Name: transient treatment of human pluripotent stem cells with dmso to promote differentiation
Uploaded: 2019-07-17T14:30:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por becas de la Escuela de Medicina de la Universidad de Stanford y una beca Siebel otorgada a S. C.

Los autores no tienen nada que revelar.

En resumen, este protocolo describe una herramienta simple y barata para mejorar la capacidad de diferenciación de las células madre pluripotentes (PSC) a todas las capas de gérmenes primarios, varios tipos de células progenitoras especializadas, e incluso tipos de células funcionales y maduras en y ajustes in vivo. Se ilustran protocolos de diferenciación específicos que se han reproducido eficazmente en nuestro laboratorio y en otros, pero cualquier protocolo de diferenciación de elección se puede utilizar después del tratamiento DMSO. Como se muestra en la Tabla 1, varios laboratorios también han demostrado una mejora de la diferenciación de PSC después del tratamiento de DMSO transitorio utilizando diferentes paradigmas para generar varios otros tipos de células terminales. Además, aunque los métodos aquí describen el uso de PSC humanas, el pretratamiento DMSO se puede utilizar en todas las especies y se ha demostrado que es eficaz en las PSC de ratón, conejo y primate.
Aunque se sabe que dosis más altas de DMSO son citotóxicas, las dosis bajas utilizadas en este método (1%-2%) durante un período transitorio resulta en una mínima muerte celular. Mientras que el número total de células inmediatamente después del tratamiento CONDMSO puede disminuir debido a la promoción de DMSO de la detención del ciclo celular en la fase G1 del ciclo celular, estudios previos muestran que las células son capaces de alcanzar el mismo nivel de confluencia que los cultivos de control después de la eliminación de DMSO3.
El porcentaje y la duración del pretratamiento DMSO deben optimizarse por línea celular. El tiempo de tratamiento debe ajustarse teniendo en cuenta el tiempo de ciclo/duplicación de las células. Por ejemplo, los PSC de ratón suelen tener tiempos de ciclismo mucho más cortos de aproximadamente 15 h; por lo tanto, el tratamiento DMSO para 15 h para estas células es suficiente. Algunos laboratorios también han encontrado que el tratamiento DMSO es beneficioso cuando se continúa durante el protocolo de diferenciación o a concentraciones más bajas (ver Tabla 1). Cabe señalar que algunas líneas de la PSC son más modificables para la diferenciación a linajes específicos. Por ejemplo, se ha demostrado que las células HUES6 son menos permisivas a la diferenciación y, por lo tanto, tuvieron una mejora marcada con el tratamiento dmSO (figura2). Alternativamente, las células HUES8 utilizadas en la Figura 4 y la Figura 5 han demostrado tener una mayor propensión hacia la diferenciación endodérmica; por lo tanto, se mostraron menos diferencias entre el control y la DMSO para la diferenciación en las etapas iniciales hacia el endodermo definitivo. No obstante, la mejora del pretratamiento DMSO se observa en etapas posteriores de diferenciación en esta línea celular (Figura4B). El tratamiento DMSO también es versátil en el sentido de que es eficaz en sistemas de cultivos celulares 2D y 3D, se puede utilizar con varios tipos de material de recubrimiento en placas de cultivo celular, y funciona en diferentes tipos de medios de mantenimiento que promueven el crecimiento y la expansión de (por ejemplo, mTeSR, E8, medios condicionados MEF, etc.).
En términos más generales, estos resultados sugieren que el estado inicial de las células madre pluripotentes tiene una fuerte influencia en la propensión a la diferenciación inicial, así como la diferenciación terminal en tipos de células funcionales. Hemos demostrado previamente que el tratamiento DMSO funciona a través de Rb en hPSCs3,5. Rb desempeña un papel importante en la promoción de la diferenciación terminal, la supervivencia celular y la estabilidad genética de las células41,42,43,44, y por lo tanto puede explicar los efectos persistentes sobre las células diferenciados de los hPSC tratados por DMSO. Dirigirse a estos primeros modos de regulación puede colocar los hPSC en una mejor trayectoria para la diferenciación y, en última instancia, mejorar su utilidad para la medicina regenerativa.

El uso de células madre pluripotentes ha dado lugar a numerosos avances en la investigación biomédica, incluidos los campos de la medicina regenerativa y las terapias basadas en células madre, el modelado de enfermedades y el cribado de fármacos. También ha llevado a la perspectiva general de una investigación más traducible y de medicina personalizada. El advenimiento de la tecnología inducida de células madre pluripotentes (iPSC) hace más de 20 años ha permitido a los investigadores desarrollar células madre pluripotentes a partir de tejidos somáticos y diferenciarlas en tipos de células funcionales para estudiar una variedad de patologías, cardiovasculares, neurológicas e inmunológicas. Aunque se han logrado avances significativos en la tecnología de diferenciación de células madre, todavía persisten los desafíos en la diferenciación efectiva de células madre embrionarias humanas (HESC) y los ISPs, lo que limita el uso generalizado de la tecnología de células madre en diferentes programas de investigación. La variabilidad inherente a través de diferentes líneas celulares y clones sigue planteando obstáculos para diferenciar las líneas de células madre a los linages deseados1. Además, la derivación de células funcionales maduras y diferenciadas terminalmente de los hPSC sigue siendo un proceso tedioso e ineficiente a través de muchos linajes. De hecho, las células diferenciadas de los hPSCa menudo no logran diferenciarse terminalmente en celdas funcionales 2. En el movimiento de terapias basadas en células madre para su uso en pacientes, existe la necesidad de mejorar y asegurar la eficacia de las células que se generan a partir de hPSCs.
Nuestro laboratorio ha establecido una herramienta rápida y económica para mejorar significativamente la eficiencia de diferenciar tanto los iPSC como los ESC en tipos de células maduras. Encontramos que el pretratamiento de hiPSC s y hESCs con el sulfóxido de dimetil reactivo comúnmente utilizado (DMSO) durante 24 h a 48 h antes de la diferenciación dirigida resulta en una mejora marcada en la capacidad de diferenciación de células madre. El tratamiento con DMSO aumenta la proporción de hiPSC y hESC en la fase G1 temprana del ciclo celular y activa la proteína retinoblastoma (Rb)3, un regulador crítico de la proliferación celular, supervivencia y diferenciación4. En trabajos más recientes, se ha encontrado que Rb y sus familiares son necesarios para los efectos pro-diferenciación de DMSO, de modo que la inactivación transitoria de Rb suprime los efectos de DMSO, mientras que la activación constitutiva de Rb de una manera transitoria mejora Efectos de DMSO5. Análogo al ciclo celular durante el desarrollo embrionario, el ciclo celular de esCs e iPSCs se caracteriza por una fase Abreviada G1 que promueve la auto-renovación6,7,8. Esta fase abreviada g1 permite una proliferación más irresa, pero limita el potencial de diferenciación4,9. Al promover el detención del crecimiento en G1 y activar los controles de punto de control en el ciclo celular de los HESC y los iPSC, el tratamiento DMSO prepara células para los cambios en el destino celular tras la diferenciación dirigida.
Hasta la fecha, se ha demostrado que el pretratamiento DMSO mejora la capacidad de diferenciación de lastres capas de gérmenes en más de 30 líneas de células HUMANAs de ESC e iPSC específicas para el control y la enfermedad 3,5, así como la diferenciación de células madre y otras líneas celulares a una variedad de otros tipos de células maduras en estudios posteriores10,11,12,13,14,15,16, 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 (Cuadro 1). Además, se ha demostrado que el tratamiento con DMSO es eficaz para mejorar la diferenciación de las células primarias no humanas21,23 (por ejemplo, ratón, primate, conejo), lo que sugiere mecanismos compartidos entre especies. Por último, el pretratamiento DMSO también se ha extendido a la tecnología de edición de genes, con un estudio en particular que muestra que el pretratamiento de 24 horas DMSO de hESCs/iPSCs aumentó significativamente la capacidad de repeticiones palindrómicas cortas interespaciales agrupadas (CRISPR) /CRISPR-associated protein-9 (Cas9)-mediado eficiencia de edición del ADN no codificante sin incorporar mutaciones no intencionadas29. Aquí se proporciona una metodología detallada del pretratamiento DMSO de hESC s y iPSCs para aplicaciones en biología de células madre y diferenciación dirigida.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:651px;" width="651">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">21985023</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">9-Position stir plate&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Chemglass</td>
			<td style="width:135px;">CLS-4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Accutase</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">11105-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Activin A</td>
			<td style="width:135px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>338-AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Advanced RPMI</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">12633012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alk5i II</td>
			<td style="width:135px;">Axxora</td>
			<td style="width:135px;">ALX-270-445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">all-trans retinoic acid&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-Brachyury</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">AF2085</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:215px;">anti-C-peptide</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:135px;">GN-ID4</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-FoxA2</td>
			<td style="width:135px;">Millipore</td>
			<td>07-633</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-Nkx2.2</td>
			<td>University of Iowa, Developmental Hybridoma Bank</td>
			<td>74.5A5</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-Nkx6.1</td>
			<td>University of Iowa, Developmental Hybridoma Bank;&#160;</td>
			<td style="width:135px;">F55A12-supernatant</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-Olig2</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:135px;">MABN50</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-Pax-6</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td style="width:135px;">901301</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-Pdx1</td>
			<td style="width:135px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>AF2419</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-SOX1&#160;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">AF3369</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-SOX17</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">AF1924</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:215px;">B-27 Supplement, minus Vitamin A</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">basic fibroblast growth factor</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>PHG0264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Betacellulin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>50932345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chir99021</td>
			<td style="width:135px;">Stemgent</td>
			<td>04-000-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">CMRL 1066</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">99-603-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:215px;">Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td style="width:135px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:135px;">AMQAF1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:135px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:135px;">G7528&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">DAPI</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:135px;">D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Disposable Spinner Flasks</td>
			<td style="width:135px;">Corning, VWR</td>
			<td style="width:135px;">89089-814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">DMEM/F-12</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">DMSO&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Essential 6 Media</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>A1516501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">FAF-BSA</td>
			<td style="width:135px;">Proliant&#160;</td>
			<td style="width:135px;">68700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">FGF7</td>
			<td style="width:135px;">PeproTech</td>
			<td style="width:135px;">100-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Geltrex</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>A1413202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">GlutaMAX&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Heparin&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:135px;">H3149&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Ultrasensitive Insulin ELISA</td>
			<td>ALPCO Diagnostics</td>
			<td>80-INSHUU-E01.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">ITS-X</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:135px;">51500056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KGF</td>
			<td style="width:135px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">AF-100-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Knockout DMEM</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>10829018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">KnockOut Serum Replacement</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-3,3&#8242;,5-Triiodothyronine (T3)</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:135px;">642245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">LDN193189</td>
			<td style="width:135px;">Stemgent</td>
			<td>04-0074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Matrigel Matrix</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MCDB-131&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Cellgro&#160;</td>
			<td style="width:135px;">15-100-CV&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">MEM NEAA</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:215px;">mTeSR 1</td>
			<td style="width:135px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:135px;">5850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">N2 Supplement</td>
			<td style="width:135px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:135px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:135px;">S3817&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Noggin Fc Chimera Protein</td>
			<td style="width:135px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">3344-NG-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PdBU</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:135px;">524390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Mediatech&#160;</td>
			<td style="width:135px;">30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">RPMI</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sant1</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">S4572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SB431542</td>
			<td style="width:135px;">Stemgent</td>
			<td>04-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Smoothened Agonist, SAG</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td>566660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">StemPro Accutase</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>A1110501&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">TrypLE</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">12604013</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:215px;">Ultra-Low Attachment Microplates</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td>3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Vitamin C</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">A4544&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Wnt3a</td>
			<td style="width:135px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>5036-WN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">XAV 939</td>
			<td style="width:135px;">Tocris</td>
			<td style="width:135px;">3748</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">XXI</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:135px;">565790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Y-27632</td>
			<td style="width:135px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:135px;">72302</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transient treatment of human pluripotent stem cells with dmso to promote differentiation

A pesar del creciente uso de células madre pluripotentes (PSC), siguen existiendo desafíos para diferenciar eficientemente las células madre embrionarias e inducidas pluripotentes (ESC e iPSC) a través de varios linajes. Se han desarrollado numerosos protocolos de diferenciación, pero la variabilidad entre las líneas celulares y las bajas tasas de diferenciación transmiten desafíos en la implementación exitosa de estos protocolos. Aquí se describe un medio fácil y económico para mejorar la capacidad de diferenciación de los PSC. Se ha demostrado previamente que el tratamiento de células madre con una baja concentración de dimetilsulfóxido (DMSO) aumenta significativamente la propensión de una variedad de PSC a diferenciarse a diferentes tipos de células después de la diferenciación dirigida. Esta técnica ahora ha demostrado ser eficaz en diferentes especies (por ejemplo, ratón, primate y humano) en múltiples linajes, que van desde neuronas y esferoides corticales hasta células musculares lisas y hepatocitos. El pretratamiento DMSO mejora la diferenciación de la PSC mediante la regulación del ciclo celular y el cebado de las células madre para ser más sensible a las señales de diferenciación. Aquí se proporciona la metodología detallada para utilizar esta sencilla herramienta como un medio reproducible y ampliamente aplicable para diferenciar de manera más eficiente los PSC con cualquier linaje de elección.

Watch this Scientific Journal Video about Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation at JoVE.com

Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation

La generación de tipos de células diferenciadas a partir de células madre pluripotentes humanas (hPSC) tiene una gran promesa terapéutica, pero sigue siendo un desafío. Los PSC a menudo exhiben una incapacidad inherente para diferenciar incluso cuando se estimulan con un conjunto adecuado de señales. Aquí se describe una herramienta sencilla para mejorar la diferenciación multilínea en una variedad de líneas PSC.

Tratamiento transitorio de células madre pluripotentes humanas con DMSO para promover la diferenciación

Despite the growing use of pluripotent stem cells (PSCs), challenges in efficiently differentiating embryonic and induced pluripotent stem cells (ESCs and ...

Es un tratamiento simple que se puede aplicar a cualquier línea de células madre o protocolo de diferenciación a las células principales para la diferenciación. Todo lo que uno tiene que hacer es agregar DMSO en 1-2% en el medio de mantenimiento de cultivo celular. La principal ventaja de esta técnica es que permite aumentar significativamente el potencial de diferenciación de las células madre pluripotentes en cualquier linaje de elección mediante el cebado de células para la diferenciación.El tratamiento con DMSO aumenta la posibilidad de que las células se diferencien de los iPSC derivados del paciente, lo que les permite ser utilizadas para la terapia de reemplazo celular, el modelado de enfermedades y la detección de medicamentos. Puede dar lugar a la aparición temprana de la regulación que controla la sub-proliferación, diferenciación y especificación durante el desarrollo embrionario. Hemos demostrado que el tratamiento con DMSO mejora la diferenciación en casi 50 líneas de células madre pluripotentes embrionarias e inducidas por humanos.Mientras que otros laboratorios han demostrado que es beneficioso para las células madre de otras especies, como el ratón y el primate. Un día antes del inicio de la diferenciación, agregue DMSO a una concentración de 1 o 2% durante 24 horas en su medio de mantenimiento típico. 24 horas después del tratamiento con DMSO, sustituya el medio y proceda con su protocolo de diferenciación habitual.Cultivar células de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Cuando las células alcancen una confluencia adecuada, disociarlas y preparar una suspensión de una sola célula. Cuente las células vivas con un hemocitoómetro o un contador de celdas automático, utilizando un marcador de viabilidad como el azul tripano.Con el fin de lograr una confluencia del 80-90% dentro del pretratamiento DMSO de 24 horas, vajilla las células en una placa recubierta de seis pozos a una densidad de 500.000 a 1 millón de células por pozo. Incubar las células durante 24 horas a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono. A continuación, aspire el medio y sustitúyalo por una solución de 1-2%DMSO.Deje que las células se incuban durante 24-28 horas antes de la diferenciación. Si incuba durante 48 horas, sustituya el medio después de 24 horas con una solución DMSO fresca. Para lograr la diferenciación del cultivo 3D, crezca y recoja las células en una suspensión celular.Cuente las células vivas y platéjelas en una placa de seis pozos sin recubrimiento y de baja fijación en medios de células madre con inhibidor DE ROCK. Típicamente, las esferas de células madre pluripotentes humanas 3D se formarán dentro de las 24 horas. Permita que las células se incuban durante 24 horas a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono.Preparar 1-2%DMSO en medios de células madre precaleados de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Para reemplazar el medio después de la incubación, incline la placa a un ángulo de 30 grados a 45 grados y permita que las esferas celulares se asienten en la parte inferior del pozo. Aspirar los medios de las células y volver a suspenderlos suavemente en la solución DMSO.Permita que las células se incuban durante 24-48 horas a 37 grados celsius en una incubadora de dióxido de carbono. Pre-tratar las células con DMSO como se describe para cultivos 2D, y preparar soluciones de stock noggin y SB431542. Prepare suficiente reemplazo de suero 10%knockout, o KOSR, en un DMEM noqueador durante tres a cuatro días de cambio de medios.Preparar medios de diferenciación ectodérmica añadiendo noggin y SB431542 a KOSR knockout DMEM precalegado como se describe en el manuscrito. Después del pretratamiento de DMSO, aspirar medios de las células y añadir dos mililitros de medios de diferenciación a cada pozo. Permita que las células se incuban durante tres a cuatro días a 37 grados celsius en una incubadora de dióxido de carbono, reemplazando los medios diariamente con factores de diferenciación frescos.El pretratamiento de DMSO da como resultado una disminución transitoria y dependiente de la dosis en la tasa de crecimiento celular en comparación con las células no tratadas. Esta disminución de la proliferación se asocia con un aumento en el contacto de célula a célula, que es especialmente pronunciado en las células tratadas con 2%DMSO. Cuando las células se fijan y se tiñen para los marcadores prototípicos de cada capa germinal, se puede observar que el pretratamiento de 2%DMSO da como resultado una mayor proporción de células de capa germinal diferenciadas.Por ejemplo, SOX17 se tiñe para visualizar las células de endodermo. Con el fin de investigar el efecto de DMSO en la diferenciación a los tipos de células progenitoras del sistema nervioso central, las células madre pluripotentes inducidas por el hombre podrían diferenciarse en células progenitoras neuronales o células progenitoras de oligodendrocitos. En comparación con las células de control, el pretratamiento de 2%DMSO aumenta la expresión del marcador de células progenitoras neuronales Pax6.Del mismo modo, el pretratamiento aumenta la proporción de células que expresan el marcador de células progenitores de oligodendrocitos Olig2. Además, el tratamiento inicial de DMSO mejora la función celular derivada de células madre embrionarias humanas después del trasplante in vivo. Cuando las células progenitoras pancreáticas diferenciadas se trasplantan en ratones inmunodeficientes, su funcionalidad se puede probar en respuesta a un desafío de glucosa o estimulación de KCl.Las mejoras en la funcionalidad celular son evidentes de dos semanas a 16 semanas después del trasplante. La consideración más importante a tener en cuenta es el ciclo o el tiempo de duplicación de las células madre. La duración del tratamiento con DMSO debe ser la misma que la del tiempo de ciclo de las células.Después del tratamiento inicial de DMSO, se puede entender cómo la proliferación celular y el ciclo celular se regulan en las células madre, como el tratamiento ayuda a promover la detención del crecimiento en la fase G1 del ciclo celular. Las células diferenciadas se pueden utilizar para comprender los mecanismos relacionados con la enfermedad, para el co-cultivo con otros tipos de células, en ensayos de tumorigenicidad, y en ensayos funcionales o estudios de trasplante para determinar si las células diferenciadas pueden rescatar un fenotipo de la enfermedad.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Stencil Micropatterning of Human Pluripotent Stem Cells for Probing Spatial Organization of Differentiation Fates

Stencil Micropatterning de las células madre pluripotentes para el sondeo Organización Espacial de la diferenciación Parcas

Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

La producción a gran escala de los cardiomiocitos de células madre pluripotentes utilizando un pequeño protocolo de diferenciación basada en la molécula altamente reproducible

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays

Neuronal rápida diferenciación de células madre pluripotentes inducidas para la medición de actividad de red en matrices de micro-electrodos

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Dirige la diferenciación de progenitores hematopoyéticos primitivo y definitivo de las células madre Pluripotent humanas

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

La diferenciación eficiente de pluripotentes células madre a NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; Progenitores pancreáticas

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Diferenciación in vitro de células madre pluripotentes humana en células trofoblásticas

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Diferenciación rápida y dirigida de las células epiteliales del pigmento retiniano de humanos embrionarios o inducidas pluripotenciales células

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a Na&#239;ve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency

Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a NaÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¯ve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency

Reversión química de células madre pluripotentes humanas convencionales a un estado ingenuo con potencia mejorada del Multilineage diferenciación

Na&#239;ve human pluripotent stem cells (N-hPSC) with improved functionality may have a wide impact in regenerative medicine. The goal of this protocol is ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Eficiente y escalable diferenciación dirigida de clínico Compatible córnea Limbal epitelial las células madre de células madre pluripotentes humanas

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Diferenciación eficiente de células madre pluripotentes humanas en células hepáticas

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...