsiasi linea di cellule staminali o protocollo di differenziazione alle cellule prime per la differenziazione. Tutto quello che si deve fare è aggiungere DMSO all'1-2% nel supporto di manutenzione della coltura cellulare. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente di aumentare significativamente il potenziale di differenziazione delle cellule staminali pluripotenti in qualsiasi lignaggio di scelta adescando le cellule per la differenziazione.Il trattamento DMSO aumenta la possibilità che le cellule si distinguano dagli iPSC derivati dal paziente, consentendo loro di essere utilizzate per la terapia di sostituzione cellulare, la modellazione delle malattie e lo screening farmacologico. Può dare origine all'inizio precoce della regolamentazione che controlla la subprolife proliferazione, la differenziazione e le specifiche durante lo sviluppo embrionale. Abbiamo dimostrato che il trattamento DMSO migliora la differenziazione in quasi 50 linee di cellule staminali pluripotenti embrionali e indotte dall'uomo.Mentre altri laboratori hanno dimostrato che è vantaggioso per le cellule staminali di altre specie, come topo e primate. Un giorno prima dell'inizio della differenziazione, aggiungere DMSO a una concentrazione dell'1 o del 2% per 24 ore nel tipico mezzo di manutenzione. 24 ore dopo il trattamento DMSO, sostituire il mezzo e procedere con il solito protocollo di differenziazione.Far crescere le cellule secondo le indicazioni manoscritte. Quando le cellule raggiungono un'appropriata confluenza, dissociarle e preparare una singola sospensione cellulare. Contare le cellule vive con un emocitometro o un contatore automatico delle celle, utilizzando un marcatore di vitalità come trypan blue.Al fine di ottenere l'80-90% di confluenza entro il pretrattamento DMSO 24 ore su 24, placcare le celle su una piastra rivestita a sei pozzi ad una densità da 500.000 a 1 milione di cellule per pozzo. Incubare le cellule per 24 ore a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica. Quindi, aspirare il supporto e sostituirlo con una soluzione DMSO 1-2%..Lasciare incubare le cellule per 24-28 ore prima della differenziazione. Se si incuba per 48 ore, sostituire il supporto dopo 24 ore con una fresca soluzione DMSO. Per ottenere la differenziazione delle impostazioni cultura 3D, far crescere e raccogliere le cellule in una sospensione cellulare.Contare le cellule vive e placcarle in una piastra a sei elementi non rivestita e a basso attacco in mezzi a cellule staminali con inibitore ROCK. Tipicamente, le sfere di cellule staminali pluripotenti umane 3D si formeranno entro 24 ore. Consentire alle cellule di incubare per 24 ore a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica.Preparare l'1-2%DMSO in supporti a cellule staminali prerifavositi secondo le indicazioni manoscritte. Per sostituire il supporto dopo l'incubazione, inclinare la piastra a un angolo da 30 gradi a 45 gradi e consentire alle sfere cellulari di depositarsi nella parte inferiore del pozzo. Aspirare il supporto dalle celle e sospenderle delicatamente nella soluzione DMSO.Consentire alle cellule di incubare per 24-48 ore a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica. Pre-trattare le cellule con DMSO come descritto per le colture 2D e preparare soluzioni stock noggin e SB431542. Preparare abbastanza sostituzione del siero knockout del 10%, o KOSR, in DMEM knockout per tre o quattro giorni di cambiamento dei supporti.Preparare i mezzi di differenziazione ectodermica aggiungendo noggin e SB431542 al DMEM ad eliminazione diretta KOSR pre-riscaldato come descritto nel manoscritto. Dopo il pretrattamento dmso, aspirare i mezzi dalle cellule e aggiungere due millilitri di mezzi di differenziazione a ciascun pozzo. Consentire alle cellule di incubare per tre o quattro giorni a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica, sostituendo quotidianamente i media con nuovi fattori di differenziazione.Il pretrattamento dmso comporta una diminuzione transitoria e dose-dipendente del tasso di crescita cellulare rispetto alle cellule non trattate. Questa diminuzione della proliferazione è associata a un aumento del contatto da cellula a cellula, che è particolarmente pronunciato nelle cellule trattate con DMSO al 2%. Quando le cellule sono fisse e macchiate per marcatori prototipali di ogni strato germinale, si può vedere che il pretrattamento del 2%DMSO si traduce in una maggiore proporzione di cellule a strato germinale differenziate.Ad esempio, SOX17 è stato macchiato per visualizzare le celle endodermi. Al fine di studiare l'effetto del DMSO sulla differenziazione ai tipi di cellule progenitrici del sistema nervoso centrale, le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo potrebbero essere differenziate in cellule progenitrici neurali o cellule progenitrici oligodendrociti. Rispetto alle cellule di controllo, il pretrattamento del 2%DMSO aumenta l'espressione del marcatore cellulare progenitore neurale Pax6.Allo stesso modo, il pretrattamento aumenta la proporzione di cellule che esprimono il marcatore cellulare progenitore di oligodendrociti Olig2. Inoltre, il trattamento DMSO iniziale migliora la funzione cellulare derivata dalle cellule staminali embrionali umane a seguito di un trapianto in vivo. Quando le cellule progenitrici pancreatiche differenziate vengono trapiantate in topi immunodifesa, la loro funzionalità può essere testata in risposta a una sfida di glucosio o alla stimolazione KCl.I miglioramenti nella funzionalità cellulare sono evidenti da due settimane a 16 settimane dopo il trapianto. La considerazione più importante da prendere in considerazione è il tempo di ciclo o raddoppio delle cellule staminali. La durata del trattamento DMSO dovrebbe essere la stessa del tempo di ciclo delle cellule.Dopo il trattamento dmso iniziale, si può capire come la proliferazione cellulare e il ciclo cellulare sono regolati nelle cellule staminali, poiché il trattamento aiuta a promuovere l'arresto della crescita nella fase G1 del ciclo cellulare. Le cellule differenziate possono essere utilizzate per comprendere i meccanismi correlati alla malattia, per la co-ristrutturazione con altri tipi di cellule, nei saggi di tumorigenicità e nei saggi funzionali o negli studi di trapianto per determinare se le cellule differenziate possono salvare un fenotipo di malattia.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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Ricerca

Biologia dello sviluppo

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