Name: transient treatment of human pluripotent stem cells with dmso to promote differentiation
Uploaded: 2019-07-17T14:30:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation at JoVE.com

Bu çalışma Stanford Üniversitesi Tıp Fakültesi 'nden hibe ve S. C 'ye verilen bir Siebel bursu ile destekleniyordu.

1. kök hücre Bakımı
Not: Aşağıda açıklanan hücre bakım protokolü, yapışan bir monolayer içinde tutulan pluipotent kök hücreleri (PSC 'ler) için geçerlidir. DMSO tedavisinden önce kullanılan medya, diğer reaktifler ve hücre kültürü plakaları gerektiğinde ayarlanabilir. Bu yazıda tüm aşağıdaki protokoller için, hücreler biyolojik güvenlik dolabı altında işlenmelidir.
<ol><li>Kat steril, 6 iyi, doku kültürü-bir pluripotent kök hücre nitelikli matris veya substrat üretici talimatlarına göre hazırlanan ve en az 1 h için inkük bir CO2 kuluçkucu (5% Co2, nemli atmosfer) ile işlenmiş plakalar. Kaplı plakalar film sarılmış ve bir hafta kadar 4 °C saklanır olabilir.</li>
	<li>37 °C ' lik su küvetinde ağakopa ayrılmış PSC 'leri çözün. Biyolojik emniyet kabinine giriş öncesinde etanol ile sterilize şişe, sonra hemen prewarmed kök hücre medya 5-10 hacimleri içeren steril konik tüp pipetleme ile hücreleri transfer.</li>
	<li>300 x g 'de hücreleri Oda SıCAKLıĞıNDA (RT) 5 dakika santrifüjler.</li>
	<li>Medyayı aspirate ve 10 μM kaya inhibitörü ile tamamlayıcı olarak 1 ml 'lik kök hücre medyasında hücre pelsini hafifçe pelletini, Y-27632 gibi.</li>
	<li>Tabandan kültür matrisini aspirate ve hücreleri istenilen yoğunlukta tohum, genellikle 0.5-1 x 106 hücre iyi başına en az 2 ml kök hücre medyasında da. Not: Kaplama yoğunluğu farklı hücre hatları ve klonlar arasında değişebilir ve buna göre optimize edilmelidir.</li>
	<li>Her gün prewarmed kök hücre medyasını değiştirerek hücreleri koruyun. Hücreleri kabaca% 70-80% konflukans veya hücre kolonileri temas yapmaya başlar Böl.</li>
	<li>Hücreleri bölmek için, medyayı Aspire ve steril PBS ile bir kez hücreleri yıkayın. 37 °c ' de 5-10 dakika için iyi başına 1 ml ayrışma enzim çözeltisi ile hücreleri kuluçla.</li>
	<li>Prewarmed kök hücre medya ile hücreleri yıkayın ve yeniden pelletini ve 5-10 hacim kök hücreli medya ile steril konik tüp transfer. Hücreleri plaka için 1.3-1.7 adımları izleyin.</li>
</ol>2. DMSO Pretreatment
Not: Farklılaşma öncesinde DMSO ön için hücreler kaplama, başlangıç kaplama hücresi yoğunluğu kök hücre hattının tipik büyüme oranı yanı sıra kullanılan farklılaşma protokolü dikkate ile optimize edilmelidir. Gerektiğinde geleneksel işaretçileri kullanarak pluripotency doğrulayın. Ayrım yapmadan önce ilk çözülme işleminden sonra hücreler en az 1x-2x olarak geçmelidir.
<ol><li>
2D kültür farklılaşma
	<ol>
<li>Hücreler uygun bir konflukans ulaştığında, kaplı plakaları hazırlayın, hücreleri ayırmak ve yukarıda açıklandığı gibi tek hücreli bir süspansiyon hazırlayın.</li>
		<li>Tripan mavi veya başka bir canlılığı Marker dahil olmak üzere bir hemasitometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak canlı hücreleri saymak.</li>
		<li>Hücreleri 10 μM kaya inhibitörü ile kök hücre medyasında iyi başına 0,5-1 x 106 hücreli bir kaplanmış 6 kuyu plakasına yerleştirin. Not: Laboratuvarımızda test edilen hücre hatları için, bu yoğunluklar genellikle 24 h DMSO ön tedavisi içinde% 80-90% confluent hücresi ile sonuçlandı.</li>
		<li>Bir CO2 kuluçk (5% Co2, nemli atmosfer) içinde 37 °c ' de 24 h için inküyasyon hücrelerin izin verin.</li>
		<li>Prewarmed kök hücre medyasında% 1-2% DMSO hazırlayın (örn. 100 μL DMSO 'da 10 mL medya = 1% DMSO çözümü veya 200 μL DMSO 'da 10 mL medya = 2% DMSO çözümü).</li>
		<li>24 saat kuluçk sonra, hücrelerden medya Aspire ve DMSO çözümü ile değiştirin.</li>
		<li>Bir CO2 kuluçk (5% Co2, nemli atmosfer) içinde 37 °c ' de 24 saat 48 h için inkübasyon hücrelerin farklılaşma öncesinde izin verin. Not: Genellikle, 24 saat DMSO tedavisi insan ESC ve IPSC hatları çoğunluğu boyunca yeterlidir. Çok yavaş büyüme oranlarına sahip hücre hatları (uzun ikiye katlama süreleri) DMSO ile 48 h inkübasyon yararlanabilir. DMSO ile 48 h inkübasyon için, medya ilk 24 h tedavisinden sonra% 1-2% DMSO ile taze kök hücre medyası ile değiştirilebilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
3D kültür farklılaşma:
	<ol>
<li>Hücreleri uygun bir konfluency ulaştığında, DISSOCIATE ve yukarıda açıklandığı gibi bir hücre süspansiyon hücreleri toplamak.</li>
		<li>Bir hemasitometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak canlı hücreleri saymak bir canlılığı Marker dahil.</li>
		<li>10 μM kaya inhibitörü ile kök hücre medyasında iyi başına 0.5-1 x 106 hücrelerde kaplanmamış, düşük ataşman 6 kuyu plakasının hücrelerini plaka. Not: Laboratuvarımızda test edilen hücre hatları için, bu yoğunluklar genellikle hücrelerin ayarlanması 24 h içinde 3D hPSC küre oluşumu sonuçlandı.</li>
		<li>Bir CO2 kuluçk (5% Co2, nemli atmosfer) içinde 37 °c ' de 24 h için inküyasyon hücrelerin izin verin.</li>
		<li>Prewarmed kök hücre medyasında% 1-2% DMSO hazırlayın (örn. 100 μL, 10 mL medya = 1% DMSO çözümü veya 200 μL DMSO 'da 10 mL medya =% 2 DMSO çözeltisi içinde).</li>
		<li>Standart prosedürler aşağıdaki ortam değiştirin (örneğin, 30 °-45 ° açı plaka eğim hücre küreler iyi altında yerleşmek için izin vermek için; hücreleri steril bir konik tüpe aktarın ve hücre kürlerinin tüpün alt kısmına yerleşmesine izin verin; veya hafifçe hücreleri toplamak i n süspansiyonu, 5 veya 10 mL 'Lik pipet kullanılarak steril konik tüpte ve 300 x g 'de Santrifüjlü hücrelerde 5 dk. RT).</li>
		<li>Medyayı hücrelerden aspirate ve DMSO solüsyonu ile değiştirin, yavaşça pipetleme yapın.</li>
		<li>Bir CO2 kuluçk (5% Co2, nemli atmosfer) içinde 37 °c ' de 24 saat 48 h için inkübasyon hücrelerin farklılaşma öncesinde izin verin. Not: Genellikle, 24 saat DMSO tedavisi insan ESC ve IPSC hatları çoğunluğu boyunca yeterlidir. Çok yavaş büyüme oranlarına sahip hücre hatları (uzun ikiye katlama süreleri) DMSO ile 48 h inkübasyon yararlanabilir. DMSO ile 48 h inkübasyon için, medya ilk 24 h tedavisinden sonra% 1-2% DMSO ile taze kök hücre medyası ile değiştirilebilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Primer germ katmanlarına farklılaşma
Not: Aşağıdaki yöntemler, daha önce 6 kuyu plakalı bir tek tabakalı içinde yetiştirilen PSC 'ler için laboratuvarımızda etkili olması için gösterilen yöntemleri açıklar. Tercih edilen herhangi bir farklılaşma protokolü, DMSO tedavisinden sonra istenilen çağların farklılaşımını teşvik etmek için kullanılmalıdır. 24-48 h tedavisinden sonra DMSO çözümünü kaldırın ve standart protokollerin ardından farklılaşma ile devam edin.
<ol><li>
Endoderm farklılaşma (Kroon ve ark.30' dan uyarlanmıştır)<ol>
<li>2B kültürler için yukarıda açıklandığı gibi, hücreleri DMSO ile ön tedavi edin.</li>
		<li>Hazırlama Wnt3a ve Activin bir stok çözümleri.</li>
		<li>Hazırlamak gün 1 son konsantrasyon Wnt3a ekleyerek endodermal farklılaşma medya 20 ng/mL ve Activin A son konsantrasyon 100 ng/mL prewarmed RPMı medya uygun hacmine.</li>
		<li>Dmso pretreatment sonra, hücrelerden medya Aspire ve gün 1 medya ile değiştirin (örneğin, bir 6 kuyu plakası başına 2 ml).</li>
		<li>Bir CO2 kuluçk (5% Co2, nemli atmosfer) içinde 37 °c ' de 24 h için inküyasyon hücrelerin izin verin.</li>
		<li>Hazırlamak gün 2 ve 3 prewarmed RPMı medya uygun hacmine 100 ng/mL son konsantrasyona Activin A ekleyerek endodermal farklılaşma medya.</li>
		<li>Hücrelerden medya aspirate ve gün 2 medya ile değiştirin (örneğin, bir 6 kuyu plakası başına 2 mL).</li>
		<li>Bir CO2 kuluçk (5% Co2, nemli atmosfer) içinde 37 °c ' de 24 h için inküyasyon hücrelerin izin verin.</li>
		<li>Hücrelerden medya aspirate ve gün 3 medya ile değiştirin (örneğin, 2 mL iyi bir 6 kuyu plakası başına).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mesoderm farklılaşma (Zhang ve al.31' den uyarlanmıştır)<ol>
<li>2B kültürler için yukarıda açıklandığı gibi hücreleri DMSO ile ön tedavi edin.</li>
		<li>Hazırlama Wnt3a ve Activin bir stok çözümleri.</li>
		<li>20 ng/ml ve activin a son konsantrasyon Wnt3a ekleyerek Mezodermal farklılaşma medya hazırlamak 100 ng/ml prewarmed gelişmiş RPMI medya uygun hacmine.</li>
		<li>Dmso pretreatment sonra, hücrelerden medya Aspire ve farklılaşma medyaları ile değiştirin (örn., 6 kuyu plakası başına 2 ml).</li>
		<li>Bir CO2 kuluçk (5% Co2, nemli atmosfer) içinde 37 °c ' de 24 h için inküyasyon hücrelerin izin verin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ectoderm farklılaşma (Chambers ve al.32tarafından uyarlanmıştır)<ol>
<li>2B kültürler için yukarıda açıklandığı gibi hücreleri DMSO ile ön tedavi edin.</li>
		<li>Noggin ve SB431542 stok çözümlerini hazırlayın.</li>
		<li>Ektodermal farklılaşma baz medyasını nakavt serum replasmanı (KOSR) son konsantrasyon% 10 oranında nakavt DMEM ile hazırlayın. Not: 3-4 gün boyunca medya değişikliği için yeterli temel ortam hazırlayın.</li>
		<li>500 ng/ml ve SB431542 son konsantrasyonuna noggin ekleyerek ektodermal farklılaşma medyasını hazırlayın 10 μM son konsantrasyon prewarmed kosr/Knockout dmem uygun hacmine.</li>
		<li>Dmso pretreatment sonra, hücrelerden medya Aspire ve farklılaşma medyaları ile değiştirin (örn., 6 kuyu plakası başına 2 ml).</li>
		<li>Hücrelerin 3-4 gün boyunca 37 °C ' de CO2 kuluçko (% 5 Co2, nemli atmosfer) içinde inkübasyon yapmasına izin verin, yeni eklenen farklılaşma faktörleri ile her gün medyayı değiştirin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. progenitor hücre türlerine farklılaşma
Aşağıda, 2D veya 3D kültürlerde yetiştirilen PSC 'ler için laboratuvarımızda etkili olması için önceden gösterilen yöntemler açıklanmaktadır. Tercih edilen herhangi bir farklılaşma protokolü, DMSO tedavisinden sonra istenilen çağların farklılaşımını teşvik etmek için kullanılmalıdır. 24-48 h tedavisinden sonra DMSO çözümünü kaldırın ve standart protokollerin ardından farklılaşma ile devam edin.
<ol><li>Nöral progenitör hücre farklılaşma (Tchieu ve al.33tarafından uyarlanmıştır)<ol>
<li>Hazırlamak 6 iyi plaka ile kaplama bir pluripotent kök hücre nitelikli azaltılmış büyüme faktörü matris veya substrat, üretici talimatları başına, için en az 1 h bir CO2 kuluçk (5% Co2, nemli atmosfer). Kaplı plakalar film sarılmış ve 1 hafta kadar 4 °C saklanır olabilir.</li>
		<li>Plakalı PSC 'ler, kaya inhibitörü içeren kök hücre medyasında da 0.5-1 x 106 hücre yoğunluğunda yukarıda açıklandığı gibi.</li>
		<li>2B kültürler için yukarıda açıklandığı gibi, hücreleri DMSO ile ön tedavi edin.</li>
		<li>Küçük kimyasal inhibitörleri LDN193189, SB431542 ve XAV939 stok çözümlerini hazırlayın.</li>
		<li>Hazırlamak gün 1-3 neuroectoderm farklılaşma medya ek tarafından Essential 6 medya ile 500 nM LDN193189, 10 μM SB431542, ve 2 μM XAV939.</li>
		<li>Dmso pretreatment sonra, medya Aspire ve gün 1-3 neuroectoderm medya ile yerine (örneğin, bir 6 kuyu plakası başına 2 ml). Günlük medya değiştirin.</li>
		<li>Hazırlamak gün 4-12 LDN193189 ve 10 μM SB431542 500 ile Essential 6 medya takviyesi tarafından neuroectoderm farklılaşma medya.</li>
		<li>4. gün farklılaşma, medya Aspire ve gün 4-12 neurodectoderm medya ile değiştirin. Medyayı günlük olarak değiştirin.</li>
		<li>Farklılaşma 12 gün sonra, farklılaşmış hücreler nöral progenitör hücrelerin (NPCs) uygun belirteçleri ifade etmelidir. NPCs daha fazla DMEM/F-12, 2% B-1/27% N-2 içeren nöral medyada korunabilir ve 10 μg/mL temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) ile desteklenmektedir. Geçiş NPCs bir hücre dekolmanı çözümü kullanarak confluent, 0,5-1 x 106 hücre Iyi başına NPCs kaplama.</li>
	</ol></li>
	<li>Oligodendrocyte progenitör hücre farklılaşma (Douvaras ve Fossati34tarafından uyarlanmış)<ol>
<li>Bir ROCK inhibitörü içeren kök hücre medyasında PSCs 'nin yukarıda açıklandığı şekilde, 1 x 105 ' in üzerinde iyi kaplı 6 kuyu plakasının yoğunluğunda plakasını yapın.</li>
		<li>2B kültürler için yukarıda açıklandığı gibi, hücreleri DMSO ile ön tedavi edin.</li>
		<li>SB431542, LDN193189, All-Trans retinoik asit (RA) ve düzgünleştirilmiş agonist (SAG) stok çözümlerini hazırlayın.</li>
		<li>10 μM SB431542, 250 nM LDN193189 ve 100 nM RA ile DMEM/F-12 takviyesi yaparak gün 0 – 8 farklılaşma ortamı hazırlayın.</li>
		<li>DMSO pretreatment sonrası, 8 gün boyunca farklılaşma medyası ile hücreleri kuluçat, taze eklenen farklılaşma faktörleri ile günlük medya değiştirme (örn., 6 iyi plaka başına 2 mL).</li>
		<li>8. gün, DMEM/F-12 içeren medya yerine 1x MEM olmayan esansiyel amino asitler (NEAA) solüsyonu, 1X L-glutamin, 2-mercaptoetanol, penisilin/streptomisin ve 1x N-2 takviyesi 100 nM RA ve 1 μM SAG. Medyayı günlük olarak değiştirin.</li>
		<li>Farklılaşma 12 gün sonra, farklılaşmış hücreler oligodendrosit progenitör hücrelerin (OPCS) uygun belirteçleri ifade etmelidir.</li>
	</ol></li>
	<li>Endokrin progenitör hücre farklılaşma (Pagliuca ve al.35tarafından uyarlanmıştır)<ol>
<li>Kök hücre medyasında 6 x 105 hücreli/ml 'de çekirdek pscs, 500 ml Spinner Flsorunda 10 μM kaya inhibitörü, 70 RPM 'de bir 37 °c inkübörü,% 5 Co2ve% 100 nemde rotasyon hızında 9 pozisyonlu karıştırın plaka seti üzerine yerleştirilir.</li>
		<li>Kümeleri Flask altında yerleşmek için izin, medya Aspire, daha sonra% 1-2% DMSO ile ön muamele.</li>
		<li>Hazırlamak Activin A, Chir99021, KGF, Sant1, All-Trans retinoik asit (RA), LDN193189, PdBU, XXI, Alk51, T3, ve Betacelluin stok çözümleri.</li>
		<li>Tablo 3' teki formülasyona göre farklılaşma tabanı medyasını hazırlayın.</li>
		<li>DMSO pretreatment sonra, Aspire medya ve S1 Medya ile yerine 100 ng/mL Activin A ve 3 mM Chir99021 (örneğin, 500 mL her Flask) ile tamamlayıcı. 24 saat boyunca inkübasyon izni verin.</li>
		<li>2. gün, 100 ng/mL Activin A ile desteklenen S1 medyası ile medyayı değiştirin. 2 gün boyunca inkübasyon sağlar.</li>
		<li>4. gün, 50 ng/mL KGF ile tamamlayıcı medya ile S2 Medya değiştirin. 3 gün boyunca kuluçyaya izin verin, ilk 2 günden sonra medyayı değiştirme (6. gün).</li>
		<li>7. gün, 50 ng/mL KGF, 0,25 mM Sant1, 2 mM RA ve 200 nM LDN193189 ile desteklenen S3 medyası ile medyayı değiştirin. 24 saat boyunca inkübasyon izni verin.</li>
		<li>8. gün, 50 ng/mL KGF, 0,25 mM Sant1, 2 mM RA, 200 nM LDN193189 ve 500 nM PdBU ile desteklenen S3 medyası ile medyayı değiştirin. 24 saat boyunca inkübasyon izni verin.</li>
		<li>9. günde, 50 ng/mL KGF, 0,25 mM Sant1 ve 100 nM RA ile desteklenen S3 medyası ile medyayı değiştirin. 5 gün boyunca kuluçyaya izin verin, her 2 günde bir medya değiştirme (11 ve 13. gün).</li>
		<li>14 ve 16 günlerde, 0,25 mM Sant1, 100 nM RA, 1 mM XXI, 10 mM Alk5i II, 1 mM T3 ve 20 ng/mL betacellulin (4 gün toplam kuluçka) ile desteklenen S5 medyası ile medyayı değiştirin.</li>
		<li>18 ve 20 gün içinde, 25 nM RA, 1 mm XXI, 10 mM Alk5i II, 1 mM T3 ve 20 ng/mL betacellulin ile desteklenen S5 medyası ile medyayı değiştirin.</li>
	</ol></li>
</ol>5. farklılaşma immünosittokimyasal doğrulama
Not: Aşağıdaki yöntemlerle gerektiği gibi ayarlanabilen genel bir immünositokimyasal protokol açıklanmaktadır. Primer antikorlar daha önce laboratuvarımızda doğrulanmıştır. Farklılaşma doğrulamasının diğer teknikleri de kullanılabilir (örn., akış sitometri, qPCR, RNA sıralaması, Batı blokasyon, fonksiyonel Yöntemler, vb.).
<ol><li>
İmmunolabeling hücreler
	<ol>
<li>Süspansiyon 3D kültürler için, plaka tüm hücre kümeleri veya kümeleri tek hücreli süspansiyon içine kaplı plakaları üzerine dağılmış 18-24 için h önce sabitleme.</li>
		<li>Yapışan hücrelerden medya aspirate ve bir shaker üzerinde RT PBS ile kısaca yıkayın.</li>
		<li>Hücre fikfasyonu için, PBS Aspire ve PBS içinde 4% civarında formaldehite (PFA) ile hücreleri kuluçat, 20 dakika boyunca RT Shaker. Dikkat: PFA stok toksisitesi nedeniyle bir duman kaputu altında hazırlanmalıdır. Nefes ve uygun kişisel koruyucu ekipman giymek etmeyin.</li>
		<li>PFA 'yı çıkarın ve uygun kimyasal atık konteynerinde atın.</li>
		<li>Bir shaker üzerinde RT yıkama başına en az 5 dakika PBS ile hücreleri 3x yıkayın.</li>
		<li>Hücre geçirgen ve engelleme için,% 5 eşek serum% 0,3 Triton-x 100/PBS, RT bir shaker üzerinde 1 h için hazırlanan hücreleri inkük.</li>
		<li>Birincil antikor çözümünü, geçirgen/engelleme için kullanılan aynı çözümde hazırlayın.</li>
		<li>Ana antikor çözeltisi içinde bir gecede 4 °C ' de çalkalama.</li>
		<li>Gece kuluçdak sonra, bir shaker üzerinde RT yıkama başına en az 5 dakika için PBS ile hücreleri 3x yıkayın.</li>
		<li>Sekonder antikor solüsyonu geçirgen/engelleme çözümünde hazırlayın.</li>
		<li>Bir shaker üzerinde RT 1 h için ikincil antikor çözeltisi içinde inkübe izin verin.</li>
		<li>Bir shaker üzerinde RT yıkama başına en az 5 dakika için PBS ile ikincil antikor çözeltisi ve yıkama hücreleri 3x aspirate.</li>
		<li>DAPı veya uygun kuluçka süresi için başka bir tercih edilen işaretleyiciyle hücreleri inkübasyon yapın ve PBS 'de durulayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Görüntü ölçümü
	<ol>
<li>Floresan mikroskop ve/veya yüksek içerik tarama platformu ile koşul başına en az üç görüntü kazanın.</li>
		<li>Tarafsız görüntüleme yazılımı (örn. ımagej) veya otomatik tarama platformu kullanılarak (DAPI/Hoechst çekirdekleri lekelenmesine dayalı) Toplam antikor lekeli hücre sayısı ve toplam hücre numaralarını sayarak her bir marker için pozitif hücrelerin yüzdesini ölçmek Analiz.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir şey açıklamak zorunda.

Özetle, bu protokol pluripotent kök hücrelerinin farklılaşma kapasitesini artırmak için basit ve ucuz bir araç açıklar (PSC 'ler) tüm primer mikrop katmanları için, özel progenitör hücreleri çeşitli türleri, ve hatta fonksiyonel, Olgun hücre türleri in vitro ve in vivo ayarlar. Illustrated, laboratuvarımızda ve diğerlerinin yanı sıra etkili bir şekilde çoğaltılan spesifik farklılaşma protokolleridir, ancak DMSO tedavisinin ardından tercih edilen herhangi bir farklılaşma protokolü kullanılabilir. Tablo 1' de gösterildiği gibi, bir dizi laboratuar, çeşitli diğer Terminal hücresi türleri oluşturmak için farklı paradigmalar kullanarak geçici DMSO tedavisinden sonra PSC farklılaşma geliştirmesini de göstermiştir. Ayrıca, buradaki Yöntemler insan PSC 'lerin kullanımını tarif etse de, DMSO ön tedavisi türler arasında kullanılabilir ve fare, tavşan ve primat PSC 'lerde etkili olduğu gösterilmiştir.
DMSO yüksek dozlarda sitotoksisik olduğu bilinmektedir rağmen, bu yöntemle kullanılan düşük dozlarda (1%-2%) en az hücre ölümü geçici bir süre sonucu için. DMSO tedavisinden hemen sonra genel hücre numaraları hücre döngüsünün G1 aşamasında hücre döngüsü tutuklama DMSO promosyon nedeniyle azalabilir iken, önceki çalışmalar hücrelerin kaldırıldıktan sonra kontrol kültürleri olarak aynı seviyeye ulaşmak mümkün olduğunu gösterir DMSO3.
DMSO ön tedavisi yüzdesi ve süresi hücre çizgisi başına en iyi duruma getirilmelidir. Tedavi süresi, hücrelerin Bisiklet/ikiye katlama süresi için dikkate alınarak ayarlanmalıdır. Örneğin, fare PSC 'leri genellikle yaklaşık 15 saat daha kısa Bisiklet süreleri vardır; Bu nedenle, bu hücreler için 15 h DMSO tedavisi yeterlidir. Bazı laboratuvarlar, farklılaşma protokolü sırasında veya daha düşük konsantrasyonlarda devam ederken DMSO tedavisinin yararlı olmasını da bulmuştu (bkz. Tablo 1). Bazı PSC hatları belirli sırlara farklılaşma için daha değiştirilebilir olduğunu unutulmamalıdır. Örneğin, HUES6 hücrelerin farklılaşma için daha az uygun olduğu gösterildi ve böylece DMSO tedavisi ile gelişme işaretlendi (Şekil 2). Alternatif olarak, Şekil 4 ve Şekil 5 ' te kullanılan HUES8 hücrelerin endodermal farklılaşma yönünde daha yüksek bir eğilimi olduğu gösterilmiştir; Böylece, ilk aşamalarında kesin endoderm 'ye doğru farklılaşma için kontrol ve DMSO arasında daha az farklar gösterildi. Yine de, bu hücre hattında farklılaşımın daha sonraki aşamalarında DMSO ön tedavisinin geliştirilmesi görülmektedir (Şekil 4B). DMSO tedavisi aynı zamanda hem 2D hem de 3D hücre kültürleri sistemlerinde etkili olduğu için çok yönlü olup, hücre kültürü plakaları üzerinde çeşitli kaplama malzemesi ile kullanılabilir ve büyüme ve genişlemenin geliştirilmesine teşvik eden farklı bakım ortamı türlerinde çalışır hPSCs (örn., mTeSR, E8, MEF, medya, vb).
Daha genel olarak, bu sonuçlar, pluripotent kök hücrelerinin başlangıç durumunun, ilk farklılaşma eğilimi üzerinde güçlü bir etkiye sahip olduğu gibi, işlevsel hücre türlerine Terminal farklılaşması olduğunu düşündürmektedir. Biz daha önce göstermiştir ki DMSO tedavi fonksiyonları RB üzerinden hpscs3,5. RB, Terminal farklılaşma, hücre hayatta kalma ve hücrelerin genetik istikrar41,42,43,44teşvik önemli bir rol oynar ve bu nedenle hücreler üzerinde kalıcı etkileri açıklayabilir DMSO tarafından işlenmiş hPSCs farklılaşmış. Yönetmelik bu erken modları hedefleme ayırt etmek için daha iyi bir yörünge üzerinde hPSCs yerleştirebilir ve sonuçta rejeneratif tıp için yardımcı programını geliştirmek.

Pluripotent kök hücrelerinin kullanımı, rejeneratif tıp ve kök hücreli tedaviler, hastalık modelleme ve ilaç taraması alanları da dahil olmak üzere Biyomedikal araştırmalarda çok sayıda gelişmelere yol açmıştır. Ayrıca daha çevrilebilir araştırma ve Kişiselleştirilmiş tıp genel umudu yol açmıştır. 20 yıl önce indüklenen pluripotent kök hücre (IPSC) teknolojisinin gelişini araştırmacılar somatik dokulardan pluripotent kök hücreleri geliştirmek ve çeşitli patolojiler çalışması için işlevsel hücre türlerine ayırt izin verdi, dahil Kardiyovasküler, nörolojik ve immünolojik hastalıklar. Kök hücre farklılaşma teknolojisinde önemli adımlar atılmasına karşın, insan embriyonik kök hücrelerini (hESCs) ve ıpscs 'nin etkili bir şekilde farklılaşması zorlukları hala devam ediyor, kök hücre teknolojisinin farklı araştırma programları. Farklı hücre hatları ve klonlar arasındaki içsel değişkenlik, kök hücre çizgilerini istenilen astarlara ayırmak için engel teşkil eder1. Ayrıca, Olgun, terminonal farklılaştırılmış fonksiyonel hücreler hPSCs türetme birçok satır boyunca sıkıcı ve verimsiz bir süreç kalır. Aslında, hPSCs farklılaştırılmış hücreler genellikle işlevsel hücrelere2farklılaştırmak için başarısız. Daha fazla hareket eden kök hücre tabanlı tedaviler hastalarda kullanmak için, geliştirmek ve hPSCs oluşturulan hücrelerin etkinliğini sağlamak için bir ihtiyaç vardır.
Laboratuvarımız, hem ıpscs hem de ESCs 'i olgun hücre türlerine ayırt etme verimliliğini önemli ölçüde artırmak için hızlı ve ucuz bir araç kurdu. HiPSCs ve hESCs 'nin yaygın olarak kullanılan reaktif dimetil sülfoxid (DMSO) ile ön tedavisinde, yönlendirilmiş farklılaşma işleminden önce 24 saat 48 h 'ye kadar kök hücre farklılaşma kapasitesinde belirgin bir iyileşme elde edildiğini tespit ettik. DMSO ile tedavi hücre döngüsünün erken G1 aşamasında hiPSCs ve hESCs oranını arttırır ve Retina proteini (RB)3, hücre proliferasyonu kritik bir regülatörü, hayatta kalma ve farklılaşma4' ü etkinleştirir. Daha yeni çalışma, bu RB ve aile üyelerinin DMSO Pro-farklılaşma etkileri için gerekli olduğu bulunmuştur, RB geçici inaktivasyonu DMSO etkilerini bastırır, geçici bir şekilde RB kurucu aktivasyonu artırır iken DMSO 'nun etkileri5. Embriyonik gelişim sırasında hücre döngüsüne benzerdir, ESCS ve ipscs hücre döngüsü, kendi kendine yenilenmeyi teşvik eden kısaltılmış G1 faz ile karakterize edilir6,7,8. Bu kısaltılmış G1 aşaması daha sınırsız proliferasyon sağlar ancak farklılaşma potansiyelini sınırlar4,9. G1 'de büyüme tutuklanmasını teşvik ederek ve hESCs ve ıpscs hücre döngüsünde kontrol noktası kontrollerini etkinleştirerek, DMSO tedavisi, yönlendirilmiş farklılaşma sonrasında hücre kaderi değişiklikleri için hücreleri değiştirir.
Bugüne kadar, DMSO ön 30 ' dan fazla kontrol ve hastalığa özgü insan ESC ve IPSC hücre hatları3,5 yanı sıra kök hücreleri ve diğer farklılaşma tüm üç germ katmanları için farklılaşma kapasitesini artırmak için gösterildi Sonraki çalışmalarda diğer olgun hücre türlerine çeşitli hücre hatları10,11,12,13,14,15,16, 17 , 18 , 19 , 20 tane , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 (Tablo 1). Ayrıca, DMSO tedavisi, insan dışı primer hücrelerin21,23 (örn., fare, primat, tavşan) farklılaşmasını arttırmada etkili olduğu gösterilmiştir, türler arasında paylaşılan mekanizmalar öneriyor. Son olarak, DMSO ön aynı zamanda gen düzenleme teknolojisine uzatıldı, belirli bir çalışma, hescs/ıpscs 24 h DMSO ön önemli ölçüde kümelenmiş düzenli interspaced kısa palindromic tekrarlar yeteneğini artırdı (crıpr) /CRISPR-associated protein-9 (Cas9)-istenmeyen mutasyonlar dahil olmadan kodlama olmayan DNA 'nın aracılı düzenleme verimliliği29. Burada sağlanan kök hücre biyolojisinde uygulamalar için hESCs ve ıpscs DMSO ön tedavisi ayrıntılı bir metodoloji ve yönlendirilmiş farklılaşma.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:651px;" width="651">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">21985023</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">9-Position stir plate&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Chemglass</td>
			<td style="width:135px;">CLS-4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Accutase</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">11105-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Activin A</td>
			<td style="width:135px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>338-AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Advanced RPMI</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">12633012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alk5i II</td>
			<td style="width:135px;">Axxora</td>
			<td style="width:135px;">ALX-270-445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">all-trans retinoic acid&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-Brachyury</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">AF2085</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:215px;">anti-C-peptide</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:135px;">GN-ID4</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-FoxA2</td>
			<td style="width:135px;">Millipore</td>
			<td>07-633</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-Nkx2.2</td>
			<td>University of Iowa, Developmental Hybridoma Bank</td>
			<td>74.5A5</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-Nkx6.1</td>
			<td>University of Iowa, Developmental Hybridoma Bank;&#160;</td>
			<td style="width:135px;">F55A12-supernatant</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-Olig2</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:135px;">MABN50</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-Pax-6</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td style="width:135px;">901301</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">anti-Pdx1</td>
			<td style="width:135px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>AF2419</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-SOX1&#160;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">AF3369</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-SOX17</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">AF1924</td>
			<td>No variablity observed across different lot numbers</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:215px;">B-27 Supplement, minus Vitamin A</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">basic fibroblast growth factor</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>PHG0264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Betacellulin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>50932345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chir99021</td>
			<td style="width:135px;">Stemgent</td>
			<td>04-000-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">CMRL 1066</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">99-603-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:215px;">Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td style="width:135px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:135px;">AMQAF1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:135px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:135px;">G7528&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">DAPI</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:135px;">D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Disposable Spinner Flasks</td>
			<td style="width:135px;">Corning, VWR</td>
			<td style="width:135px;">89089-814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">DMEM/F-12</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">DMSO&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Essential 6 Media</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>A1516501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">FAF-BSA</td>
			<td style="width:135px;">Proliant&#160;</td>
			<td style="width:135px;">68700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">FGF7</td>
			<td style="width:135px;">PeproTech</td>
			<td style="width:135px;">100-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Geltrex</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>A1413202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">GlutaMAX&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Heparin&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:135px;">H3149&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Ultrasensitive Insulin ELISA</td>
			<td>ALPCO Diagnostics</td>
			<td>80-INSHUU-E01.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">ITS-X</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:135px;">51500056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KGF</td>
			<td style="width:135px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">AF-100-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Knockout DMEM</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>10829018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">KnockOut Serum Replacement</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-3,3&#8242;,5-Triiodothyronine (T3)</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:135px;">642245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">LDN193189</td>
			<td style="width:135px;">Stemgent</td>
			<td>04-0074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Matrigel Matrix</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MCDB-131&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Cellgro&#160;</td>
			<td style="width:135px;">15-100-CV&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">MEM NEAA</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:215px;">mTeSR 1</td>
			<td style="width:135px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:135px;">5850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">N2 Supplement</td>
			<td style="width:135px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:135px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:135px;">S3817&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Noggin Fc Chimera Protein</td>
			<td style="width:135px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">3344-NG-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PdBU</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:135px;">524390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Mediatech&#160;</td>
			<td style="width:135px;">30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">RPMI</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sant1</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">S4572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SB431542</td>
			<td style="width:135px;">Stemgent</td>
			<td>04-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Smoothened Agonist, SAG</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td>566660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">StemPro Accutase</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td>A1110501&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">TrypLE</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">12604013</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:215px;">Ultra-Low Attachment Microplates</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td>3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Vitamin C</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">A4544&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">Wnt3a</td>
			<td style="width:135px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>5036-WN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:215px;">XAV 939</td>
			<td style="width:135px;">Tocris</td>
			<td style="width:135px;">3748</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">XXI</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:135px;">565790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Y-27632</td>
			<td style="width:135px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:135px;">72302</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transient treatment of human pluripotent stem cells with dmso to promote differentiation

Pluripotent kök hücrelerinin (PSC 'Ler) büyüyen kullanımına rağmen, çeşitli çağlarda embriyonik ve indüklenen pluripotent kök hücrelerini (ESCs ve ıpscs) verimli bir şekilde ayırt etme zorlukları kalır. Çok sayıda farklılaşma protokolleri geliştirilmiştir, ancak hücre hatları arasında değişkenlik ve farklılaşma düşük oranlar başarıyla bu protokoller uygulanması zorluklar. Burada açıklanan, PSC 'lerin farklılaşma kapasitesini arttırmak için kolay ve ucuz bir araç. Daha önce, düşük konsantrasyonlu dimetil sulfoxid (DMSO) ile kök hücrelerin tedavisinde, farklı hücre türlerine yönlendirilmiş farklılaşma sonrasında ayırt etmek için çeşitli PSC 'lerin eğilimi önemli ölçüde artar gösterildi. Bu teknik artık farklı türler (örn., fare, primat ve insan) arasında, nöronların ve kortikal kürlerden düzgün kas hücrelerinin ve hepatositlere kadar değişen birden fazla sırlara kadar etkili olduğu gösterilmiştir. DMSO ön tedavisi, hücre döngüsünü düzenleyerek ve kök hücreleri ayrıştırılması sinyallerine daha duyarlı olması için astar oluşturarak PSC farklılaşmayı geliştirir. Burada sağlanan bu basit aracı yeniden üretilebilen ve yaygın olarak uygulanabilir bir yöntem olarak kullanmak için, PSC 'lerin herhangi bir seçim sırasının daha verimli bir şekilde ayırt edilmesi için ayrıntılı bir yöntemdir.

Watch this Scientific Journal Video about Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation at JoVE.com

Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation

İnsan pluripotent kök hücrelerinden farklılaştırılmış hücre türleri üreten (hPSCs) büyük terapötik söz tutar ama zorlu kalır. PSC 'ler genellikle uygun bir sinyal seti ile uyarıldığında bile ayrım yapmak için doğal bir yetersizlik sergiler. Burada açıklanan PSC hatları çeşitli arasında multilineage farklılaşma geliştirmek için basit bir araçtır.

Insan pluripotent kök hücrelerinin DMSO ile geçici tedavisi farklılaşma teşvik etmek

Despite the growing use of pluripotent stem cells (PSCs), challenges in efficiently differentiating embryonic and induced pluripotent stem cells (ESCs and ...

Bu farklılaşma için asal hücrelere herhangi bir kök hücre hattı veya farklılaşma protokolü uygulanabilir basit bir tedavi yöntemidir. Tek yapmanız gereken hücre kültürü bakım ortamına %1-2 oranında DMSO eklemektir. Bu tekniğin en büyük avantajı, pluripotent kök hücrelerin farklılaşma potansiyelini, hücreleri farklılaşma için astarlayarak herhangi bir soyuna önemli ölçüde artırmasına olanak sağlamasıdır.DMSO tedavisi, hücrelerin hasta kaynaklı iPSC'lerden ayırt edilerek hücre replasman tedavisi, hastalık modellemesi ve ilaç taraması için kullanılmasına olanak tanıyan şansı artırır. Embriyonik gelişim sırasında alt proliferasyon, farklılaşma ve spesifikasyonu kontrol eden düzenlemenin erken başlangıcına yol açabilir. DMSO tedavisinin yaklaşık 50 insan embriyonik ve indüklenen pluripotent kök hücre hatlarında farklılaşmayı artırdığını gösterdik.Diğer laboratuvarlar fare ve primat gibi diğer türlerin kök hücreleri için yararlı olduğunu göstermiştir iken. Farklılaşmanın başlangıcından bir gün önce, tipik bakım ortamınıza 24 saat boyunca %1 veya %2'lik bir konsantrasyonla DMSO ekleyin. DMSO tedavisinden 24 saat sonra ortam değiştirin ve her zamanki farklılaşma protokolünüze devam edin.El yazması talimatlara göre hücreleri büyütün. Hücreler uygun bir birleşimi ulaştığında, onları ayırmak ve tek bir hücre süspansiyon hazırlamak. Trippan mavisi gibi bir canlılık işareti kullanarak hemositometre veya otomatik hücre sayacı ile canlı hücreleri sayın.24 saatlik DMSO ön arıtmada %80-90 biraraya gelmek için hücreleri 500,000 ila 1 milyon hücre arasında kaplanmış altı kuyulu bir plakaya yerleştirin. Hücreleri 24 saat boyunca karbondioksit kuvözde 37 derecede kuluçkaya yatırın. Daha sonra, medya aspire ve% 1-2 DMSO çözeltisi ile değiştirin.Hücrelerin farklılaşmadan önce 24-28 saat kuluçkaya yatmasını bekleyin. 48 saat kuluçkaya yatsanız, 24 saat sonra ortamı taze DMSO solüsyonu ile değiştirin. 3D kültür farklılaşması elde etmek için, büyümek ve bir hücre süspansiyon hücreleri toplamak.Canlı hücreleri sayın ve rock inhibitörü ile kök hücre medyasında kaplamasız, düşük bağlı altı iyi plaka içinde plakalayın. Tipik olarak, 3D insan pluripotent kök hücre küreleri 24 saat içinde oluşacaktır. Hücrelerin karbondioksit kuvözde 37 derecede 24 saat kuluçkaya yatmasını bekleyin.El yazması talimatlara göre önceden ısıtılmış kök hücre medyasında %1-2 DMSO hazırlayın. Kuluçkadan sonra ortamı değiştirmek için plakayı 30 derece ile 45 derecelik açıya doğru yatırın ve hücre kürelerinin kuyunun dibine yerleşmesine izin verin. Hücreleri aspirasyon ve yavaşça DMSO çözeltisi onları yeniden askıya.Hücrelerin karbondioksit kuvözde 37 derecede 24-48 saat kuluçkaya yatmasını bekleyin. 2B kültürler için açıklandığı şekilde DMSO'lu hücreleri önceden tedavi edin ve noggin ve SB431542 stok çözümleri hazırlayın. Üç ila dört günlük medya değişikliği için nakavt DMEM'de yeterli %10 nakavt serum replasmanı veya KOSR hazırlayın.El yazmasında açıklandığı gibi önceden ısıtılmış KOSR nakavt DMEM'e noggin ve SB431542 ekleyerek ektodermal farklılaşma ortamı hazırlayın. DMSO ön işlemden sonra, hücrelerden aspirasyon ortamı ve her kuyuya iki mililitre farklılaşma ortamı ekleyin. Hücrelerin 37 santigrat derecede karbondioksit inkübatörde üç ila dört gün kuluçkaya yatırmasına izin verin, her gün medyanın yerine taze farklılaşma faktörleri verin.DMSO ön tedavi, tedavi edilmeyen hücrelere göre hücre büyüme hızında geçici ve doza bağlı bir düşüşe neden olur. Bu azalma çoğalması hücreden hücreye temasbir artış ile ilişkilidir, özellikle belirgin olan 2%DMSO tedavi hücrelerde. Hücreler her mikrop tabakasının prototimopik belirteçleri için sabit ve lekeli olduğunda, bu farklılaşmış mikrop tabakası hücrelerinin artan oranda% 2 DMSO ön tedavi sonuçları görülebilir.Örneğin, SOX17 endoderm hücrelerini görselleştirmek için lekeli oldu. DMSO'nun merkezi sinir sistemi progenitor hücre tiplerine farklılaşma üzerindeki etkisini araştırmak için, insan kaynaklı pluripotent kök hücreler nöral progenitor hücrelere veya oligodendrocyte progenitor hücrelere farklılaştırılabilir. Kontrol hücreleri ile karşılaştırıldığında, 2% DMSO ön tedavi nöral progenitor hücre belirteci Pax6 ifadesini artırır.Benzer şekilde, ön tedavi oligodendrocyte progenitor hücre belirteci Olig2 ifade hücrelerinin oranını artırır. Ayrıca, ilk DMSO tedavisi in-vivo transplantasyon sonrasında insan embriyonik kök hücre kaynaklı hücre fonksiyonunu geliştirir. Farklılaşmış pankreas atası hücreleri immünoeksik farelere nakledildiğinde, işlevleri glikoz zorluğuna veya KCl stimülasyonuna yanıt olarak test edilebilir.Hücre işlevselliğinde iyileşmeler iki haftadan 16 haftaya kadar transplantasyon sonrası belirgindir. Dikkate alınması gereken en önemli husus, kök hücrelerinizin bisiklete binme veya iki katına çıkarma süresidir. DMSO tedavisinin uzunluğu hücrelerin bisiklet süresi ile aynı olmalıdır.İlk DMSO tedavisinin ardından, tedavi hücre döngüsünün G1 fazında büyümeyi teşvik yardımcı olarak, hücre çoğalması ve hücre döngüsünün kök hücrelerde nasıl düzenlendiğini anlayabiliriz. Diferansiye hücreler hastalıkla ilgili mekanizmaları anlamak için, diğer hücre tipleri ile birlikte, tümörijenite tahlillerinde ve fonksiyonel tahlillerde veya transplantasyon çalışmalarında, farklılaşmış hücrelerin bir hastalık fenotipini kurtarıp kurtaramayacağına karar vermek için kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Stencil Micropatterning of Human Pluripotent Stem Cells for Probing Spatial Organization of Differentiation Fates

Farklılaşma Fates Mekansal Organizasyonu Probing İnsan pluripotent kök hücrelerin Stencil micropatterning

Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Oldukça Tekrarlanabilir Küçük Molekül Tabanlı Farklılaşma Protokolü kullanarak insan pluripotent kök hücreleri gelen kardiyomiyositlerde Büyük Ölçekli Üretim

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays

Mikro-elektrot dizileri Ağ Aktivite Ölçüm uyarılmış pluripotent kök hücrelerin Rapid Nöronal Farklılaşma

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

İlkel ve kesin hematopoetik ataları insan Pluripotent kök hücrelerden farklılaşma yönetmen

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Pluripotent Verimli Farklılaşma NKX6-1 için Kök Hücreler<sup&gt; +</sup&gt; Pankreas Progenitörler

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Insan pluripotent İn Vitro Farklılaşma Trofoblastik Hücreleri içine Kök Hücreler

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Hızlı, yönlendirilmiş farklılaşma insan embriyonik veya İndüklenmiş Pluripotent kök hücrelerinden retina Pigment epitel hücrelerinin

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a Na&#239;ve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency

Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a NaÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¯ve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency

Geleneksel insan Pluripotent kök hücreler kimyasal Reversion için geliştirilmiş Multilineage farklılaşma potansiyeli ile saf gibi devlet

Na&#239;ve human pluripotent stem cells (N-hPSC) with improved functionality may have a wide impact in regenerative medicine. The goal of this protocol is ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Verimli ve ölçeklenebilir yönlendirilmiş farklılaşma klinik olarak uyumlu kornea Limbal epitel kök hücrelerden insan Pluripotent kök hücreler

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...