Name: transient treatment of human pluripotent stem cells with dmso to promote differentiation
Uploaded: 2019-07-17T14:30:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado por subvenções da faculdade de medicina da Universidade de Stanford e uma bolsa Siebel concedida a S. C.

Os autores não têm nada a revelar.

Em resumo, este protocolo descreve uma ferramenta simples e barata para realçar a capacidade da diferenciação de pilhas de haste pluripotentes (PSCs) a todas as camadas de germe preliminares, vários tipos de pilhas especializadas do progenitor, e mesmo os tipos funcionais, maduros da pilha dentro in vitro e configurações in vivo. Ilustrados são protocolos específicos de diferenciação que foram efetivamente reproduzidos em nosso laboratório, bem como outros, mas qualquer protocolo de diferenciação de escolha pode ser usado após o tratamento DMSO. Como mostrado na tabela 1, vários laboratórios também demonstraram um aprimoramento da diferenciação do PSC após o tratamento com DMSO transiente usando diferentes paradigmas para gerar vários outros tipos de células terminais. Além disso, embora os métodos aqui descrevam o uso de PSCs humanos, o pré-tratamento com DMSO pode ser utilizado em todas as espécies e demonstrou ser efetivo em PSCs de camundongo, coelho e primatas.
Embora doses mais elevadas de DMSO sejam conhecidas como citotóxicas, as baixas doses utilizadas neste método (1%-2%) por um período transitório resultam em morte celular mínima. Quando os números de pilha totais imediatamente depois que o tratamento de DMSO pode diminuir devido à promoção do DMSO da apreensão do ciclo de pilha na fase G1 do ciclo de pilha, os estudos precedentes mostram que as pilhas podem alcangar o mesmo nível de confluência como culturas do controle após a remoção de DMSO3.
A porcentagem e a duração do pré-tratamento de DMSO devem ser otimizadas por linha celular. O tempo de tratamento deve ser ajustado com consideração para o tempo de ciclagem/duplicação das pilhas. Por exemplo, os PSCs do mouse normalmente têm tempos de ciclismo muito mais curtos de cerca de 15 h; assim, o tratamento de DMSO para 15 h para estas pilhas é suficiente. Alguns laboratórios também descobriram que o tratamento com DMSO é benéfico quando continuado durante o protocolo de diferenciação ou em concentrações mais baixas (ver tabela 1). Deve-se notar que algumas linhas do PSC são mais modificáveis à diferenciação para linhagens específicas. Por exemplo, as células HUES6 mostraram-se menos permissivas à diferenciação e, portanto, apresentaram melhora acentuada com o tratamento com DMSO (Figura 2). Alternativamente, as células HUES8 utilizadas na Figura 4 e na Figura 5 demonstraram ter uma maior propensão para a diferenciação endodérmica; assim, menos diferenças foram mostradas entre o controle e o DMSO para a diferenciação nos estágios iniciais para o endoderma definitivo. No entanto, o realce do pré-tratamento com DMSO é observado em estágios posteriores de diferenciação nesta linha celular (Figura 4B). O tratamento DMSO também é versátil em que é eficaz em ambos os sistemas de culturas de células 2D e 3D, ele pode ser usado com vários tipos de material de revestimento em placas de cultura celular, e funciona em diferentes tipos de meio de manutenção que promovem o crescimento e expansão de hPSCs (por exemplo, mTeSR, e8, mídia climatizada de MEF, etc.).
Mais geralmente, esses resultados sugerem que o estado inicial de células-tronco pluripotentes tem forte influência na propensão para diferenciação inicial, bem como na diferenciação terminal em tipos de células funcionais. Nós mostramos previamente que o tratamento DMSO funciona com o RB em hpscs3,5. RB desempenha um papel importante na promoção da diferenciação terminal, sobrevivência celular, e a estabilidade genética das células41,42,43,44, e pode, portanto, explicar os efeitos persistentes sobre as células diferenciado dos hPSCs tratados com DMSO. Visando esses primeiros modos de regulação pode colocar hPSCs em uma melhor trajetória para a diferenciação e, finalmente, melhorar a sua utilidade para a medicina regenerativa.

O uso de células-tronco pluripotentes levou a inúmeros avanços na pesquisa biomédica, incluindo os campos de medicina regenerativa e terapias baseadas em células-tronco, modelagem de doenças e triagem de drogas. Conduziu também à perspectiva global de uma investigação mais traduzível e de uma medicina personalizada. O advento da tecnologia de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) há mais de 20 anos permitiu que pesquisadores desenvolvessem células-tronco pluripotentes a partir de tecidos somáticos e diferenciá-los em tipos de células funcionais para estudar uma variedade de patologias, incluindo doenças cardiovasculares, neurológicas e imunológicas. Embora avanços significativos tenham sido feitos na tecnologia de diferenciação de células-tronco, os desafios na diferenciação efetiva de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) e iPSCs ainda persistem, limitando o uso generalizado da tecnologia de células-tronco em diferentes programas de pesquisa. A variabilidade inerente em diferentes linhagens celulares e clones continua a representar obstáculos para diferenciar as linhagens de células-tronco para as linagens desejadas1. Além disso, derivar células funcionais, terminalmente diferenciadas de hPSCs continua sendo um processo tedioso e ineficiente em muitas linhagens. Na verdade, as células diferenciadas de hPSCs muitas vezes não conseguem se diferenciar terminalmente em células funcionais2. Em outras terapias baseadas em células-tronco em movimento para uso em pacientes, há uma necessidade de melhorar e garantir a eficácia das células que são geradas a partir de hPSCs.
Nosso laboratório estabeleceu uma ferramenta rápida e barata para aumentar significativamente a eficiência de diferenciar iPSCs e ESCs em tipos de células maduras. Nós encontramos que o pré-tratamento de hipscs e de hESCs com o dimetil sulfóxido comumente usado do reagente (DMSO) para 24 h a 48 h antes da diferenciação dirigida conduz a uma melhoria marcada na capacidade da diferenciação da pilha de haste. O tratamento com DMSO aumenta a proporção de hiPSCs e hESCs na fase inicial do G1 do ciclo celular e ativa a proteína de retinoblastoma (RB)3, um regulador crítico de proliferação celular, sobrevivência e diferenciação4. Em trabalhos mais recentes, verificou-se que RB e seus membros da família são necessários para os efeitos pró-diferenciação do DMSO, de modo que a inativação transitória do RB suprime os efeitos do DMSO, enquanto a ativação constitutiva do RB de forma transitória aumenta Efeitos do DMSO5. Análoga ao ciclo celular durante o desenvolvimento embrionário, o ciclo celular de ESCS e iPSCs é caracterizado por uma fase abreviada do G1 que promove a autorenovação6,7,8. Esta fase abreviada do G1 permite uma proliferação mais irrestrita, mas limita o potencial de diferenciação de4,9. Promovendo a apreensão do crescimento em G1 e ativando controles do ponto de verificação no ciclo de pilha de hESCs e de iPSCs, o tratamento de DMSO primos pilhas para mudanças do destino da pilha que seguem a diferenciação dirigida.
Até o momento, o pré-tratamento com DMSO demonstrou melhorar a capacidade de diferenciação para todas as três camadas germinativas em mais de 30 controle e as linhas de células ESC e IPSC humanas específicas da doença3,5 , bem como a diferenciação de células-tronco e outras linhas celulares para uma variedade de outros tipos de células maduras em estudos subsequentes10,11,12,13,14,15,16, 17 anos de , 18 anos de , 19 anos de , 20 anos de , 21 anos de , 22 anos de , 23 anos de , 24 de cada , 25 anos de , 26 anos de , 27 anos de , 28 (tabela 1). Além disso, o tratamento com DMSO demonstrou ser eficaz no aprimoramento da diferenciação de células primárias não humanas21,23 (por exemplo, mouse, Primaz, coelho), sugerindo mecanismos compartilhados entre espécies. Por fim, o pré-tratamento com DMSO também foi estendido para a tecnologia de edição de genes, com um estudo específico mostrando que 24 h de pré-tratamento de DMSO de hESCs/iPSCs aumentaram significativamente a capacidade de repetições Palindromicas curtas agrupadas regularmente Interespaçadas (CRISPR) /Proteína-9 associada (Cas9)-eficiência de edição mediada de DNA não-codificante sem incorporar mutações não intencionais29. Aqui é fornecida uma metodologia detalhada do pré-tratamento do DMSO de hESCs e iPSCs para aplicações em biologia de células-tronco e diferenciação direcionada.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:651px;" width="651">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">21985023</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">9-Position stir plate&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Chemglass</td>
			<td style="width:135px;">CLS-4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Accutase</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">11105-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Activin A</td>
			<td style="width:135px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>338-AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Advanced RPMI</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">12633012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alk5i II</td>
			<td style="width:135px;">Axxora</td>
			<td style="width:135px;">ALX-270-445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">all-trans retinoic acid&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-Brachyury</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">AF2085</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:215px;">anti-C-peptide</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:135px;">GN-ID4</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-FoxA2</td>
			<td style="width:135px;">Millipore</td>
			<td>07-633</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-Nkx2.2</td>
			<td>University of Iowa, Developmental Hybridoma Bank</td>
			<td>74.5A5</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-Nkx6.1</td>
			<td>University of Iowa, Developmental Hybridoma Bank;&#160;</td>
			<td style="width:135px;">F55A12-supernatant</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-Olig2</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:135px;">MABN50</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-Pax-6</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td style="width:135px;">901301</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-Pdx1</td>
			<td style="width:135px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>AF2419</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-SOX1&#160;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">AF3369</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-SOX17</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">AF1924</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:215px;">B-27 Supplement, minus Vitamin A</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">basic fibroblast growth factor</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>PHG0264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Betacellulin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>50932345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chir99021</td>
			<td style="width:135px;">Stemgent</td>
			<td>04-000-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">CMRL 1066</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">99-603-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:215px;">Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td style="width:135px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:135px;">AMQAF1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:135px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:135px;">G7528&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">DAPI</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:135px;">D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Disposable Spinner Flasks</td>
			<td style="width:135px;">Corning, VWR</td>
			<td style="width:135px;">89089-814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">DMEM/F-12</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">DMSO&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Essential 6 Media</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>A1516501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">FAF-BSA</td>
			<td style="width:135px;">Proliant&#160;</td>
			<td style="width:135px;">68700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">FGF7</td>
			<td style="width:135px;">PeproTech</td>
			<td style="width:135px;">100-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Geltrex</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>A1413202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">GlutaMAX&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Heparin&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:135px;">H3149&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Ultrasensitive Insulin ELISA</td>
			<td>ALPCO Diagnostics</td>
			<td>80-INSHUU-E01.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">ITS-X</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:135px;">51500056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KGF</td>
			<td style="width:135px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">AF-100-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Knockout DMEM</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>10829018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">KnockOut Serum Replacement</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-3,3&#8242;,5-Triiodothyronine (T3)</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:135px;">642245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">LDN193189</td>
			<td style="width:135px;">Stemgent</td>
			<td>04-0074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Matrigel Matrix</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MCDB-131&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Cellgro&#160;</td>
			<td style="width:135px;">15-100-CV&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">MEM NEAA</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:215px;">mTeSR 1</td>
			<td style="width:135px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:135px;">5850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">N2 Supplement</td>
			<td style="width:135px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:135px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:135px;">S3817&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Noggin Fc Chimera Protein</td>
			<td style="width:135px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">3344-NG-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PdBU</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:135px;">524390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Mediatech&#160;</td>
			<td style="width:135px;">30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">RPMI</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sant1</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">S4572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SB431542</td>
			<td style="width:135px;">Stemgent</td>
			<td>04-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Smoothened Agonist, SAG</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td>566660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">StemPro Accutase</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>A1110501&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">TrypLE</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">12604013</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:215px;">Ultra-Low Attachment Microplates</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td>3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Vitamin C</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">A4544&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Wnt3a</td>
			<td style="width:135px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>5036-WN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">XAV 939</td>
			<td style="width:135px;">Tocris</td>
			<td style="width:135px;">3748</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">XXI</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:135px;">565790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Y-27632</td>
			<td style="width:135px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:135px;">72302</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transient treatment of human pluripotent stem cells with dmso to promote differentiation

Apesar do uso crescente de pilhas de haste pluripotentes (PSCs), os desafios em diferenciar eficientemente as pilhas de haste pluripotentes embrionárias e induzidas (ESCs e iPSCs) através das várias linhagens permanecem. Inúmeros protocolos de diferenciação foram desenvolvidos, mas a variabilidade entre as linhas celulares e as baixas taxas de diferenciação concebe desafios na implementação bem-sucedida desses protocolos. Descrito aqui é um meio fácil e barato para aumentar a capacidade de diferenciação de PSCs. Tem sido mostrado previamente que o tratamento de pilhas de haste com uma baixa concentração de dimetil sulfóxido (DMSO) aumenta significativamente a propensão de uma variedade de PSCs para diferenciar-se aos tipos diferentes da pilha que seguem a diferenciação dirigida. Esta técnica foi mostrada agora para ser eficaz através das espécies diferentes (por exemplo, rato, primata, e ser humano) em linhagens múltiplas, variando dos neurônios e dos esferoides corticais às pilhas de músculo lisas e aos hepatocytes. O pré-tratamento de DMSO melhora a diferenciação do PSC regulando o ciclo de pilha e as pilhas de haste de escorva para ser mais responsivo aos sinais da diferenciação. Fornecido aqui é a metodologia detalhada para usar esta ferramenta simples como um meio reprodutível e extensamente aplicável para diferenciar mais eficientemente PSCs a toda a linhagem da escolha.

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Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation

A geração de tipos de células diferenciadas a partir da célula-tronco pluripotente humana (hPSCs) possui grande promessa terapêutica, mas permanece desafiadora. PSCs muitas vezes exibem uma incapacidade inerente para diferenciar mesmo quando estimulado com um conjunto adequado de sinais. Descrito aqui é uma ferramenta simples para melhorar a diferenciação multilinhagem através de uma variedade de linhas PSC.

Tratamento transitório de células-tronco pluripotentes humanas com DMSO para promover a diferenciação

Despite the growing use of pluripotent stem cells (PSCs), challenges in efficiently differentiating embryonic and induced pluripotent stem cells (ESCs and ...

É um tratamento simples que pode ser aplicado a qualquer linha de células-tronco ou protocolo de diferenciação às células prime para diferenciação. Tudo o que é preciso fazer é adicionar DMSO a 1-2% no meio de manutenção da cultura celular. A principal vantagem dessa técnica é que permite aumentar significativamente o potencial de diferenciação das células-tronco pluripotentes em qualquer linhagem de escolha, escorraçando células para diferenciação.O tratamento com DMSO aumenta a chance de que as células se diferenciem dos iPSCs derivados do paciente, permitindo que sejam usados para terapia de substituição celular, modelagem de doenças e rastreamento de medicamentos. Pode dar origem ao início precoce da regulação que controla a sub-proliferação, a diferenciação e a especificação durante o desenvolvimento embrionário. Demonstramos que o tratamento DMSO melhora a diferenciação em quase 50 linhas de células-tronco pluripotentes embrionárias e induzidas.Enquanto outros laboratórios mostraram que é benéfico para células-tronco de outras espécies, como rato e primata. Um dia antes do início da diferenciação, adicione DMSO a uma concentração de 1 ou 2% por 24 horas no seu meio de manutenção típico. 24 horas após o tratamento DMSO, substitua o meio e prossiga com o seu protocolo de diferenciação habitual.Cultivar células de acordo com as instruções do manuscrito. Quando as células atingirem uma confluência apropriada, dissociá-las e preparar uma única suspensão celular. Conte as células vivas com um hemócito ou contador automático de células, usando um marcador de viabilidade, como o azul tripano.Para alcançar 80-90% de confluência dentro do pré-tratamento DMSO de 24 horas, coloque as células em uma placa revestida de seis poços a uma densidade de 500.000 a 1 milhão de células por poço. Incubar as células por 24 horas a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono. Em seguida, aspire a mídia e substitua-a por uma solução DMSO de 1-2%.Permita que as células incubam por 24-28 horas antes da diferenciação. Se incubar por 48 horas, substitua a mídia após 24 horas por uma nova solução DMSO. Para alcançar a diferenciação da cultura 3D, cresça e colete as células em uma suspensão celular.Conte as células vivas e as emplaque em uma placa de seis poços não revestida e de baixa fixação na mídia de células-tronco com inibidor de ROCHA. Normalmente, as esferas de células-tronco pluripotentes humanas 3D se formarão dentro de 24 horas. Permita que as células incubam por 24 horas a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono.Prepare 1-2% DMSO em mídia de células-tronco pré-aquecidas de acordo com as instruções do manuscrito. Para substituir a mídia após a incubação, incline a placa para um ângulo de 30 graus a 45 graus e permita que as esferas celulares se instalem na parte inferior do poço. Aspire a mídia das células e suspenda-as suavemente na solução DMSO.Permita que as células incubam por 24-48 horas a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono. Pré-tratar células com DMSO como descrito para culturas 2D e preparar soluções de estoque noggin e SB431542. Prepare o suficiente 10% de substituição de soro de nocaute, ou KOSR, em DMEM nocaute para três a quatro dias de mudança de mídia.Prepare a mídia de diferenciação ectodérmica adicionando noggin e SB431542 ao DMEM de nocaute KOSR pré-aquecido, conforme descrito no manuscrito. Após o pré-tratamento do DMSO, aspire a mídia das células e adicione dois mililitros de mídia de diferenciação a cada poço. Permita que as células incubam por três a quatro dias a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono, substituindo a mídia diariamente por novos fatores de diferenciação.O pré-tratamento do DMSO resulta em uma diminuição transitória e dependente de doses na taxa de crescimento celular em comparação com células não tratadas. Essa diminuição da proliferação está associada ao aumento do contato celular-celular, que é especialmente pronunciado nas células tratadas com DMSO de 2%. Quando as células são fixas e manchadas para marcadores prototípicos de cada camada de germe, pode-se ver que 2% de pré-tratamento DMSO resulta em uma proporção aumentada de células de camada germinamentimentada diferenciadas.Por exemplo, sox17 foi manchado para visualizar células de endoderme. A fim de investigar o efeito do DMSO na diferenciação para os tipos de células progenitoras do sistema nervoso central, as células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem poderiam ser diferenciadas em células progenitoras neurais ou células progenitoras oligodendrocyte. Em comparação com as células de controle, 2% do pré-tratamento DMSO aumenta a expressão do marcador celular progenitor neural Pax6.Da mesma forma, o pré-tratamento aumenta a proporção de células expressando oligodendrocyte progenitor marcador celular Olig2. Além disso, o tratamento inicial de DMSO melhora a função celular derivada de células-tronco embrionárias humanas após o transplante in vivo. Quando células progenitoras pancreáticas diferenciadas são transplantadas em camundongos imunodeficientes, sua funcionalidade pode ser testada em resposta a um desafio de glicose ou estimulação de KCl.Melhorias na funcionalidade celular são evidentes de duas semanas a 16 semanas após o transplante. A consideração mais importante a levar em conta é o tempo de ciclismo ou duplicação de suas células-tronco. O comprimento do tratamento DMSO deve ser o mesmo que o tempo de ciclismo das células.Após o tratamento inicial do DMSO, pode-se entender como a proliferação celular e o ciclo celular são regulados em células-tronco, pois o tratamento ajuda a promover a prisão de crescimento na fase G1 do ciclo celular. As células diferenciadas podem ser utilizadas para compreender mecanismos relacionados à doença, para co-cultivo com outros tipos de células, em ensaios de tumorigenicidade, e em ensaios funcionais ou estudos de transplante para determinar se as células diferenciadas podem resgatar um fenótipo da doença.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Stencil Micropatterning of Human Pluripotent Stem Cells for Probing Spatial Organization of Differentiation Fates

Stencil micropatterning de células-tronco pluripotentes humana para sondar organização espacial de diferenciação Fates

Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into ...

Biologia do Desenvolvimento

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Produção em larga escala de cardiomiócitos a partir de células-tronco pluripotentes humanas utilizando um altamente reprodutível pequeno-Based Molecule Protocolo de Diferenciação

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays

Rápido Neuronal diferenciação de células estaminais pluripotentes induzidas para medir a atividade de rede na Arrays Micro-eletrodo

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Dirigido a diferenciação de progenitores hematopoiéticos primitivo e definitiva de células pluripotentes humanas

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Diferenciação eficiente dos Pluripotent Stem Cells para NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; Progenitores pancreáticas

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Na diferenciação in vitro de pluripotentes humanas Células-tronco em células Trofoblásticas

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Rápida, dirigida a diferenciação de células epiteliais de pigmento Retinal de células-tronco humanas embrionárias ou induzida de Pluripotent

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a Na&#239;ve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency

Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a NaÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¯ve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency

Reversão química de células-tronco pluripotentes humanas convencionais para um estado de ingenuidade com potência melhorada Multilineage diferenciação

Na&#239;ve human pluripotent stem cells (N-hPSC) with improved functionality may have a wide impact in regenerative medicine. The goal of this protocol is ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Diferenciação dirigida eficiente e escalável de clinicamente compatível Corneal estroma epiteliais células-tronco de células pluripotentes humanas

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Diferenciação eficiente de células-tronco pluripotentes humanas em células hepáticas

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...