Name: transient treatment of human pluripotent stem cells with dmso to promote differentiation
Uploaded: 2019-07-17T14:30:00
Duration: 6 min 55 s
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この研究は、スタンフォード大学医学部の助成金と、S.C.に授与されたシーベル・フェローシップによって支えられました。

著者は何も開示する必要はありません。

要約すると、このプロトコルは、すべての原発性胚芽層、種々のタイプの特殊な前駆細胞、さらにはインビトロの機能的な成熟細胞タイプに対する多能性幹細胞(PSC)の分化能力を高めるためのシンプルで安価なツールを説明します。と生体内の設定で。図示は、私たちの研究室だけでなく、他の研究室で効果的に再現されている特定の分化プロトコルですが、選択した任意の分化プロトコルは、DMSO処理に続いて使用することができます。表1に示すように、多くの研究室は、異なるパラダイムを用いて一時的なDMSO処理後のPSC分化の増強を実証し、他の様々な末端細胞タイプを生成する。さらに、ここでの方法はヒトPSCの使用を説明するが、DMSO前処理は種間で利用することができ、マウス、ウサギ、霊長類PSCに有効であることが示されている。
DMSOの高用量は細胞傷害性であることが知られているが、この方法で使用される低用量(1%-2%)一過性の期間のために最小限の細胞死をもたらす。DMSO治療直後の全体的な細胞数は、細胞周期のG1期における細胞周期停止のDMSO促進のために減少する可能性があるが、以前の研究は、細胞が除去後の制御培養物と同じレベルの合流に達できることを示している。DMSO3.
DMSO前処理のパーセントと持続時間は、細胞株ごとに最適化する必要があります。治療時間は、細胞のサイクリング/倍増時間を考慮して調整する必要があります。例えば、マウスPSCのサイクリング時間は通常約15時間と短くなります。したがって、これらの細胞に対して15時間のDMSO処理で十分である。一部のラボでは、分化プロトコル中または低濃度で継続した場合にDMSO治療が有益であることが判明しています(表1参照)。一部のPSCラインは、特定の系統との差別化により修正可能である点に留意すべきである。例えば、HUES6細胞は分化に対する寛容性が低く、DMSO処理で顕著な改善が見られた(図2)。あるいは、図4および図5で使用されるHUES8細胞は、内皮分化に対して高い傾向を示している。したがって、決定的な内皮に向かう初期段階での分化のためのコントロールとDMSOの間の相違点が少なかった。それにもかかわらず、DMSO前処理の増強は、この細胞株における分化の後の段階で観察される(図4B)。DMSO処理は、2Dおよび3D細胞培養システムの両方に有効であるという点でも汎用性があり、細胞培養プレート上の様々なタイプのコーティング材料で使用することができ、成長と拡大を促進するさまざまなタイプのメンテナンス培地で動作します。hPSC(例えば、mTeSR、E8、MEF条件付きメディアなど)。
より一般的には、これらの結果は、多能性幹細胞の開始状態が、機能性細胞型への末端分化と同様に初期分化の傾向に強い影響を及ぼすことを示唆している。我々は以前に、DMSO治療がhPSC3、5のRbを介して機能することを示した。Rbは末端分化、細胞生存、および細胞41、42、43、44の遺伝的安定性を促進する上で重要な役割を果たし、したがって、細胞に対する持続的な影響を説明し得る。DMSO処理されたhPSCと区別されます。これらの初期の規制モードをターゲットにすることは、hPSCを差別化のためのより良い軌道に置き、最終的には再生医療の有用性を向上させる可能性があります。

多能性幹細胞の使用は、再生医療や幹細胞ベースの治療、疾患モデリング、薬物スクリーニングなどの生物医学研究の多くの進歩につながっています。また、より翻訳可能な研究とパーソナライズされた医療の全体的な見通しにつながっています。20年以上前に誘導された多能性幹細胞(iPSC)技術の出現により、研究者は体組織から多能性幹細胞を開発し、機能性細胞型に分化し、様々な病態を研究することができました。心血管疾患、神経疾患、免疫疾患。幹細胞分化技術では大きな進歩が見られましたが、ヒト胚性幹細胞(hESC)とiPSCを効果的に分化する上での課題は依然として残っており、異なる幹細胞技術の広範な使用を制限しています。研究プログラム。異なる細胞株とクローン間の固有の変動性は、幹細胞株を所望の線子1に分化するための障害を引き続き提起し続ける。さらに、hPSCから成熟した末期分化機能細胞を導出することは、多くの系統にわたって退屈で非効率的なプロセスのままである。実際、hPSCから分化した細胞は、多くの場合、機能性細胞2に終端的に分化することができない。患者に使用する幹細胞ベースの治療法をさらに動かすには、hPSCから生成される細胞の有効性を改善し、確実にする必要がある。
私たちの研究室は、iPSCとESCの両方を成熟した細胞タイプに分ける効率を大幅に高めるための迅速で安価なツールを確立しました。指向分化前の24時間から48時間の一般的な試薬ジメチルスルホキシド(DMSO)によるhiPSCおよびHESCの前処理は、幹細胞分化能力の顕著な改善をもたらすことがわかった。DMSOによる治療は、細胞周期の初期のG1期におけるhiPSCおよびHESCの割合を増加させ、細胞増殖、生存、分化の重要な調節子であるレチノブ芽腫タンパク質(Rb)3を活性化する。より最近の研究では、Rbとその家族がDMSOのプロ分化効果に必要であることが判明し、Rbの一時的な不活性化はDMSOの効果を抑制し、一時的な方法でRbの構成的活性化が強化される。DMSOの効果5.胚発生時の細胞周期と同様に、ESCおよびiPSCの細胞周期は、自己再生6、7、8を促進する略語G1相によって特徴付される。この省略されたG1フェーズは、より無制限の増殖を可能にしますが、分化4、9の可能性を制限します。G1での増殖停止を促進し、hESCおよびiPSCの細胞周期におけるチェックポイント制御を活性化することにより、DMSO治療は、指示された分化に続く細胞の運命の変化に対する細胞のプライムをプライムする。
現在までに、DMSO前処理は、30以上の対照および疾患特異的ヒトESCおよびiPSC細胞株3、5、ならびに幹細胞および他の分化における3つの生殖層すべてに対する分化能力を改善することが示されている。その後の研究における他の様々な成熟細胞型に対する細胞株10,11,12,13,14,15,16,17歳,18歳,19歳,20歳,21歳,22歳,23歳,24歳,25名,26歳,27歳,28 (表1)さらに、DMSO治療は、非ヒト原発細胞21、23(例えば、マウス、霊長類、ウサギ)の分化を増強するのに有効であることが示されており、種間の共有メカニズムを示唆している。最後に、DMSO前処理は遺伝子編集技術にも拡張されており、ある特定の研究では、hESC/iPSCの24時間DMSO前処理がクラスター化規則的に間隔を空けた短いパリドロミックリピート(CRISPR)の能力を有意に増加させたことを示しています。/CRISPR関連タンパク質-9(Cas9)-意図しない突然変異を組み込むことなく非コードDNAの編集効率29.ここでは、幹細胞生物学および指向性分化におけるアプリケーションのためのHESCおよびiPSCのDMSO前処理の詳細な方法論を提供する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:651px;" width="651">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">21985023</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">9-Position stir plate&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Chemglass</td>
			<td style="width:135px;">CLS-4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Accutase</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">11105-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Activin A</td>
			<td style="width:135px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>338-AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Advanced RPMI</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">12633012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alk5i II</td>
			<td style="width:135px;">Axxora</td>
			<td style="width:135px;">ALX-270-445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">all-trans retinoic acid&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-Brachyury</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">AF2085</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:215px;">anti-C-peptide</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:135px;">GN-ID4</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-FoxA2</td>
			<td style="width:135px;">Millipore</td>
			<td>07-633</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-Nkx2.2</td>
			<td>University of Iowa, Developmental Hybridoma Bank</td>
			<td>74.5A5</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-Nkx6.1</td>
			<td>University of Iowa, Developmental Hybridoma Bank;&#160;</td>
			<td style="width:135px;">F55A12-supernatant</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-Olig2</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:135px;">MABN50</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-Pax-6</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td style="width:135px;">901301</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-Pdx1</td>
			<td style="width:135px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>AF2419</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-SOX1&#160;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">AF3369</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-SOX17</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">AF1924</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:215px;">B-27 Supplement, minus Vitamin A</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">basic fibroblast growth factor</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>PHG0264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Betacellulin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>50932345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chir99021</td>
			<td style="width:135px;">Stemgent</td>
			<td>04-000-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">CMRL 1066</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">99-603-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:215px;">Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td style="width:135px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:135px;">AMQAF1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:135px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:135px;">G7528&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">DAPI</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:135px;">D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Disposable Spinner Flasks</td>
			<td style="width:135px;">Corning, VWR</td>
			<td style="width:135px;">89089-814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">DMEM/F-12</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">DMSO&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Essential 6 Media</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>A1516501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">FAF-BSA</td>
			<td style="width:135px;">Proliant&#160;</td>
			<td style="width:135px;">68700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">FGF7</td>
			<td style="width:135px;">PeproTech</td>
			<td style="width:135px;">100-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Geltrex</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>A1413202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">GlutaMAX&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Heparin&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:135px;">H3149&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Ultrasensitive Insulin ELISA</td>
			<td>ALPCO Diagnostics</td>
			<td>80-INSHUU-E01.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">ITS-X</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:135px;">51500056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KGF</td>
			<td style="width:135px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">AF-100-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Knockout DMEM</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>10829018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">KnockOut Serum Replacement</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-3,3&#8242;,5-Triiodothyronine (T3)</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:135px;">642245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">LDN193189</td>
			<td style="width:135px;">Stemgent</td>
			<td>04-0074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Matrigel Matrix</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MCDB-131&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Cellgro&#160;</td>
			<td style="width:135px;">15-100-CV&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">MEM NEAA</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:215px;">mTeSR 1</td>
			<td style="width:135px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:135px;">5850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">N2 Supplement</td>
			<td style="width:135px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:135px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:135px;">S3817&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Noggin Fc Chimera Protein</td>
			<td style="width:135px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">3344-NG-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PdBU</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:135px;">524390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Mediatech&#160;</td>
			<td style="width:135px;">30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">RPMI</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sant1</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">S4572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SB431542</td>
			<td style="width:135px;">Stemgent</td>
			<td>04-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Smoothened Agonist, SAG</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td>566660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">StemPro Accutase</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>A1110501&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">TrypLE</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">12604013</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:215px;">Ultra-Low Attachment Microplates</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td>3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Vitamin C</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">A4544&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Wnt3a</td>
			<td style="width:135px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>5036-WN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">XAV 939</td>
			<td style="width:135px;">Tocris</td>
			<td style="width:135px;">3748</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">XXI</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:135px;">565790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Y-27632</td>
			<td style="width:135px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:135px;">72302</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transient treatment of human pluripotent stem cells with dmso to promote differentiation

多能性幹細胞(PSC)の使用が増加しているにもかかわらず、様々な系統にわたって胚および誘導多能性幹細胞(ESCおよびiPSC)を効率的に分化する課題が残っています。多数の分化プロトコルが開発されていますが、細胞株間の変動性と分化率の低さは、これらのプロトコルの実装に関する課題を与えています。ここで説明するのは、PSC の差別化能力を高めるための簡単で安価な手段です。ジメチルスルホキシド(DMSO)の濃度が低い幹細胞の治療は、指示分化後に異なる細胞型に分化する様々なPSCの傾向を有意に増加することが以前に示されている。この技術は、ニューロンや皮質スフェロイドから平滑筋細胞や肝細胞に至るまで、異なる種(例えば、マウス、霊長類、ヒト)に対して有効であることが示されています。DMSO前処理は、細胞周期を調節し、分化シグナルに対してより応答性の高い幹細胞をプライミングすることにより、PSC分化を改善します。ここでは、PSCを選択の系統とより効率的に区別するための再現性と広く適用可能な手段として、この単純なツールを使用するための詳細な方法論を提供します。

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Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation

ヒト多能性幹細胞(hPSC)から分化した細胞型を生成することは、大きな治療上の約束を持っていますが、依然として困難なままです。PSCは、多くの場合、適切な信号のセットで刺激された場合でも、区別することができない固有の不能を示します。ここでは、さまざまな PSC ライン間の多系統分化を強化する簡単なツールを説明します。

DMSOを用したヒト多能性幹細胞の一過性治療による分化を促進

Despite the growing use of pluripotent stem cells (PSCs), challenges in efficiently differentiating embryonic and induced pluripotent stem cells (ESCs and ...

これは、分化のための主細胞に任意の幹細胞株または分化プロトコルに適用することができる簡単な治療法です。1〜2%のDMSOを細胞培養維持培地に添加する必要がある。この技術の主な利点は、多能性幹細胞の分化能力を、分化のために細胞をプライミングすることによって選択した系統に有意に高めることができる点である。DMSO治療は、細胞が患者由来のiPSCと区別する可能性を高め、細胞補充療法、疾患モデリング、および薬物スクリーニングに使用できるようにします。これは、胚発生中のサブ増殖、分化、および仕様を制御する規制の早期発症を生じさせることができる。DMSO治療は、約50個のヒト胚性幹細胞および誘導多能性幹細胞株の分化を改善することを実証した。他の研究室は、マウスや霊長類などの他の種の幹細胞にとって有益であることを示しています。分化の発症の1日前に、DMSOを1または2%の濃度で24時間、典型的な維持培地に加えます。DMSO処理の24時間後、培地を交換し、通常の分化プロトコルを使用して進みます。原稿の方向に従って細胞を成長させます。細胞が適切な合流性に達したら、それらを解化し、単一の細胞懸濁液を調製する。トリパンブルーなどの生存マーカーを使用して、ヘモサイトメーターまたは自動セルカウンターを使用して生きた細胞を数えます。24時間DMSO前処理の中で80〜90%の合流を達成するために、細胞を1ウェルあたり500、000〜100万個の密度でコーティングされた6ウェルプレートにプレートします。二酸化炭素インキュベーターで37°Cで24時間細胞をインキュベートします。その後、培地を吸引し、1~2%DMSO溶液に交換します。細胞が分化する前に24〜28時間インキュベートすることを許可する。48時間インキュベートする場合は、24時間後に培地を新鮮なDMSO溶液に交換してください。3D培養分化を達成するために、細胞懸濁液中の細胞を増殖および収集する。生きた細胞を数え、ROCK阻害剤を用いた幹細胞培地のコーティングされていない低付着6ウェルプレートにプレートを付けます。典型的には、3Dヒト多能性幹細胞球は24時間以内に形成される。細胞が二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度で24時間インキュベートすることを可能にする。原稿の指示に従って、1〜2%DMSOを事前に温めた幹細胞培地で調製します。インキュベーション後に培地を交換するには、プレートを30度から45度の角度に傾け、細胞球体がウェルの底部に落ち着くようにします。培地を細胞から吸い上げ、DMSO溶液中で徐に再中断します。細胞が二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度で24〜48時間インキュベートすることを可能にする。DMSOを用いた細胞を2D培養用に事前に処理し、ノギンおよびSB431542ストック溶液を調製した。3~4日間のメディア交換のためにノックアウトDMEMで十分な10%ノックアウト血清交換、またはKOSRを準備してください。原稿に記載されているように、事前に温められたKOSRノックアウトDMEMにノギンとSB431542を加えることによって外胚葉分化培地を準備する。DMSO前処理後、細胞から培地を吸引し、各ウェルに2ミリリットルの分化培地を加える。細胞が二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度で3〜4日間インキュベートし、毎日メディアを新鮮な分化因子に置き換えます。DMSO前処理は非処置細胞と比較して細胞の増殖速度の一過性および用量依存的な減少をもたらす。この増殖の減少は、細胞間接触の増加と関連しており、これは特に2%DMSO処理細胞において顕著である。各胚芽層の原始マーカーに対して細胞が固定および染色されると、2%DMSO前処理が分化された生殖層細胞の割合を増加することが分かる。例えば、SOX17は、内胚葉細胞を可視化するために染色された。DMSOが中枢神経系前駆細胞型への分化に及ぼす影響を調べるため、ヒト誘発性多能性幹細胞は神経前駆細胞またはオリゴデンドロサイト前駆細胞のいずれかに分化することができる。コントロール細胞と比較して、2%DMSO前処理は神経前駆細胞マーカーPax6の発現を増加させる。同様に、前処理はオリゴデンドロシテ前駆細胞マーカーOlig2を発現する細胞の割合を増加させる。さらに、初期DMSO治療は、生体内移植後のヒト胚性幹細胞由来細胞機能を改善する。分化された膵臓前駆細胞を免疫不全マウスに移植すると、その機能性はグルコースチャレンジまたはKCl刺激に応答して試験することができる。細胞機能の改善は、移植後2週間から16週間に顕著である。考慮すべき最も重要な考慮事項は、あなたの幹細胞のサイクリングまたは倍増時間です。DMSO治療の長さは、細胞のサイクル時間と同じである必要があります。最初のDMSO処理の後、細胞増殖および細胞周期が幹細胞でどのように調節されているかを理解することができ、その治療は細胞周期のG1段階における増殖停止を促進するのに役立つ。この分化された細胞は、疾患関連のメカニズムを理解し、他の細胞タイプとの共培養、腫瘍原性アッセイ、および機能アッセイまたは移植研究で、分化された細胞が疾患表現型を救うことができるかどうかを判断するために使用することができる。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Stencil Micropatterning of Human Pluripotent Stem Cells for Probing Spatial Organization of Differentiation Fates

分化運命の空間組織を探るためのヒト多能性幹細胞のステンシルマイクロパターニング

Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

再現性の高い小分子ベースの分化プロトコルを使用したヒト多能性幹細胞から心筋細胞の大規模生産

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays

マイクロ電極アレイ上のネットワーク・アクティビティを測定するための人工多能性幹細胞の急速な神経分化

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

ひと多能性幹細胞からプリミティブかつ決定的な造血前駆細胞の分化を監督

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

NKX6-1への多能性幹細胞の効率的分化<sup&gt; +</sup&gt;膵臓前駆細胞

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

ヒト多能性幹細胞のin vitro分化における絨毛細胞へ

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

人間の胚または誘導多能性幹細胞からの網膜色素上皮細胞の急速な監督の分化

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a Na&#239;ve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency

Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a NaÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¯ve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency

従来のひと多能性幹細胞の向上多能分化と素朴なような状態の復帰化学

Na&#239;ve human pluripotent stem cells (N-hPSC) with improved functionality may have a wide impact in regenerative medicine. The goal of this protocol is ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

効率的かつスケーラブルな臨床的に互換性のある角膜輪部上皮幹細胞ひと多能性幹細胞からの分化

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

ヒト多能性幹細胞の肝細胞への効率的な分化

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...