Name: transient treatment of human pluripotent stem cells with dmso to promote differentiation
Uploaded: 2019-07-17T14:30:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантами Школы медицины Стэнфордского университета и стипендией Сибеля, присужденной С.С.

Авторам нечего раскрывать.

Таким образом, этот протокол описывает простой и недорогой инструмент для повышения дифференциации потенциала плюрипотентных стволовых клеток (PSCs) для всех первичных слоев микробов, различные типы специализированных клеток-прародителей, и даже функциональные, зрелые типы клеток в пробирке и настройки in vivo. Иллюстрированные конкретные протоколы дифференциации, которые были эффективно воспроизведены в нашей лаборатории, а также другие, но любой протокол дифференциации выбора может быть использован после лечения DMSO. Как показано в таблице 1, ряд лабораторий также продемонстрировали повышение дифференциации PSC после переходного лечения DMSO с использованием различных парадигм для создания различных других типов терминальных клеток. Кроме того, хотя методы здесь описывают использование человека PSCs, DMSO предварительной обработки могут быть использованы для различных видов и было показано, чтобы быть эффективным в мыши, кролика и приматов PSCs.
Хотя более высокие дозы ДМСО, как известно, цитотоксические, низкие дозы, используемые в этом методе (1%-2%) для переходного периода приводит к минимальной гибели клеток. В то время как общие номера клеток сразу после лечения DMSO может уменьшиться из-за DMSO поощрения ареста клеточного цикла в фазе G1 клеточного цикла, предыдущие исследования показывают, что клетки способны достичь того же уровня спущения, как контроль культур после удаления DMSO3.
Процент и продолжительность предварительной обработки DMSO должны быть оптимизированы на одну клеточную линию. Время лечения должно быть скорректировано с учетом велосипедного / удвоения времени клеток. Например, мышь PSCs, как правило, имеют гораздо короче время езды на велосипеде около 15 ч; таким образом, лечение DMSO для 15 ч для этих клеток является достаточным. Некоторые лаборатории также обнаружили, что лечение DMSO будет полезным при продолжении протокола дифференциации или при более низких концентрациях (см. таблицу 1). Следует отметить, что некоторые линии ПСК более корректируются в дифференциации к конкретным линиям. Например, клетки HUES6 оказались менее разрешительными для дифференциации и, таким образом, заметно улучшились с помощью лечения ДМСО(рисунок 2). Кроме того, было показано, что клетки HUES8, используемые на рисунке 4 и рисунке 5, имеют более высокую склонность к эндодермальной дифференциации; таким образом, было выявлено меньше различий между контролем и ДМСО в отношении дифференциации на начальных этапах в направлении окончательного эндодерма. Тем не менее, повышение Предварительной обработки DMSO наблюдается на более поздних стадиях дифференциации в этой клеточной линии(рисунок 4B). Обработка DMSO также разносторонни в что она эффективна как в системах 2D и 3D клеточных культур, она может быть использована с различными типами материала покрытия на плитах культуры клетки, и она работает в по-разному типах средства обслуживания которые повышают рост и расширение hPSCs (например, mTeSR, E8, MEF условные носители и т.д.).
В более общем плане эти результаты свидетельствуют о том, что начальное состояние плюрипотентных стволовых клеток оказывает сильное влияние на склонность к первоначальной дифференциации, а также терминальную дифференциацию на функциональные типы клеток. Ранее мы показали, что лечение DMSO функции через Rb в hPSCs3,5. Rb играет важную роль в содействии терминальной дифференциации, выживанию клеток и генетической стабильности клеток41,42,43,44, и поэтому может объяснить постоянное воздействие на клетки дифференцированный от DMSO-обработанных hPSCs. Ориентация на эти ранние способы регулирования может поставить hPSCs на лучшую траекторию для дифференциации и в конечном итоге улучшить их полезность для регенеративной медицины.

Использование плюрипотентных стволовых клеток привело к многочисленным достижениям в области биомедицинских исследований, в том числе в области регенеративной медицины и стволовых клеток на основе терапии, моделирования заболеваний и скрининга наркотиков. Это также привело к общей перспективе более переводимых исследований и персонализированной медицины. Появление индуцированной плюрипотентной технологии стволовых клеток (iPSC) более 20 лет назад позволило исследователям развивать плюрипотентные стволовые клетки из соматических тканей и дифференцировать их в функциональные типы клеток для изучения различных патологий, в том числе сердечно-сосудистых, неврологических и иммунологических заболеваний. Хотя значительные успехи были достигнуты в технологии дифференциации стволовых клеток, проблемы в эффективной дифференциации человеческих эмбриональных стволовых клеток (HESCs) и iPSCs все еще сохраняются, ограничивая широкое использование технологии стволовых клеток по-разному исследовательских программ. Врожденная изменчивость между различными клеточными линиями и клонами продолжает создавать препятствия для дифференциирования линий стволовых клеток до желаемых linages1. Кроме того, вывод зрелых, неизлечимо дифференцированных функциональных клеток из hPSCs остается утомительным и неэффективным процессом во многих линиях. В самом деле, клетки дифференцированы от hPSCs часто не в состоянии неизлечимо дифференцировать в функциональные клетки2. В дальнейшем движущихся стволовых клеток на основе терапии для использования у пациентов, есть необходимость улучшить и обеспечить эффективность клеток, которые генерируются из hPSCs.
Наша лаборатория создала быстрый и недорогой инструмент для значительного повышения эффективности дифференциирования как iPSC, так и ESC на зрелые типы клеток. Мы обнаружили, что предварительная обработка hiPSCs и hESCs с широко используемым реагентом диметилсульксида (DMSO) для 24 ч до 48 h до направленной дифференциации приводит к заметному улучшению потенциала дифференциации стволовых клеток. Лечение ДМСО увеличивает долю HIPSCs и hESCs в начале фазы G1 клеточного цикла и активирует белок ретинобластомы (Rb)3, критический регулятор пролиферации клеток, выживания и дифференциации4. В более поздних работах, было установлено, что Рб и его члены семьи необходимы для про-дифференциации эффекты DMSO, так что преходящая инактивация Rb подавляет эффекты DMSO, в то время как составная активация Rb в преходящем образом усиливает Эффекты DMSO5. Аналогия с клеточным циклом во время эмбрионального развития, клеточный цикл ESCs и iPSCs характеризуетсясокращенной фазой G1, которая способствует самообновлению 6,7,8. Этот сокращенный этап G1 допускает более неограниченное распространение, ноограничивает возможности для дифференциации 4,9. Способствуя аресту роста в G1 и активируя контроль над контрольно-пропускными пунктами в клеточном цикле hESCs и iPSCs, лечение DMSO проселяет клетки для изменения судьбы клеток после направленной дифференциации.
На сегодняшний день, DMSO предварительной обработки было показано, чтобы улучшить дифференциацию потенциала для всех трех слоев зародыша в более чем 30 контроля и конкретных заболеваний человека ESC и iPSC клеточных линий3,5, а также дифференциации стволовых клеток и других клеточных линий к различным другим зрелым типам клеток в последующих исследованиях10,11,12,13,14,15,16, 17 Лет , 18 лет , 19 лет , 20 , 21 год , 22 Г. , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 (Таблица 1). Кроме того, было показано, что лечение DMSO является эффективным в усилении дифференциации нечеловеческих первичных клеток21,23 (например, мышь, примат, кролик), предлагая общие механизмы между видами. Наконец, преобработка DMSO также была распространена на технологию редактирования генов, при этом одно конкретное исследование показало, что 24 ч DMSO предварительной обработки hESCs/iPSCs значительно повысила способность кластерных регулярно межпространственных коротких palindromic повторов (CRISPR) /CRISPR-связанный белок-9 (Cas9)-опосредовано эффективность редактирования некодирующей ДНК без включения непреднамеренных мутаций29. Приведена в этой представлении подробная методология предварительной обработки ГССИ и IPSC DMSO для применения в биологии стволовых клеток и направленная дифференциация.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:651px;" width="651">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">21985023</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">9-Position stir plate&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Chemglass</td>
			<td style="width:135px;">CLS-4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Accutase</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">11105-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Activin A</td>
			<td style="width:135px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>338-AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Advanced RPMI</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">12633012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alk5i II</td>
			<td style="width:135px;">Axxora</td>
			<td style="width:135px;">ALX-270-445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">all-trans retinoic acid&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-Brachyury</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">AF2085</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:215px;">anti-C-peptide</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:135px;">GN-ID4</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-FoxA2</td>
			<td style="width:135px;">Millipore</td>
			<td>07-633</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-Nkx2.2</td>
			<td>University of Iowa, Developmental Hybridoma Bank</td>
			<td>74.5A5</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-Nkx6.1</td>
			<td>University of Iowa, Developmental Hybridoma Bank;&#160;</td>
			<td style="width:135px;">F55A12-supernatant</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-Olig2</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:135px;">MABN50</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-Pax-6</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td style="width:135px;">901301</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-Pdx1</td>
			<td style="width:135px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>AF2419</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-SOX1&#160;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">AF3369</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-SOX17</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">AF1924</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:215px;">B-27 Supplement, minus Vitamin A</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">basic fibroblast growth factor</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>PHG0264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Betacellulin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>50932345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chir99021</td>
			<td style="width:135px;">Stemgent</td>
			<td>04-000-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">CMRL 1066</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">99-603-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:215px;">Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td style="width:135px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:135px;">AMQAF1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:135px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:135px;">G7528&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">DAPI</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:135px;">D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Disposable Spinner Flasks</td>
			<td style="width:135px;">Corning, VWR</td>
			<td style="width:135px;">89089-814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">DMEM/F-12</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">DMSO&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Essential 6 Media</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>A1516501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">FAF-BSA</td>
			<td style="width:135px;">Proliant&#160;</td>
			<td style="width:135px;">68700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">FGF7</td>
			<td style="width:135px;">PeproTech</td>
			<td style="width:135px;">100-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Geltrex</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>A1413202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">GlutaMAX&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Heparin&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:135px;">H3149&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Ultrasensitive Insulin ELISA</td>
			<td>ALPCO Diagnostics</td>
			<td>80-INSHUU-E01.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">ITS-X</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:135px;">51500056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KGF</td>
			<td style="width:135px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">AF-100-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Knockout DMEM</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>10829018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">KnockOut Serum Replacement</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-3,3&#8242;,5-Triiodothyronine (T3)</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:135px;">642245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">LDN193189</td>
			<td style="width:135px;">Stemgent</td>
			<td>04-0074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Matrigel Matrix</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MCDB-131&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Cellgro&#160;</td>
			<td style="width:135px;">15-100-CV&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">MEM NEAA</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:215px;">mTeSR 1</td>
			<td style="width:135px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:135px;">5850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">N2 Supplement</td>
			<td style="width:135px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:135px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:135px;">S3817&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Noggin Fc Chimera Protein</td>
			<td style="width:135px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">3344-NG-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PdBU</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:135px;">524390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Mediatech&#160;</td>
			<td style="width:135px;">30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">RPMI</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sant1</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">S4572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SB431542</td>
			<td style="width:135px;">Stemgent</td>
			<td>04-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Smoothened Agonist, SAG</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td>566660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">StemPro Accutase</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>A1110501&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">TrypLE</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">12604013</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:215px;">Ultra-Low Attachment Microplates</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td>3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Vitamin C</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">A4544&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Wnt3a</td>
			<td style="width:135px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>5036-WN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">XAV 939</td>
			<td style="width:135px;">Tocris</td>
			<td style="width:135px;">3748</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">XXI</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:135px;">565790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Y-27632</td>
			<td style="width:135px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:135px;">72302</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transient treatment of human pluripotent stem cells with dmso to promote differentiation

Несмотря на растущее использование плюрипотентных стволовых клеток (ПСЦ), проблемы в эффективной дифференциации эмбриональных и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ESCs и iPSCs) по различным линиям остаются. Были разработаны многочисленные протоколы дифференциации, однако изменчивость между клеточными линиями и низкие показатели дифференциации прививают проблемы в успешной реализации этих протоколов. Описанный здесь является простым и недорогим средством для повышения потенциала дифференциации ЧОПов. Ранее было показано, что лечение стволовых клеток с низкой концентрацией диметилсулькоксида (DMSO) значительно повышает склонность различных ЧоС дифференцироваться к различным типам клеток после направленной дифференциации. Этот метод в настоящее время показано, чтобы быть эффективным для различных видов (например, мышь, примат, и человека) в нескольких линий, начиная от нейронов и корковых сфероидов для гладких мышечных клеток и гепатоцитов. Предварительная обработка DMSO улучшает дифференциацию PSC путем регулировать цикл клетки и priming стволовые клетки для того чтобы быть более чутко к сигналам дифференциации. Здесь приведена подробная методология использования этого простого инструмента в качестве воспроизводимого и широко применимого средства для более эффективного дифференцирования ЧОПов к любой линии выбора.

Watch this Scientific Journal Video about Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation at JoVE.com

Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation

Генерация дифференцированных типов клеток из человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs) имеет большие терапевтические перспективы, но остается сложной задачей. PSCs часто exhibit присущая неспособность продифференцировать даже когда простимулировано с правильным комплектом сигналов. Описанный здесь простой инструмент для повышения дифференциации многолинейных по различным линиям PSC.

Переходное лечение стволовых клеток человека с DMSO для содействия дифференциации

Despite the growing use of pluripotent stem cells (PSCs), challenges in efficiently differentiating embryonic and induced pluripotent stem cells (ESCs and ...

Это простое лечение, которое может быть применено к любой линии стволовых клеток или дифференциации протокола премьер-клеток для дифференциации. Все, что нужно сделать, это добавить DMSO на 1-2% в среде обслуживания культуры клеток. Основным преимуществом этой техники является то, что она позволяет значительно увеличить потенциал дифференциации плюрипотентных стволовых клеток в любую линию выбора путем грунтовки клеток для дифференциации.Лечение DMSO увеличивает вероятность того, что клетки будут отличаться от производных от пациента iPSCs, что позволяет использовать их для заместительной терапии клеток, моделирования заболеваний и скрининга лекарств. Это может привести к раннему началу регулирования, которое контролирует субпролиферацию, дифференциацию и спецификацию во время эмбрионального развития. Мы показали, что лечение DMSO улучшает дифференциацию почти в 50 эмбриональных и индуцированных плюрипотентных линиях стволовых клеток.В то время как другие лаборатории показали, что это полезно для стволовых клеток других видов, таких как мышь и примат. За день до начала дифференциации добавьте DMSO с концентрацией 1 или 2% в течение 24 часов в типичную среду обслуживания. Через 24 часа после лечения DMSO, заменить средний и приступить к обычной дифференциации протокола.Выращиваем клетки в соответствии с рукописными указаниями. Когда клетки достигают соответствующего слияния, отмежеваться от них и подготовить одну подвеску клетки. Подсчитайте живые клетки с гемоцитометром или автоматическим счетчиком ячейки, используя маркер жизнеспособности, такой как trypan blue.Для того, чтобы достичь 80-90% слияния в течение 24-часового предварительного лечения DMSO, пластины клеток на покрытием шесть хорошо пластины при плотности от 500000 до 1 миллиона клеток на колодец. Инкубировать клетки в течение 24 часов при 37 градусах по Цельсию в инкубаторе двуокиси углерода. Затем, аспирировать средства массовой информации и заменить его на 1-2%DMSO решение.Разрешить клетки инкубировать в течение 24-28 часов до дифференциации. При инкубации в течение 48 часов замените средства массовой информации через 24 часа свежим раствором DMSO. Для достижения дифференциации 3D культуры, расти и собирать клетки в клеточной подвески.Подсчитайте живые клетки и пластины их в неокрашенных, с низким уровнем крепления шесть хорошо пластины в стволовых клетках средств массовой информации с ингибитором ROCK. Как правило, 3D человеческие плюрипотентные сферы стволовых клеток образуются в течение 24 часов. Разрешить клеткам инкубировать в течение 24 часов при 37 градусах по Цельсию в инкубаторе двуокиси углерода.Подготовка 1-2%DMSO в предварительно разогретых стволовых клеток средств массовой информации в соответствии с рукописными направлениями. Чтобы заменить средства массовой информации после инкубации, наклоните пластину под углом от 30 до 45 градусов и позвольте клеточным сферам осесть в нижней части хорошо. Аспирировать средства массовой информации из ячеек и аккуратно повторно приостановить их в решении DMSO.Разрешить клетки инкубировать в течение 24-48 часов при 37 градусов по Цельсию в инкубаторе двуокиси углерода. Предварительное лечение клеток с DMSO, как описано для 2D культур, и подготовить noggin и SB431542 фондовых решений. Подготовка достаточно 10%knockout замены сыворотки, или KOSR, в нокаут DMEM в течение трех-четырех дней изменения средств массовой информации.Подготовьте эктодермальные средства дифференциации, добавив noggin и SB431542 к предварительно разогретому нокауту KOSR DMEM, как описано в рукописи. После предварительной обработки DMSO, аспирировать средства массовой информации из клеток и добавить два миллилитров дифференциации средств массовой информации для каждого хорошо. Разрешить клеткам инкубировать в течение трех-четырех дней при 37 градусах по Цельсию в инкубаторе двуокиси углерода, заменяя средства массовой информации ежедневно свежими факторами дифференциации.Предварительное лечение DMSO приводит к переходному и зависящему от дозы снижению темпов роста клеток по сравнению с необработаваемыми клетками. Это снижение пролиферации связано с увеличением контакта между клетками, который особенно выражен в 2%DMSO обработанных клеток. Когда клетки фиксируются и окрашиваются для прототипных маркеров каждого зародышевых слоя, видно, что 2%DMSO до лечения приводит к увеличению доли дифференцированных клеток зародышевых пластов.Например, SOX17 был окрашен для визуализации эндодермальных клеток. Для того, чтобы исследовать влияние DMSO на дифференциацию к типам клеток-предшественников центральной нервной системы, индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы либо в нейронные клетки-предшественники, либо в клетки-предшественники олигодендроцитов. По сравнению с контрольными клетками, 2%DMSO предварительное лечение увеличивает экспрессию нейронных маркеров клеток-предшественников Pax6.Аналогичным образом, предварительное лечение увеличивает долю клеток, выражаюющих олигодендроцитов прародителя клеточный маркер Olig2. Кроме того, первоначальное лечение DMSO улучшает функцию клеток стволовых клеток человека, полученных после трансплантации in-vivo. Когда дифференцированные клетки-предшественники поджелудочной железы пересажены в иммунодефицитных мышей, их функциональность может быть проверена в ответ на вызов глюкозы или стимуляции KCl.Улучшения в функциональности клеток очевидны от двух недель до 16 недель после трансплантации. Наиболее важным фактором, чтобы принять во внимание это езда на велосипеде или удвоение времени ваших стволовых клеток. Продолжительность лечения DMSO должна быть такой же, как время езды на велосипеде клеток.После первоначального лечения DMSO, можно понять, как пролиферацию клеток и клеточный цикл регулируются в стволовых клетках, так как лечение способствует росту ареста в фазе G1 клеточного цикла. Дифференцированные клетки могут быть использованы для понимания связанных с болезнями механизмов, для совместного культивирования с другими типами клеток, в анализах опухолевой геногенности, а также в функциональных анализах или трансплантации исследований, чтобы определить, если дифференцированные клетки могут спасти фенотип болезни.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Stencil Micropatterning of Human Pluripotent Stem Cells for Probing Spatial Organization of Differentiation Fates

Трафарет Micropatterning человеческих плюрипотентных стволовых клеток для исследования пространственной организации дифференциации Судеб

Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Крупномасштабное производство кардиомиоцитов из человеческих плюрипотентных стволовых клеток с использованием высокой воспроизводимостью Малый протокол Дифференциация Molecule на основе

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays

Быстрое Нейрональная Дифференциация индуцированные плюрипотентные стволовые клетки для измерения сетевой активности на микро-электродных Массивы

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Направлено дифференциация примитивные и окончательного гемопоэтических прародителей от человеческих плюрипотентных стволовых клеток

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Эффективное Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток к NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; панкреатических Предшественники

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Дифференциация человека плюрипотентных стволовых клеток в клетки трофобласта

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Быстрое, режиссер дифференциация клеток эпителия сетчатки пигмента от человеческого эмбриона или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a Na&#239;ve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency

Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a NaÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¯ve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency

Химическая Reversion обычных человеческих плюрипотентных стволовых клеток в наивно как состояние с более мультилинейного дифференциация потенции

Na&#239;ve human pluripotent stem cells (N-hPSC) with improved functionality may have a wide impact in regenerative medicine. The goal of this protocol is ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Высокоэффективные и масштабируемые направленного дифференцирования клинически совместимый роговицы послабляющие стволовых клеток эпителия от человеческих плюрипотентных стволовых клеток

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Эффективная дифференциация стволовых клеток человека в клетки печени

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...