Name: transient treatment of human pluripotent stem cells with dmso to promote differentiation
Uploaded: 2019-07-17T14:30:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation at JoVE.com

Detta arbete stöddes av stipendier från Stanford University School of Medicine och en Siebel Fellowship tilldelas till S. C.

1. stamcells underhåll
Anmärkning: Det cell underhållsprotokoll som beskrivs nedan gäller för pluipotenta stamceller (PSCs) som upprätthålls i en anhängare av ett monolayer. Media, andra reagenser och cellodlingsplattor som används före DMSO-behandling kan justeras efter behov. För alla följande protokoll i detta manuskript ska celler hanteras under ett biologiskt säkerhetsskåp.
<ol><li>Coat steril, 6 brunn, vävnadsodling-behandlade plattor med en pluripotenta stamcells-kvalificerad matris eller substrat beredd enligt tillverkarens anvisningar och inkubera i minst 1 h i en CO2 inkubator (5% Co2, fuktig atmosfär). Belagda plåtar kan fileras och förvaras vid 4 ° c i upp till en vecka.</li>
	<li>Tina de kryopreserverade PSCs i en 37 ° c vattenbad. Sterilisera injektionsflaska med etanol före introduktion till det biologiska säkerhetsskåpet, sedan omedelbart överföra cellerna genom pipettering till ett sterilt koniskt rör som innehåller 5-10 volymer av förvärmda stamcells medier.</li>
	<li>Centrifugera cellerna vid 300 x g i 5 minuter vid rumstemperatur (RT).</li>
	<li>Aspirera på mediet och försiktigt Omsuspendera cellpelleten i 1 mL stamcells Media kompletterat med en 10 μM berg hämmare, såsom Y-27632.</li>
	<li>Aspirera kulturen matrisen från plattan och utsäde cellerna vid önskad densitet, typiskt 0.5-1 x 106 celler per brunn i minst 2 ml stamcellsmedia per brunn. Anmärkning: Den plätering densitet kan variera mellan olika cellinjer, och kloner och bör optimeras i enlighet med detta.</li>
	<li>Underhålla cellerna genom att ersätta med föruppvärmd stamceller Media dagligen. Dela upp cellerna på ungefär 70%-80% confluency eller när cellkolonierna börjar ta kontakt.</li>
	<li>För att dela upp celler, aspirera på mediet och tvätta cellerna en gång med steril PBS. Inkubera cellerna med 1 mL dissociationsenzymlösning per brunn under 5-10 minuter vid 37 ° c.</li>
	<li>Tvätta och Omsuspendera cellerna med förvärmda stamcells medier och överför till ett sterilt koniskt rör med 5-10 volymer stamcells medier. Följ steg 1.3-1.7 för att platta cellerna.</li>
</ol>2. DMSO förbehandling
Anmärkning: Vid plätering cellerna för DMSO förbehandling före differentiering, bör start plätering CELLTÄTHETEN optimeras med hänsyn till den typiska tillväxttakten i stamcells linjen samt differentierings protokoll som används. Validera pluripotensen med konventionella markörer, efter behov. Celler bör blint minst 1x-2x efter initial upptining före differentiering.
<ol><li>
2D-kulturdifferentiering
	<ol>
<li>När cellerna når en lämplig sammanlänkning, förbereda belagda plattor, separera cellerna, och förbereda en encellig suspension som beskrivs ovan.</li>
		<li>Räkna levande celler med hjälp av en hemocytometern eller automatisk cell räknare inklusive trypan blå eller annan lönsamhet markör.</li>
		<li>Platta cellerna på en bestruket 6 väl tallrik på 0.5-1 x 106 celler per brunn i stamceller media med 10 μm rock inhibitor. Anmärkning: För de cellinjer testas i vårt laboratorium, dessa tätheter resulterade typiskt i 80%-90% konfluenta celler inom 24 h DMSO förbehandling.</li>
		<li>Låt cellerna Inkubera i 24 timmar vid 37 ° c i en CO2 -inkubator (5% Co2, fuktig atmosfär).</li>
		<li>Förbered 1%-2% DMSO i föruppvärmd stamceller media (t. ex. 100 μl av DMSO i 10 ml Media = 1% DMSO lösning, eller 200 μl DMSO i 10 ml Media = 2% DMSO lösning).</li>
		<li>Efter 24 h inkubation, aspirera media från celler och ersätta den med DMSO lösning.</li>
		<li>Låt cellerna Inkubera i 24 h till 48 h vid 37 ° c i en CO2 -inkubator (5% Co2, fuktig atmosfär) före differentiering. Anmärkning: Typiskt, en 24 h DMSO behandling är tillräcklig över en majoritet av mänskliga ESC och iPSC linjer. Cellinjer med mycket långsam tillväxt (långa fördubblings tider) kan dra nytta av 48 h inkubering med DMSO. För en 48 h inkubation med DMSO, kan Media ersättas med färska stamceller media med 1%-2% DMSO efter den första 24 h av behandling.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
3D-kultur differentiering:
	<ol>
<li>När cellerna når en lämplig sammanlänkning, separera och samla in cellerna i en cellsuspension som beskrivs ovan.</li>
		<li>Räkna levande celler med hjälp av en hemocytometern eller automatisk cell räknare inklusive en livskraftig markör.</li>
		<li>Platta cellerna i en obestruket, låg-bilaga 6 väl plattan på 0.5-1 x 106 celler per brunn i stamceller media med 10 μm rock inhibitor. Anmärkning: För de cellinjer testade i vårt laboratorium, dessa tätheter resulterade typiskt i 3D hPSC sfär formation inom 24 h för att sätta celler.</li>
		<li>Låt cellerna Inkubera i 24 timmar vid 37 ° c i en CO2 -inkubator (5% Co2, fuktig atmosfär).</li>
		<li>Förbered 1%-2% DMSO i föruppvärmd stamceller media (t. ex. 100 μl av DMSO i 10 ml Media = 1% DMSO lösning, eller 200 μl av DMSO i 10 ml Media = 2% DMSO lösning).</li>
		<li>Byt ut mediet efter standardprocedurer (t. ex. luta plattan på en 30 °-45 ° vinkel för att tillåta cell sfärer att bosätta sig i botten av brunnen; överför celler till ett sterilt koniskt rör och låt cell sfärer bosätta sig i botten av röret; eller försiktigt samla in celler jag n suspension med hjälp av en 5 eller 10 mL pipett till ett sterilt koniskt rör och centrifugera celler vid 300 x g i 5 minuter vid RT).</li>
		<li>Aspirera media från celler och ersätt den med DMSO lösning, pipettering försiktigt.</li>
		<li>Låt cellerna Inkubera i 24 h till 48 h vid 37 ° c i en CO2 -inkubator (5% Co2, fuktig atmosfär) före differentiering. Anmärkning: Typiskt, en 24 h DMSO behandling är tillräcklig över en majoritet av mänskliga ESC och iPSC linjer. Cellinjer med mycket långsam tillväxt (långa fördubblings tider) kan dra nytta av 48 h inkubering med DMSO. För en 48 h inkubation med DMSO, kan Media ersättas med färska stamceller media med 1%-2% DMSO efter den första 24 h av behandling.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. differentiering till primära bakterie skikt
Anmärkning: Följande beskriver metoder som tidigare visat sig vara effektiva i vårt laboratorium för PSC odlas i en enskiktslager på 6 bra tallrikar. Alla differentierings protokoll val bör användas efter DMSO behandling för att främja differentiering till önskade linjer. Ta bort DMSO-lösningen efter en 24-48 h-behandling och fortsätt differentieringen efter standardprotokoll.
<ol><li>
Endoderm differentiering (anpassad från Kroon et al.30)<ol>
<li>Pretreat celler med DMSO som beskrivits ovan för 2D-kulturer.</li>
		<li>Förbered Wnt3a och Activin ett lagerlösningar.</li>
		<li>Förbered dag 1 endodermala differentierings medier genom att tillsätta Wnt3a till en slutlig koncentration på 20 ng/ml och Activin a till en slutlig koncentration av 100 ng/ml till lämplig volym av föruppvärmd RPMI-media.</li>
		<li>Efter DMSO förbehandling, aspirera media från cellerna och ersätta den med dag 1 Media (t. ex., 2 mL per brunn av en 6 väl tallrik).</li>
		<li>Låt cellerna Inkubera i 24 timmar vid 37 ° c i en CO2 -inkubator (5% Co2, fuktig atmosfär).</li>
		<li>Förbered dag 2 och 3 endodermala differentiering Media genom att lägga till Activin a till en slutlig koncentration på 100 ng/ml till lämplig volym av föruppvärmd RPMI media.</li>
		<li>Aspirera media från cellerna och Ersätt det med dag 2-media (t. ex. 2 mL per brunn av en 6-brunn-platta).</li>
		<li>Låt cellerna Inkubera i 24 timmar vid 37 ° c i en CO2 -inkubator (5% Co2, fuktig atmosfär).</li>
		<li>Aspirera media från cellerna och Ersätt med dag 3-media (t. ex. 2 mL per brunn på en 6-brunn-platta).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mesoderm differentiering (anpassad från Zhang et al.31)<ol>
<li>Förbehandla cellerna med DMSO som beskrivits ovan för 2D-kulturer.</li>
		<li>Förbered Wnt3a och Activin ett lagerlösningar.</li>
		<li>Förbered mesodermala differentiering Media genom att tillsätta Wnt3a till en slutlig koncentration av 20 ng/mL och Activin A till en slutlig koncentration av 100 ng/mL till lämplig volym föruppvärmda avancerade RPMI media.</li>
		<li>Efter DMSO förbehandling, aspirera media från celler och ersätta med differentiering media (t. ex., 2 mL per brunn av en 6 väl tallrik).</li>
		<li>Låt cellerna Inkubera i 24 timmar vid 37 ° c i en CO2 -inkubator (5% Co2, fuktig atmosfär).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ectoderm differentiering (anpassad från Chambers et al.32)<ol>
<li>Förbehandla cellerna med DMSO som beskrivits ovan för 2D-kulturer.</li>
		<li>Förbered noggin och SB431542 lagerlösningar.</li>
		<li>Förbered ektodermal differentiering bas Media genom att lösa upp knockout serum Replacement (kosr) till en slutlig koncentration av 10% i knockout DMEM. Anmärkning: Förbered tillräckligt med basmedia för 3-4 dagars medie ändring.</li>
		<li>Förbered ektodermal differentiering Media genom att lägga noggin till en slutlig koncentration av 500 ng/ml och SB431542 till en slutlig koncentration av 10 μm till lämplig volym av föruppvärmd kosr/knockout DMEM.</li>
		<li>Efter DMSO förbehandling, aspirera media från celler och ersätta med differentiering media (t. ex., 2 mL per brunn av en 6 väl tallrik).</li>
		<li>Låt cellerna Inkubera i 3-4 dagar vid 37 ° c i en CO2 -inkubator (5% Co2, fuktig atmosfär) och ersätta Media dagligen med nyligen tillagda differentierings faktorer.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. differentiering av progenitor cell typer
Följande beskriver metoder som tidigare visat sig vara effektiva i vårt laboratorium för PSC odlas i en 2D-eller 3D-kulturer. Alla differentierings protokoll val bör användas efter DMSO behandling för att främja differentiering till önskade linjer. Ta bort DMSO-lösningen efter en 24-48 h-behandling och fortsätt differentieringen efter standardprotokoll.
<ol><li>Neurala stamceller differentiering (anpassad från Tchieu et al.33)<ol>
<li>Förbered 6 brunn plattor genom beläggning med en pluripotenta stamcells-kvalificerad reducerad tillväxtfaktor matris eller substrat, enligt tillverkarens anvisningar, för minst 1 h i en CO2 inkubator (5% Co2, fuktig atmosfär). Belagda plåtar kan fileras och förvaras vid 4 ° c i upp till 1 vecka.</li>
		<li>Platta PSCs som beskrivits ovan vid densiteten av 0.5-1 x 106 celler per brunn i stamcells medier som innehåller en berg hämmare.</li>
		<li>Pretreat celler med DMSO som beskrivits ovan för 2D-kulturer.</li>
		<li>Förbered små kemiska hämmare LDN193189, SB431542, och XAV939 lagerlösningar.</li>
		<li>Förbered dagar 1-3 neuroectoderm differentiering Media genom att komplettera Essential 6 media med 500 nM LDN193189, 10 μM SB431542, och 2 μM XAV939.</li>
		<li>Efter DMSO förbehandling, aspirera medierna och ersätta med dagar 1-3 neuroectoderm media (t. ex., 2 mL per brunn av en 6 väl tallrik). Ändra Media dagligen.</li>
		<li>Förbered dagar 4-12 neuroectoderm differentiering Media genom att komplettera Essential 6 media med 500 nM LDN193189 och 10 μM SB431542.</li>
		<li>På dag 4 av differentiering, aspirera medierna och ersätta med dagar 4-12 neurodectoderm media. Ändra mediet dagligen.</li>
		<li>Efter 12 dagar av differentiering, bör differentierade celler uttrycka lämpliga markörer av neurala stamceller (NPCs). NPC kan underhållas ytterligare i neurala medier som innehåller DMEM/F-12, 2% B-27, 1% N-2, och kompletteras med 10 μg/mL grundläggande fibroblast tillväxtfaktor (bFGF). Passage de NPCs när konfluenta med hjälp av en cell avlossning lösning, plätering NPCs på 0.5-1 x 106 celler per brunn.</li>
	</ol></li>
	<li>Oligodendrocyte progenitorceller celldifferentiering (anpassad från Douvaras och Fossati34)<ol>
<li>Platta PSCs som beskrivs ovan vid en densitet av 1 x 105 per brunn på belagda 6 väl plattor i stamcells medier som innehåller en sten hämmare.</li>
		<li>Pretreat celler med DMSO som beskrivits ovan för 2D-kulturer.</li>
		<li>Förbered SB431542, LDN193189, all-trans retinoinsyra Acid (RA), och utjämnade agonist (SAG) lagerlösningar.</li>
		<li>Förbered dag 0 – 8 differentiering Media genom att komplettera DMEM/F-12 med 10 μM SB431542, 250 nM LDN193189, och 100 nM RA.</li>
		<li>Efter DMSO förbehandling, inkubera celler med differentiering media för 8 dagar, byta Media dagligen med nyligen tillagda differentiering faktorer (t. ex., 2 mL per brunn av en 6 väl tallrik).</li>
		<li>På dag 8, ersätta media med DMEM/F-12 som innehåller 1x MEM icke-essentiella aminosyror (NEAA) lösning, 1X L-glutamin, 2-merkaptoetanol, penicillin/streptomycin, och 1x N-2 kompletteras 100 nM RA och 1 μM SAG. Ändra mediet dagligen.</li>
		<li>Efter 12 dagar av differentiering, bör differentierade celler uttrycka lämpliga markörer för oligodendrocyte progenitorceller (OPCs).</li>
	</ol></li>
	<li>Differentiering av endokrin stamceller (anpassad från Pagliuca et al.35)<ol>
<li>Seed PSCs vid 6 x 105 celler/ml i stamcells medier plus 10 μm rock inhibitor i 500 ml spinner kolvar placeras på en 9-position rör plattan inställd på rotationshastighet på 70 rpm i en 37 ° c inkubator, 5% Co2, och 100% luftfuktighet.</li>
		<li>Tillåt kluster att bosätta sig i botten av kolven, aspirera media, sedan förbehandla med 1%-2% DMSO.</li>
		<li>Förbered Activin A, Chir99021, KGF, Sant1, all-trans retinoinsyra Acid (RA), LDN193189, pdbu, XXI, Alk51, T3, och betacelluin lagerlösningar.</li>
		<li>Förbered differentierings basmedia baserat på formulering i tabell 3.</li>
		<li>Efter DMSO-förbehandling, aspirera media och Ersätt med S1-Media kompletterat med 100 ng/mL Activin A och 3 mM Chir99021 (t. ex. 500 mL per kolv). Låt inkubering för 24 h.</li>
		<li>På dag 2 ersätter du media med S1-Media kompletterat med 100 ng/mL Activin A. Tillåt inkubering i 2 dagar.</li>
		<li>På dag 4, Ersätt media med S2 Media kompletterat med 50 ng/mL KGF. Tillåt inkubering i 3 dagar, byta media efter de första 2 dagarna (dag 6).</li>
		<li>På dag 7 ersätter du media med S3-Media kompletterat med 50 ng/mL KGF, 0,25 mM Sant1, 2 mM RA och 200 nM LDN193189. Låt inkubering för 24 h.</li>
		<li>På dag 8, Ersätt media med S3-Media kompletterat med 50 ng/mL KGF, 0,25 mM Sant1, 2 mM RA, 200 nM LDN193189 och 500 nM PdBU. Låt inkubering för 24 h.</li>
		<li>På dag 9 ersätter du media med S3-Media kompletterat med 50 ng/mL KGF, 0,25 mM Sant1 och 100 nM RA. Tillåt inkubering i 5 dagar, ändra Media varje 2 dagar (dag 11 och 13).</li>
		<li>På dag 14 och 16, Ersätt media med S5 Media kompletterat med 0,25 mM Sant1, 100 nM RA, 1 mM XXI, 10 mM Alk5i II, 1 mM T3 och 20 ng/mL betacellulin (4 dagars total inkubation).</li>
		<li>På dag 18 och 20, Ersätt media med S5 Media kompletterat med 25 nM RA, 1 mM XXI, 10 mM Alk5i II, 1 mM T3 och 20 ng/mL betacellulin.</li>
	</ol></li>
</ol>5. immunocytokemisk validering av differentiering
Anmärkning: Följande metoder beskriver ett allmänt immunocytokemiskt protokoll som kan justeras efter behov. Primära antikroppar är de som tidigare validerats i vårt laboratorium. Andra tekniker för validering av differentiering kan också användas (t. ex. flödescytometri, qPCR, RNA-sekvensering, Western blotting, funktionella analyser, etc.).
<ol><li>
Immunolabeling celler
	<ol>
<li>För 3D-kulturer i suspension, platta hela cell kluster eller kluster dispergerade i encellig suspension på belagda plattor för 18-24 h före fixering.</li>
		<li>Aspirera media från anhängare celler och tvätta kort med PBS på RT på en shaker.</li>
		<li>För cellfixering, aspirera PBS och inkubera celler med 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i PBS för 20 min vid RT på shaker. Försiktighet: PFA-beståndet bör förberedas under ett draghuv på grund av dess toxicitet. Andas inte in och Använd inte korrekt personlig skyddsutrustning.</li>
		<li>Ta bort PFA och kassera i rätt kemikalie avfallsbehållare.</li>
		<li>Tvätta celler 3x med PBS i minst 5 min per tvätt vid RT på en shaker.</li>
		<li>För cell depolarisering och blockering, inkubera celler med 5% Donkey serum beredd i 0,3% Triton-x 100/PBS för 1 h vid RT på en shaker.</li>
		<li>Förbered primär antikropps lösning i samma lösning som används för permeabilisering/blockering.</li>
		<li>Inkubera i primär antikropps lösning över natten vid 4 ° c i shaker.</li>
		<li>Efter övernattning inkubering, tvätta celler 3x med PBS i minst 5 min per tvätt på RT på en shaker.</li>
		<li>Förbered sekundär antikropp lösning i permeabilization/blockerande lösning.</li>
		<li>Låt Inkubera i sekundär antikropps lösning för 1 h vid RT i en shaker.</li>
		<li>Aspirera sekundär antikropps lösning och tvätta celler 3x med PBS i minst 5 min per tvätt vid RT på en shaker.</li>
		<li>Inkubera celler med DAPI eller en annan prioriterad markör för lämplig inkubationstid och skölj i PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kvantifiering av bilder
	<ol>
<li>Förvärva minst tre bilder per tillstånd på ett fluorescerande Mikroskop och/eller med en hög innehålls screening plattform.</li>
		<li>Kvantifiera procent av positiva celler för varje markör genom att räkna det totala antalet antikroppar färgade celler och totala cell nummer (baserat på DAPI/Hoechst kärnor färgning) med hjälp av objektiva bildprogram (t. ex. ImageJ) eller en automatiserad screening plattform för Analyser.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Författarna har ingenting att avslöja.

Sammanfattnings, detta protokoll beskriver ett enkelt och billigt verktyg för att förbättra differentierings kapaciteten hos pluripotenta stamceller (PSCs) till alla primära bakterie skikt, olika typer av specialiserade stamceller, och även funktionella, mogna celltyper i in vitro- och in vivo-inställningar. Illustrerade är specifika differentiering protokoll som effektivt har reproducerats i vårt laboratorium och andra, men någon differentiering protokoll val kan användas efter DMSO behandling. Som framgår av tabell 1har ett antal laboratorier också visat en förbättring av PSC-differentiering efter övergående DMSO-behandling med olika paradigm för att generera olika andra typer av terminalceller. Dessutom, även om metoderna här beskriver användningen av mänskliga PSCs, den DMSO förbehandling kan utnyttjas över arter och har visat sig vara effektiva i mus, kanin, och primater PSCs.
Även om högre doser av DMSO är kända för att vara cytotoxiska, de låga doser som används i denna metod (1%-2%) för en övergående period resultera i minimal celldöd. Medan övergripande cell nummer omedelbart efter DMSO behandling kan minska på grund av DMSO främjande av cellcykelarrest i G1 fasen av cellcykeln, tidigare studier visar att cellerna kan nå samma nivå av sammanbrott som kontrollkulturer efter avlägsnande av DMSO3.
Den procentuella och varaktigheten av DMSO förbehandling bör optimeras per cell linje. Behandlingstiden ska justeras med hänsyn till cellernas cyklings-/fördubblingstid. Till exempel, mus PSCs har vanligtvis mycket kortare cykeltider på ca 15 h; Sålunda, DMSO behandling för 15 h för dessa celler är tillräcklig. Vissa laboratorier har också funnit att DMSO-behandlingen är fördelaktig när den fortsätter under differentierings protokollet eller vid lägre koncentrationer (se tabell 1). Det bör noteras att vissa PSC-linjer är mer tillägg till differentiering av specifika härstamningar. Till exempel, HUES6 celler har visat sig vara mindre tillåtande till differentiering och därmed hade markant förbättring med DMSO behandling (figur 2). Alternativt, HUES8 celler som används i figur 4 och figur 5 har visat sig ha en högre benägenhet mot endodermala differentiering; Sålunda, färre skillnader visades mellan kontroll och DMSO för differentiering i inledningsskedet mot definitiv endoderm. Icke desto mindre, förbättringen av DMSO förbehandling observeras i senare skeden av differentiering i denna cell linje (figur 4B). Den DMSO behandling är också mångsidig i att det är effektivt i både 2D-och 3D-cellkulturer system, det kan användas med olika typer av beläggningsmaterial på cellodling plattor, och det fungerar i olika typer av underhålls medium som främjar tillväxt och expansion av hPSCs (t. ex. mTeSR, E8, MEF conditioned media, etc).
Mer generellt tyder dessa resultat på att starttillståndet för pluripotenta stamceller har en stark inverkan på benägenheten för initial differentiering samt terminaldifferentiering till funktionella celltyper. Vi har tidigare visat att DMSO behandling funktioner genom RB i hpscs3,5. RB spelar en viktig roll för att främja Terminal differentiering, cellöverlevnad, och den genetiska stabiliteten i cellerna41,42,43,44, och det kan därför förklara de ihållande effekterna på celler skilt från DMSO-behandlade hPSCs. Inriktning dessa tidiga former av reglering kan placera hPSCs på en bättre bana för differentiering och i slutändan förbättra deras nytta för regenerativ medicin.

Användningen av pluripotenta stamceller har lett till många framsteg inom biomedicinsk forskning, inklusive områdena regenerativ medicin och stamcellsbaserade terapier, sjukdomsmodellering och läkemedels screening. Det har också lett till övergripande utsikter till mer översättningsbara forskning och personlig medicin. Tillkomsten av inducerad pluripotenta stamceller (iPSC) teknik för över 20 år sedan har gjort det möjligt för forskare att utveckla pluripotenta stamceller från somatiska vävnader och differentiera dem till funktionella celltyper för att studera en mängd olika patologier, inklusive kardiovaskulära, neurologiska och immunologiska sjukdomar. Även om betydande framsteg har gjorts i tekniken för differentiering av stamceller, kvarstår utmaningarna att effektivt differentiera mänskliga embryonala stamceller (hESCs) och iPSCs, vilket begränsar den utbredda användningen av stamcellsteknik i olika forskningsprogram. Inneboende variation mellan olika cellinjer och kloner fortsätter att utgöra hinder för att differentiera stamcellslinjer till önskad linages1. Dessutom är att härleda mogna, obotligt differentierade funktionella celler från hpscs en långtråkig och ineffektiv process över många linjer. I själva verket, celler åtskilda från hpscs ofta misslyckas med att obotligt differentiera till funktionella celler2. I ytterligare rörliga stamcells-baserade terapier att använda hos patienter, det finns ett behov av att förbättra och säkerställa effekten av celler som genereras från hPSCs.
Vårt labb har etablerat ett snabbt, Billigt verktyg för att avsevärt öka effektiviteten i att differentiera både iPSCs och ESCs i mogna celltyper. Vi fann att förbehandling av hiPSCs och hESCs med den vanliga reagens dimetylsulfoxid (DMSO) för 24 h till 48 h före riktad differentiering resulterar i en markant förbättring av stamcells differentiering kapacitet. Behandling med DMSO ökar andelen hipscs och hESCs i den tidiga G1 fasen av cellcykeln och aktiverar retinoblastom protein (RB)3, en kritisk regulator av cellproliferation, överlevnad, och differentiering4. I nyare arbete, har det visat sig att RB och dess familjemedlemmar krävs för Pro-differentiering effekterna av DMSO, så att övergående inaktivering av RB dämpar effekterna av DMSO, medan konstitutiv aktivering av RB på ett övergående sätt förbättrar DMSO s effekter5. Analogt med cellcykeln under embryonal utveckling, cellcykeln av ESCs och iPSCs kännetecknas av en förkortad G1 fas som främjar självförnyelse6,7,8. Denna förkortade G1 fas möjliggör mer obegränsad spridning men begränsar potentialen för differentiering4,9. Genom att främja tillväxt gripande i G1 och aktivera kontrollpunkt kontroller i cellcykeln av hESCs och iPSCs, DMSO behandling primtal celler för cell omvandling förändringar efter riktad differentiering.
Hittills har DMSO förbehandling visat sig förbättra differentierings kapaciteten till alla tre bakterie skikt i över 30 kontroll och sjukdomsspecifika mänskliga ESC och IPSC cellinjer3,5 samt differentiering av stamceller och andra cellinjer till en mängd andra mogna celltyper i efterföljande studier10,11,12,13,14,15,16, 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 (tabell 1). Vidare, DMSO behandling har visat sig vara effektivt för att förbättra differentiering av icke-mänskliga primära celler21,23 (t. ex., mus, primat, kanin), tyder på gemensamma mekanismer mellan arter. Slutligen, DMSO förbehandling har också utvidgats till genredigering teknik, med en särskild studie som visar att 24 h DMSO förbehandling av hESCs/iPSCs signifikant ökad förmåga klustrade regelbundet Interfördelade korta Palindromic repetitioner (CRISPR) /CRISPR-associated protein-9 (Cas9)-medierad redigering effektivitet av icke-kodning av DNA utan att införliva oavsiktliga mutationer29. Tillhandahålls här är en detaljerad metod för DMSO förbehandling av hESCs och iPSCs för tillämpningar i stamcellsbiologi och riktad differentiering.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:651px;" width="651">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">21985023</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">9-Position stir plate&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Chemglass</td>
			<td style="width:135px;">CLS-4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Accutase</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">11105-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Activin A</td>
			<td style="width:135px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>338-AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Advanced RPMI</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">12633012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alk5i II</td>
			<td style="width:135px;">Axxora</td>
			<td style="width:135px;">ALX-270-445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">all-trans retinoic acid&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-Brachyury</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">AF2085</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:215px;">anti-C-peptide</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:135px;">GN-ID4</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-FoxA2</td>
			<td style="width:135px;">Millipore</td>
			<td>07-633</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-Nkx2.2</td>
			<td>University of Iowa, Developmental Hybridoma Bank</td>
			<td>74.5A5</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-Nkx6.1</td>
			<td>University of Iowa, Developmental Hybridoma Bank;&#160;</td>
			<td style="width:135px;">F55A12-supernatant</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-Olig2</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:135px;">MABN50</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-Pax-6</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td style="width:135px;">901301</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-Pdx1</td>
			<td style="width:135px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>AF2419</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-SOX1&#160;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">AF3369</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-SOX17</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">AF1924</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:215px;">B-27 Supplement, minus Vitamin A</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">basic fibroblast growth factor</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>PHG0264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Betacellulin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>50932345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chir99021</td>
			<td style="width:135px;">Stemgent</td>
			<td>04-000-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">CMRL 1066</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">99-603-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:215px;">Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td style="width:135px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:135px;">AMQAF1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:135px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:135px;">G7528&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">DAPI</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:135px;">D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Disposable Spinner Flasks</td>
			<td style="width:135px;">Corning, VWR</td>
			<td style="width:135px;">89089-814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">DMEM/F-12</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">DMSO&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Essential 6 Media</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>A1516501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">FAF-BSA</td>
			<td style="width:135px;">Proliant&#160;</td>
			<td style="width:135px;">68700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">FGF7</td>
			<td style="width:135px;">PeproTech</td>
			<td style="width:135px;">100-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Geltrex</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>A1413202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">GlutaMAX&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Heparin&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:135px;">H3149&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Ultrasensitive Insulin ELISA</td>
			<td>ALPCO Diagnostics</td>
			<td>80-INSHUU-E01.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">ITS-X</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:135px;">51500056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KGF</td>
			<td style="width:135px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">AF-100-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Knockout DMEM</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>10829018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">KnockOut Serum Replacement</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-3,3&#8242;,5-Triiodothyronine (T3)</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:135px;">642245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">LDN193189</td>
			<td style="width:135px;">Stemgent</td>
			<td>04-0074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Matrigel Matrix</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MCDB-131&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Cellgro&#160;</td>
			<td style="width:135px;">15-100-CV&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">MEM NEAA</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:215px;">mTeSR 1</td>
			<td style="width:135px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:135px;">5850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">N2 Supplement</td>
			<td style="width:135px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:135px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:135px;">S3817&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Noggin Fc Chimera Protein</td>
			<td style="width:135px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">3344-NG-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PdBU</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:135px;">524390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Mediatech&#160;</td>
			<td style="width:135px;">30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">RPMI</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sant1</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">S4572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SB431542</td>
			<td style="width:135px;">Stemgent</td>
			<td>04-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Smoothened Agonist, SAG</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td>566660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">StemPro Accutase</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>A1110501&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">TrypLE</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">12604013</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:215px;">Ultra-Low Attachment Microplates</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td>3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Vitamin C</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">A4544&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Wnt3a</td>
			<td style="width:135px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>5036-WN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">XAV 939</td>
			<td style="width:135px;">Tocris</td>
			<td style="width:135px;">3748</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">XXI</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:135px;">565790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Y-27632</td>
			<td style="width:135px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:135px;">72302</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transient treatment of human pluripotent stem cells with dmso to promote differentiation

Trots den ökande användningen av pluripotenta stamceller kvarstår utmaningar i att effektivt differentiera embryonala och inducerade pluripotenta stamceller (ESCs och iPSCs) över olika linjer. Många differentiering protokoll har utvecklats, men variationer över cellinjer och låga differentieringar ge utmaningar i framgångsrikt genomföra dessa protokoll. Beskrivs här är ett enkelt och billigt sätt att öka differentieringen kapacitet PSCs. Det har tidigare visats att behandling av stamceller med en låg koncentration av dimetylsulfoxid (DMSO) avsevärt ökar benägenheten hos en mängd olika gemensamma kontaktpunkter för att differentiera till olika celltyper efter riktad differentiering. Denna teknik har nu visat sig vara effektiv över olika arter (t. ex. mus, primat, och mänskliga) i flera linjer, alltifrån nervceller och kortikala spheroids att släta muskelceller och hepatocyter. Den DMSO förbehandling förbättrar PSC differentiering genom att reglera cellcykeln och priming stamceller att vara mer lyhörd för differentiering signaler. Förutsatt att här är den detaljerade metoden för att använda detta enkla verktyg som en reproducerbar och allmänt tillämpliga medel för att mer effektivt differentiera PSCs till någon härstamning val.

Morfologi av DMSO behandlade iPSCs Mänskliga iPSCs härstammar från kontrollpersoner odlade antingen i en anhängare 2D enskiktslager eller i 3D-cell sfärer i fjädring. Ungefär 24 h efter initial plätering, celler behandlades med antingen 1% eller 2% DMSO för 24 h i underhålls mediet. Representativa brightfield-bilder efter DMSO-behandling visas i figur 1. I överensstämmelse med tidigare rapporter för iPSCs som upprätthålls i ett enskiktslager3resulterade DMSO-förbehandling i en övergående dosberoende minskning av tillväxttakten jämfört med icke-DMSO-behandlade celler (figur 1a). Denna minskade proliferation är förknippad med en ökning av cell-till-cell-kontakt, vilket är särskilt uttalad i 2% DMSO behandlade celler visar ökad bildning av mer högt grupperade cellkolonier. I andra celltyper, DMSO-inducerad G1 gripande har visat sig vara förknippade med ökat uttryck av proteiner inblandade i cell-cell interaktioner som stöder kontakt-hämning inducerad tillväxt gripande36. I iPSCs upprätthålls som 3D-cellsfärer, DMSO behandling ökat på samma sätt antalet cell sfärer (figur 1B). Dessutom resulterade DMSO behandling också i mindre variabla 3D-sfär storlekar, som tidigare har visat sig vara ett tecken på förbättrad differentiering kapacitet av cellerna37. Viktigt, varken 1% eller 2% DMSO resulterade i celltoxicitet, mätt med livskraft räknas (n = 3; 2D-kultur% Live = kontroll: 80 ± 1,3; 1% DMSO: 82 ± 3,7, 2%: 81 ± 2,7; 3D-kultur% Live = kontroll: 81 ± 4,3; 1% DMSO: 82 ± 6,7, 2%: 82 ± 2,7). Sammantaget är dessa resultat förenliga med uppfattningen att DMSO behandling förändrar cellcykeln och tillväxtmönster i odlade stamceller. Dessa effekter på tillväxthämning är reversibla när DMSO tas bort från mediet, som tidigare visat3.
DMSO behandling förbättrar differentiering av ESCs till de primära bakterie lagren HUES6 hESCs var seedade på belagda plattor för 24 h följt av behandling med 2% DMSO för 24 h i underhålls mediet. Cellerna differentierades sedan till de tre primära bakterie lagren efter de behandlings paradigm som visades i figur 2A30,31,32. Åtskilda celler fixades därefter och immunologiskt färgas för vänlighet markörer av varje respektive bakterie lagrar (SOX17 för endoderm, brachyury för mesoderm och SOX1 för ectoderm). Som visas i figur 2B, 24 h av förbehandling med 2% DMSO ökade andelen celler som uttrycker varje respektive bakterie skikt markör. Detta är förenligt med tidigare rapporter från vårt labb som visar ökad immunoreaktivitet, genuttryck, samt absoluta antalet differentierade celler mot alla köns skikt i stamceller behandlade med DMSO3,5. HUES6 är en hESC linje med mycket låg benägenhet för differentiering över alla linjer1, men DMSO behandling förbättrar avsevärt sin förmåga att differentiera över alla köns lagren.
DMSO behandling förbättrar differentiering till progenitorceller celltyper För att undersöka effekten av DMSO på differentiering till CNS progenitorcelltyper, mänskliga iPSCs differentierades till antingen neurala stamceller (NPCs) eller oligodendrocyte stamceller (OPCs). För att generera NPCs, var celler förbehandlade med 2% DMSO för 24 h i underhålls mediet följt av 12 dagars riktad differentiering33 (figur 3A). Som visas i figur 3B, 2% DMSO förbehandling ökat uttrycket av NPC markör PAX6 jämfört med kontroll. Med hjälp av ett annat tidigare validerat protokoll34 (figur 3C), differentierades iPSCs i 12 dagar till OPCs. Liknar NPCs, OPCs härrör från iPSCs förbehandlade med 2% DMSO för 24 h visade en ökning andel av celler som uttrycker OPC markörer OLIG2 (figur 3D).
En första DMSO behandling kvarstår för att förbättra differentiering till mogna celltyper För att undersöka effekten av DMSO på senare stadier av en differentiering protokoll, HUES8 hESCs förbehandlats för 24 h med 2% DMSO före differentiering till β-celler efter en 20 dagars riktade differentiering protokoll som beskrivs i figur 4a 35. HUES8 användes eftersom de tidigare har visat sig ha en högre benägenhet mot endodermala härstamning1,38. På det bestämda endoderm arrangera, de åtskilda cellerna uttrycker SOX17 och FOXA2, definitiva endoderm (DE) specifika markörer. Med ytterligare differentiering i bukspottskörteln föräldraparets (pp1) skede, differentierade celler Express PDX1 och FOXA2, markörer karakteristiska för bukspottskörteln progenitorceller. I dessa stadier av celldifferentiering i bukspottskörteln var effektivitetsvinsterna av induktion in i DE och därefter i PP1 höga för både kontroll och DMSO-behandlade hESCs differentierade i vart och ett av dessa stadier (figur 4B, steg 1 och 3). även om HUES8 cellinje har noterats för att ha ökad benägenhet att differentiera till endodermala härstamning, som differentiering induceras ytterligare i mer specialiserade celltyper i terminalen stadier DMSO-behandlade hESCs är mycket mer sannolikt att producera mogna bukspottskörteln endokrina celler. Effektivitetsvinsterna av att generera PDX1/NKX 6.1 + pankreasstamceller, Neurogenin 3 + endokrina celler, och NKX 6,1/C-peptid + SC-β celler var betydligt högre i DMSO-behandlade hESCs (figur 4B, steg 4 och 5). Dessa resultat är i linje med NPC och OPC differentiering visar att DMSO ökar differentierings möjligheter till progenitorcelltyper och visar också att effekten av DMSO är ihållande i att generera mer specialiserade celltyper. Detta är förenligt med tidigare arbete, där vi har visat att den initiala 24 h DMSO behandling ökar differentiering till Terminal celltyper över köns lagren, inklusive in i neuronala celler samt slå kardiomyocyter31,39 i cellinjer med höga eller dåliga benägenheter för differentiering3.
Första DMSO behandling förbättrar hESC-derived cell funktion efter in vivo transplantation Tidigare har vi visat effektiviteten av DMSO behandling för att förbättra differentieringen av hESCs till funktionella bukspottskörteln stamceller som senare visar en markant förbättring av insulinsekretion in vivo3. Använda tidigare publicerade protokoll3,30,40, HUES8 hESCs behandlades med 1% DMSO för 24 h, differentierade i bukspottskörteln stamceller, och transplanteras till immunobristfällig scid-beige möss för att bedöma funktion (t. ex. insulinsekretion som svar på en glukos utmaning eller KCl-stimulering) (figur 5a). Medan effektivitetsvinsterna av differentiering till FOXA2 + (~ 90%) och PDX1 + (~ 75%) pankreasstamceller var jämförbara mellan kontroll och DMSO-behandlade hESCs (figur 5B) för HUES8 hESC linjen, cellerna åtskilda från hESCs efter en 24 h 1% DMSO behandling hade förbättrat lyhördhet för glukos och KCL stimulering efter in vivo-transplantation. Förbättringar i funktionaliteten var uppenbara inom 2 veckor efter transplantation (figur 5C) och kvarstod upp till minst 16 veckor efter transplantation (figur 5D). Sammantaget, dessa resultat tyder på att DMSO förbehandling inte bara ökar differentierings effektiviteten till köns lagren, stamceller, och mer mogna celltyper, men också att det kvarstår att förbättra funktionaliteten hos de differentierade cellerna in vivo.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Differentierad cell typ</td>
			<td>Start cell typ</td>
			<td>% DMSO</td>
			<td>Längden på DMSO-behandling</td>
			<td>Längden på DMSO-behandling</td>
		</tr>
<tr>
<td>Leverceller</td>
			<td>Esc Hepatoma cellinjer Esc Esc Mesenkymala stamceller iPSCs Esc Esc Hepatoma cellinjer Esc</td>
			<td>1,0 1,0 1,0 0,5 0.1-2.0 1,0 1,0 0,5 1,0 0,6</td>
			<td>8 dagar Flera dagar 7 dagar 10-14 dagar 7-21 dagar 7 dagar 4 dagar 5 dagar 2-21 dagar Hela</td>
			<td>Basma et al., 2008 Kanebratt och Andersson, 2008 Hö et al., 2009 Duan et al., 2010 Alizadeh et al., 2014 Kondo et al., 2014 Szkolnicka et al., 2014 Czysz et al., 2015 Nikolaou et al., 2016 Vanhove et al., 2016</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primära bakterie skikt</td>
			<td>ESCs och iPSCs Embryon Embryon</td>
			<td>0.1-2.0 0,5 0.1-2.0</td>
			<td>24 timmar 24 timmar 24 timmar</td>
			<td>Chetty et al., 2013 Chetty et al., 2015 Li et al., 2018</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hjärtceller</td>
			<td>ESCs och iPSCs P19 celler ESCs och iPSCs Fetala mesenkymala stamceller</td>
			<td>0.1-2.0 1,0 1.0-2.0 0,8-1,0</td>
			<td>24 timmar 4 dagar 24-30 timmar 24 timmar</td>
			<td>Chetty et al., 2013 Choi et al., 2014 van den Berg et al., 2016 Deng et al., 2017</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bukspottskörteln celler</td>
			<td>ESCs och iPSCs Embryon</td>
			<td>0.1-2.0 0,5</td>
			<td>24 timmar 24 timmar</td>
			<td>Chetty et al., 2013 Chetty et al., 2015</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glatta muskelceller</td>
			<td>P19 celler</td>
			<td>1,0</td>
			<td>4 dagar</td>
			<td>Choi et al., 2014</td>
		</tr>
<tr>
<td>Endotelceller</td>
			<td>P19 celler</td>
			<td>1,0</td>
			<td>4 dagar</td>
			<td>Choi et al., 2014</td>
		</tr>
<tr>
<td>Enterocyter</td>
			<td>iPSCs</td>
			<td>0-1,6</td>
			<td>4 dagar</td>
			<td>Ogaki et al., 2015</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gut epitel</td>
			<td>iPSCs</td>
			<td>0-1,6</td>
			<td>4 dagar</td>
			<td>Ogaki et al., 2015</td>
		</tr>
<tr>
<td>Neurala celler</td>
			<td>Marmoset iPSC</td>
			<td>0.05-2.0</td>
			<td>24 timmar</td>
			<td>Qiu et al., 2015</td>
		</tr>
<tr>
<td>Neutrofiler</td>
			<td>Leukemi cell linje</td>
			<td>1,25</td>
			<td>6-8 dagar</td>
			<td>Teimourian och Moghanloo, 2016</td>
		</tr>
<tr>
<td>Skelett-Myotubes</td>
			<td>iPSCs</td>
			<td>1,5</td>
			<td>24 timmar</td>
			<td>Swartz et al., 2016</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kortikala Organoid</td>
			<td>hiPSCs</td>
			<td>1,0</td>
			<td>24 timmar</td>
			<td>Yoon et al., 2018</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Sammanfattning av tidigare publicerat arbete som visar de positiva effekterna av DMSO-behandling vid differentiering.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>S1</td>
			<td>S2</td>
			<td>S3</td>
			<td>S5</td>
		</tr>
<tr>
<td>MCDB131 (L)</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glukos (g)</td>
			<td>0,44</td>
			<td>0,44</td>
			<td>0,44</td>
			<td>3,6</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nahco3 p.a. (g)</td>
			<td>2,46</td>
			<td>1,23</td>
			<td>1,23</td>
			<td>1,754</td>
		</tr>
<tr>
<td>FAF-BSA (g)</td>
			<td>20</td>
			<td>20</td>
			<td>20</td>
			<td>20</td>
		</tr>
<tr>
<td>ITS-X (mL)</td>
			<td>0,02</td>
			<td>0,02</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glutamax (mL)</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>Vitamin C (mg)</td>
			<td>44</td>
			<td>44</td>
			<td>44</td>
			<td>44</td>
		</tr>
<tr>
<td>Heparin (mg)</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>P/S (mL)</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2: komponenter i endokrina progenitorceller celldifferentiering bas medier.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59833/59833fig1.jpg"> Figur 1 : DMSO behandling förändrar tillväxten av hPSCs. (A) representativa brightfield bilder av hipscs klädd i en enskiktslager efter att ha fått någon behandling (kontroll) eller behandling med 1% eller 2% DMSO för 24 h. DMSO främjar en övergående dosberoende tillväxthämning av iPSCs. (B) representativa brightfield bilder av hipscs pläterade på låg-fästen plattor för att möjliggöra 3D sfär formation efter att ha fått någon behandling (kontroll) eller behandling med 1% eller 2% DMSO för 24 h. DMSO behandling resulterar i mindre varierande 3D sfär formation jämfört med kontroll. Scale bar = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59833/59833fig1large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59833/59833fig2.jpg"> Figur 2 : DMSO behandling förbättrar differentiering av hPSCs till primära bakterie skikt. (A) schematiska differentierings protokoll som används för att generera de tre primära bakterie lagren. (B) representativa bilder av differentierade HUES6 hESCs immunolabeled för SOX17 (endoderm), brachyury (mesoderm) och SOX1 (ectoderm). Förbehandling med 2% DMSO för 24 h ökade differentierings effektiviteten i alla tre bakterie lagren. Procentsatser av celler som differentierar till SOX17 + endodermal, Brachyury (Brachy) + mesodermal, eller SOX1 + ektodermal celler efter riktad differentiering i varje bakterie skikt av kontroll och DMSO-behandlade hESCs noteras med SEM av tre biologiska replikat . Ej ihopparad t-test: endoderm p = 0,0003; mesoderm p = 0,047; ektoderm p = 0,015. Scale bar = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59833/59833fig2large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59833/59833fig3.jpg"> Figur 3 : DMSO behandling förbättrar differentiering till neurala progenitorceller celltyper. (A) schematiskt differentierings protokoll som används för att generera neurala progenitorceller (NPCs). Brepresentativa bilder av humana iPSCs som differentierats till NPCs immunolabeled för Pax6. 24 h av förbehandling med 2% DMSO ökade antalet PAX6 positiva celler. Procentandelar av celler som differentierar till Pax6 + NPCs efter riktad differentiering av kontroll och DMSO-behandlade humana iPSCs noteras med SEM av tre biologiska replikat. Ej ihopparad t-test: p = 0,0225. Skalstapel = 200 μm. (C) schematiskt differentierings protokoll som används för att generera oligodendrocyte progenitorceller (OPCs). Drepresentativa bilder av humana iPSCs som differentierats till OPCs immunolabeled för OPC-markörer Olig2. 24 h av förbehandling med 2% DMSO ökade uttrycket av båda OPC markörer jämfört med kontroll. Procentsatser av celler som differentierar till Olig2 + OPCs efter riktad differentiering av kontroll och DMSO-behandlade humana iPSCs noteras med SEM av fyra biologiska replikat. Ej ihopparad t-test: p = 0,0466. Scale bar = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59833/59833fig3large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59833/59833fig4.jpg"> Figur 4 : DMSO behandling förbättrar Terminal differentiering potential hPSCs. (A) Schematisk av en ~ 20 dag riktad differentiering av HUES8 hESCs till obotligt differentierade bukspottskörteln endokrina celler. B) immunofärgning av de angivna markörerna vid varje differentierings skede efter riktad differentiering av obehandlade kontrollceller och celler som förbehandlats med 2% DMSO under 24 timmar. Den initiala DMSO behandlingen kvarstår att öka differentieringen till Terminal endokrina celltyper i de senare stadierna av riktad differentiering. Procentsatser av celler som skiljer sig i de angivna markörer i varje skede av differentiering efter riktad differentiering av kontroll och DMSO-behandlade hESCs noteras med SEM av två till fyra biologiska replikat. Scale bar = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59833/59833fig4large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59833/59833fig5.jpg"> Figur 5 : Initiala DMSO behandling av hPSCs förbättrar glukos lyhördhet efter transplantation av pankreasstamceller in vivo. (A) schematiskt riktad differentiering (~ 15 dagar) av HUES8 hESCs i bukspottskörteln STAMCELLER (pp2) efter ingen behandling (kontroll) eller en 24 h 1% DMSO behandling och efterföljande transplantation (5 000 000 celler) till immunobristfällig SCID-beige möss. B) procentandel celler som differentierar till PDX1 + och FOXA2 + pankreasstamceller efter in vitro-riktad differentiering av kontroll och DMSO-behandlade hESCs omedelbart före transplantation (n = 1). (C) medelvärdet av Elisa-mätningar av humant insulin från serum från möss efter en låg (2,5 mm) eller hög (15 mm) glukos utmaning eller kaliumklorid (KCL) stimulering vid (c) 2 veckor och (D) 16 veckor efter transplantation av bukspottskörteln stamceller åtskilda från kontroll och DMSO-behandlade hESCs (felstaplar = SEM; n = 3 vid 2 veckor och 16 veckor för kontroll; n = 2 vid 2 veckor och 16 veckor för DMSO). Tvåvägsanova: p = 0,0051 för kontroll vs. DMSO vid 2 veckor; p = 0,0116 för kontroll vs. DMSO vid 16 veckor. De möss som studeras vid olika tidpunkter är olika. Resultaten är anpassade från Chetty et al.3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59833/59833fig5large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation at JoVE.com

Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation

Att generera differentierade celltyper från humana pluripotenta stamceller (hPSCs) har ett stort terapeutiskt löfte men är fortfarande utmanande. PSCs uppvisar ofta en inneboende oförmåga att differentiera även när stimuleras med en ordentlig uppsättning av signaler. Beskrivs här är ett enkelt verktyg för att förbättra Multilinjärt differentiering mellan olika PSC-linjer.

Övergående behandling av humana pluripotenta stamceller med DMSO för att främja differentiering

Despite the growing use of pluripotent stem cells (PSCs), challenges in efficiently differentiating embryonic and induced pluripotent stem cells (ESCs and ...

Det är en enkel behandling som kan tillämpas på alla stamcellslinje eller differentieringsprotokoll till prime celler för differentiering. Allt man behöver göra är att lägga DMSO på 1-2%i cellodlingen underhållsmedium. Den största fördelen med denna teknik är det tillåter en att avsevärt öka differentiering potential pluripotenta stamceller i någon härstamning val genom priming celler för differentiering.DMSO behandling ökar chansen att cellerna kommer att skilja från patient-härledda iPSCs, så att de kan användas för cellersättningsterapi, sjukdomsmodellering, och drogscreening. Det kan ge upphov till tidig debut av reglering som kontrollerar sub-spridning, differentiering, och specifikation under embryonal utveckling. Vi har visat att DMSO behandlingen förbättrar differentiering i nästan 50 mänskliga embryonala och inducerad pluripotenta stamcellslinjer.Medan andra laboratorier har visat att det är fördelaktigt för stamceller från andra arter, såsom mus och primat. En dag före instÃ¤ngdet av differentiering, tillsätter DMSO vid en koncentration av 1 eller 2%i 24 timmar i ditt typiska underhållsmedium. 24 timmar efter DMSO-behandlingen, byt medium och fortsätt med ditt vanliga differentieringsprotokoll.Odla celler enligt manuskriptriktningar. När cellerna når en lämplig sammanflytande, dissociate dem och förbereda en enda cell suspension. Räkna de levande cellerna med en hemocytometer eller automatisk cellräknare, med hjälp av en viabilitetsmarkör som trypanblått.För att uppnå 80-90%konfluency inom 24-timmars DMSO förbehandling, platta cellerna på en bestruken sex-väl platta vid en densitet av 500, 000 till 1 miljon celler per brunn. Inkubera cellerna i 24 timmar vid 37 grader Celsius i en koldioxidinkubator. Sedan aspirera media och ersätta den med en 1-2%DMSO lösning.Låt cellerna inkubera i 24-28 timmar före differentiering. Om inkubering i 48 timmar, byt ut media efter 24 timmar med färsk DMSO-lösning. För att uppnå 3D-odlingsdifferentiering, växa och samla in cellerna i en cell suspension.Räkna de levande cellerna och platta dem i en obestruken, lågfaststävlad sex-brunnsplatta i stamcellsmedia med ROCK-hämmare. Typiskt, 3D mänskliga pluripotenta stamceller sfärer kommer att bildas inom 24 timmar. Låt cellerna inkubera i 24 timmar vid 37 grader Celsius i en koldioxidinkubator.Förbered 1-2%DMSO i förvrev stamcellsmedia enligt manuskriptriktningar. För att byta ut media efter inkubationen lutar du plattan till 30 graders till 45 graders vinkel och låter cellsfärer lägga sig i brunnens botten. Aspirera media från cellerna och försiktigt åter upphäva dem i DMSO lösningen.Låt cellerna inkubera i 24-48 timmar vid 37 grader Celsius i en koldioxidinkubator. Pre-behandla celler med DMSO som beskrivs för 2D kulturer, och förbereda noggin och SB431542 stamlösningar. Förbered tillräckligt 10%knockout serum ersättning, eller KOSR, i knockout DMEM för tre till fyra dagar av media förändring.Förbered ectodermal differentiering media genom att lägga till noggin och SB431542 till förvörd KOSR knockout DMEM som beskrivs i manuskriptet. Efter DMSO förbehandling, aspirera media från celler och lägga till två milliliter av differentiering media till varje brunn. Låt cellerna inkubera i tre till fyra dagar vid 37 grader Celsius i en koldioxidinkubator, som dagligen ersätter media med färska differentieringsfaktorer.DMSO förbehandling resulterar i en övergående och dosberoende minskning av celltillväxthastigheten jämfört med icke-behandlade celler. Denna minskning spridning är associerad med en ökning av cell-till-cell kontakt, som är särskilt uttalad i de 2%DMSO-behandlade cellerna. När cellerna är fasta och färgas för prototypiska markörer av varje groddskikt, kan man se att 2%DMSO förbehandling resulterar i ökad andel differentierade könslagerceller.Till exempel var SOX17 färgas för att visualisera endoderm celler. För att undersöka effekten av DMSO på differentiering till centrala nervsystemet progenitor celltyper, människa-inducerad pluripotenta stamceller skulle kunna differentieras till antingen neurala progenitor celler eller oligodendrocyte progenitor celler. Jämfört med kontrollceller, 2%DMSO förbehandling ökar uttrycket av neurala progenitor cellmarkör Pax6.På samma sätt ökar förbehandlingen andelen celler som uttrycker oligodendrocytecellmarkör Olig2. Vidare förbättrar inledande DMSO behandling mänskliga embryonala stamceller-härledda cell funktion efter in-vivo transplantation. När differentierade bukspottskörteln progenitor celler transplanteras till immunficient möss, deras funktionalitet kan testas som svar på en glukos utmaning eller KCl stimulering.Förbättringar i cellen funktionalitet framgår från två veckor till 16 veckor post-transplantation. Det viktigaste övervägandet att ta hänsyn till är cykling eller fördubbling tid av dina stamceller. Längden på DMSO behandling bör vara samma som cykling tid för cellerna.Efter den inledande DMSO-behandlingen kan man förstå hur cellproliferation och cellcykeln regleras i stamceller, eftersom behandlingen bidrar till att främja tillväxtstillestånd i G1-fasen av cellcykeln. De differentierade cellerna kan användas för att förstå sjukdomsrelaterade mekanismer, för co-culturing med andra celltyper, i tumorigenicity analyser, och i funktionella analyser eller transplantationsstudier för att avgöra om de differentierade cellerna kan rädda en sjukdom fenotyp.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Stencil Micropatterning of Human Pluripotent Stem Cells for Probing Spatial Organization of Differentiation Fates

Stencil Micropatterning av mänskliga pluripotenta stamceller för undersökning fysisk planering av differentiering Fates

Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Storskalig produktion av Cardiomyocytes från Human pluripotenta stamceller med hjälp av en mycket reproducerbar liten molekyl baserad differentiering protokoll

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays

Snabb neuronal differentiering av inducerade pluripotenta stamceller för att mäta nätverksaktivitet på Micro-elektrod arrayer

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Regisserad differentiering av primitiv och slutgiltig hematopoetiska progenitorceller från mänskliga pluripotenta stamceller

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Effektiv Differentiering av pluripotenta stamceller till NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; Pankreasstamfäder

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In vitro-differentiering av mänskliga pluripotenta stamceller till trophoblastic celler

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Snabb, regisserad differentiering av Retinal Pigment epitelial celler från mänskliga embryonala eller inducerade pluripotenta stamceller

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a Na&#239;ve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency

Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a NaÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¯ve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency

Kemiska återgång av konventionella mänskliga pluripotenta stamceller till en naiv-liknande tillstånd med förbättrad Multilinjärt differentiering potens

Na&#239;ve human pluripotent stem cells (N-hPSC) with improved functionality may have a wide impact in regenerative medicine. The goal of this protocol is ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Effektiv och skalbar riktad differentiering av kliniskt kompatibel korneal limbala epitelial stamceller från mänskliga pluripotenta stamceller

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...