Name: pan-myeloid differentiation of human cord blood derived cd34+ hematopoietic stem and progenitor cells
Uploaded: 2019-08-09T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pan-myeloid Differentiation of Human Cord Blood Derived CD34+ Hematopoietic Stem and Progenitor Cells at JoVE.com

Forfatterne vil gjerne takke Wendy Barrett, Rachel Caballero, og Gabriella Ruiz av Maricopa integrert Health Systems for de-identifisert og donert ledningen blod enheter, Mrinalini Kala for assistanse med Flow flowcytometri, og Gay crooks og Christopher seet for råd om ex vivo myelogen differensiering. Dette arbeidet ble støttet av midler til S.S. fra National Institutes of Health (R21CA170786 og R01GM127464) og American Cancer Society (den institusjonelle Research Grant 74-001-34-IRG). Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synspunktene til National Institutes of Health.

Human navlestreng blod for eksperimentering ble donert av friske individer etter informert samtykke til Maricopa Integrated Health Systems (MIHS), Phoenix. De deidentified enhetene ble innhentet gjennom en Material overføringsavtale mellom MIHS og University of Arizona.
1. reagenser og buffere
Merk: Klargjør alle reagenser og buffere under sterile forhold i et biologisk sikkerhetskabinett.
<ol><li>Forbered steril PBS-BSA-EDTA (PBE) buffer ved å...

<ol>
	<li>Hao, Q. L., Shah, A. J., Thiemann, F. T., Smogorzewska, E. M., Crooks, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+comparison+of+CD34+++CD38-+cells+in+cord+blood+and+bone+marrow.">A functional comparison of CD34 + CD38- cells in cord blood and bone marrow.</a> Blood. 86 (10), 3745-3753 (1995).</li><li>Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+isolation+of+human+clonogenic+common+myeloid+progenitors.">Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11872-11877 (2002).</li><li>Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+clonogenic+common+lymphoid+progenitors+in+mouse+bone+marrow.">Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow.</a> Cell. 91 (5), 661-672 (1997).</li><li>Seita, J., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell:+self-renewal+versus+differentiation.">Hematopoietic stem cell: self-renewal versus differentiation.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. 2 (6), 640-653 (2010).</li><li>Haas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation-Induced+Emergency+Megakaryopoiesis+Driven+by+Hematopoietic+Stem+Cell-like+Megakaryocyte+Progenitors.">Inflammation-Induced Emergency Megakaryopoiesis Driven by Hematopoietic Stem Cell-like Megakaryocyte Progenitors.</a> Cell Stem Cell. 17 (4), 422-434 (2015).</li><li>Sanjuan-Pla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-biased+stem+cells+reside+at+the+apex+of+the+haematopoietic+stem-cell+hierarchy.">Platelet-biased stem cells reside at the apex of the haematopoietic stem-cell hierarchy.</a> Nature. 502 (7470), 232-236 (2013).</li><li>Bender, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+and+characterization+of+CD34++cells+from+normal+human+bone+marrow,+cord+blood,+peripheral+blood,+and+mobilized+peripheral+blood+from+patients+undergoing+autologous+stem+cell+transplantation.">Phenotypic analysis and characterization of CD34+ cells from normal human bone marrow, cord blood, peripheral blood, and mobilized peripheral blood from patients undergoing autologous stem cell transplantation.</a> Clinical Immunology and Immunopathology. 70 (1), 10-18 (1994).</li><li>Fritsch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+composition+of+CD34+subpopulations+differs+between+bone+marrow,+blood+and+cord+blood.">The composition of CD34 subpopulations differs between bone marrow, blood and cord blood.</a> Bone Marrow Transplantation. 17 (2), 169-178 (1996).</li><li>Nimgaonkar, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+population+of+CD34++cells+in+cord+blood.">A unique population of CD34+ cells in cord blood.</a> Stem Cells. 13 (2), 158-166 (1995).</li><li>Hordyjewska, A., Popiolek, L., Horecka, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+hematopoietic+stem+cells+of+umbilical+cord+blood.">Characteristics of hematopoietic stem cells of umbilical cord blood.</a> Cytotechnology. 67 (3), 387-396 (2015).</li><li>Bapat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+Disease+Mutations+of+Splicing+Factor+SRSF2+Cause+G2-M+Arrest+and+Skewed+Differentiation+of+Human+Hematopoietic+Stem+and+Progenitor+Cells.">Myeloid Disease Mutations of Splicing Factor SRSF2 Cause G2-M Arrest and Skewed Differentiation of Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells.</a> Stem Cells. 36, 1-13 (2018).</li><li>Yip, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+U2AF1S34F+mutation+induces+lineage-specific+splicing+alterations+in+myelodysplastic+syndromes.">The U2AF1S34F mutation induces lineage-specific splicing alterations in myelodysplastic syndromes.</a> Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2206-2221 (2017).</li><li>Yoo, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+differentiation+of+human+cord+blood+CD34++cells+during+ex+vivo+expansion+using+thrombopoietin,+flt3-ligand+and/or+granulocyte-colony+stimulating+factor.">Myeloid differentiation of human cord blood CD34+ cells during ex vivo expansion using thrombopoietin, flt3-ligand and/or granulocyte-colony stimulating factor.</a> British Journal of Haematology. 105 (4), 1034-1040 (1999).</li><li>Hao, Q. L., Smogorzewska, E. M., Barsky, L. W., Crooks, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+identification+of+single+CD34+CD38-+cells+with+both+lymphoid+and+myeloid+potential.">In vitro identification of single CD34+CD38- cells with both lymphoid and myeloid potential.</a> Blood. 91 (11), 4145-4151 (1998).</li><li>Moretta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+generation+of+human+innate+lymphoid+cells+is+influenced+by+the+source+of+hematopoietic+stem+cells+and+by+the+use+of+G-CSF.">The generation of human innate lymphoid cells is influenced by the source of hematopoietic stem cells and by the use of G-CSF.</a> European Journal of Immunology. 46 (5), 1271-1278 (2016).</li><li>Sanz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ordering+human+CD34+CD10-CD19++pre/pro-B-cell+and+CD19-+common+lymphoid+progenitor+stages+in+two+pro-B-cell+development+pathways.">Ordering human CD34+CD10-CD19+ pre/pro-B-cell and CD19- common lymphoid progenitor stages in two pro-B-cell development pathways.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5925-5930 (2010).</li><li>Egeland, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+differentiation+of+purified+CD34++cells+after+stimulation+with+recombinant+human+granulocyte-monocyte+colony-stimulating+factor+(CSF),+granulocyte-CSF,+and+interleukin-3.">Myeloid differentiation of purified CD34+ cells after stimulation with recombinant human granulocyte-monocyte colony-stimulating factor (CSF), granulocyte-CSF, and interleukin-3.</a> Blood. 78 (12), 3192-3199 (1991).</li><li>Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+proliferation+of+hematopoietic+stem+cells.">Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells.</a> Blood. 81 (11), 2844-2853 (1993).</li><li>Perdomo, J., Yan, F., Leung, H. H. L., Chong, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megakaryocyte+Differentiation+and+Platelet+Formation+from+Human+Cord+Blood-derived+CD34++Cells.">Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), e56420 (2017).</li><li>Palii, C. G., Pasha, R., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral-mediated+knockdown+during+ex+vivo+erythropoiesis+of+human+hematopoietic+stem+cells.">Lentiviral-mediated knockdown during ex vivo erythropoiesis of human hematopoietic stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (53), e2813 (2011).</li><li>Davies, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+ASXL1+impairs+the+granulomonocytic+lineage+potential+of+human+CD34(+)+progenitor+cells.">Silencing of ASXL1 impairs the granulomonocytic lineage potential of human CD34(+) progenitor cells.</a> British Journal of Haematology. 160 (6), 842-850 (2013).</li><li>Caceres, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TP53+suppression+promotes+erythropoiesis+in+del(5q)+MDS,+suggesting+a+targeted+therapeutic+strategy+in+lenalidomide-resistant+patients.">TP53 suppression promotes erythropoiesis in del(5q) MDS, suggesting a targeted therapeutic strategy in lenalidomide-resistant patients.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16127-16132 (2013).</li><li>Shi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ASXL1+plays+an+important+role+in+erythropoiesis.">ASXL1 plays an important role in erythropoiesis.</a> Scientific Reports. 6, 28789 (2016).</li><li>Mazumdar, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukemia-Associated+Cohesin+Mutants+Dominantly+Enforce+Stem+Cell+Programs+and+Impair+Human+Hematopoietic+Progenitor+Differentiation.">Leukemia-Associated Cohesin Mutants Dominantly Enforce Stem Cell Programs and Impair Human Hematopoietic Progenitor Differentiation.</a> Cell Stem Cell. 17 (6), 675-688 (2015).</li><li>Chung, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enforced+expression+of+an+Flt3+internal+tandem+duplication+in+human+CD34++cells+confers+properties+of+self-renewal+and+enhanced+erythropoiesis.">Enforced expression of an Flt3 internal tandem duplication in human CD34+ cells confers properties of self-renewal and enhanced erythropoiesis.</a> Blood. 105 (1), 77-84 (2005).</li><li>Ambrosini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-1beta+inhibits+ILC3+while+favoring+NK-cell+maturation+of+umbilical+cord+blood+CD34(+)+precursors.">IL-1beta inhibits ILC3 while favoring NK-cell maturation of umbilical cord blood CD34(+) precursors.</a> European Journal of Immunology. 45 (7), 2061-2071 (2015).</li><li>Batard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-(beta)1+maintains+hematopoietic+immaturity+by+a+reversible+negative+control+of+cell+cycle+and+induces+CD34+antigen+up-modulation.">TGF-(beta)1 maintains hematopoietic immaturity by a reversible negative control of cell cycle and induces CD34 antigen up-modulation.</a> Journal of Cell Science. 113, 383-390 (2000).</li><li>Huang, N., Lou, M., Liu, H., Avila, C., Ma, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+potent+small+molecule+capable+of+regulating+polyploidization,+megakaryocyte+maturation,+and+platelet+production.">Identification of a potent small molecule capable of regulating polyploidization, megakaryocyte maturation, and platelet production.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 9 (1), 136 (2016).</li></ol>

Protokollen beskrevet her er egnet for ex vivo differensiering av UCB avledet CD34+ HSPCs til de fire myelogen linjene. Initial inkubasjons med en cytokin blanding bestående av SCF, TPO, Flt3L og IL3 stimulerer CD34+ celler. Deretter er differensiering oppnås med en cocktail av SCF, IL3, Flt3L, EPO, og TPO. I denne blandingen, SCF, IL3, og Flt3L er viktig for overlevelse og spredning av CD34+ HSCS. EPO og TPO fremme differensiering mot erytrocytter og megakaryocytter, henholdsvis, og IL...

Normal differensiering av blodkreft stamceller (HSCs) er avgjørende for vedlikehold av fysiologiske nivåer av alle blodlegemer linjene. Under differensiering, i en koordinert reaksjon på ekstracellulære stikkord inkludert vekstfaktorer og cytokiner, HSCs første gi opphav til Multipotent stamfar (MPP) celler som har lymfe-myelogen potensial1,2,3 ,4 (figur 1). MPPs gi opphav til felles myelogen forfedre (CMPs) og felles lymfoide forfedre (CLPs) som er avstamning-begrenset. CLPs differensiere til lymfoide linjene består av B, T, og naturlig killer celler. CMPs genererer myelogen linjene gjennom to mer begrensede Stam populasjoner, megakaryocyte erytroide forfedre (MEPs) og granulocytt monocytt forfedre (GMP). MEPs gi opphav til megakaryocytter og erytrocytter, mens GMP gi opphav til granulocytter og monocytter. I tillegg til å oppstå gjennom CMPs, har megakaryocytter også blitt rapportert direkte fra HSCs eller tidlig MPPs via ikke-kanoniske trasé5,6.
Blodkreft stilk og stamceller (HSPCs) er preget av overflaten markør CD34 og mangelen på avstamning spesifikke markører (Lin-). Andre overflate markører som vanligvis brukes til å skille HSCs og myelogen Stam populasjoner inkluderer CD38, CD45RA og CD1232 (figur 1). HSCs og MPPs er henholdsvis Lin-/CD34+/CD38- og Lin-/CD34+/CD38+. Myelogen begått Stam populasjoner er preget av tilstedeværelse eller fravær av CD45RA og CD123. CMPs er Lin-/CD34+/CD38+/CD45RA-/CD123lo, GMP er Lin-/CD34+/CD38+/CD45RA+/CD123lo, og MEPs er Lin-/CD34+ /CD38+/CD45RA-/CD123-.
Den totale befolkning på CD34+ Stem og stamceller kan fås fra humant navlestreng blod (UCB), benmarg, og perifert blod. CD34+ celler utgjør 0,02% til 1,46% av totale mononukleære celler (MNCs) i humant UCB, mens deres prosentandel varierer mellom 0,5% og 5,3% i benmargen og er mye lavere på ~ 0,01% i perifert blod7,8,9 . Proliferativ kapasitet og differensiering potensialet i UCB avledet CD34+ celler er betydelig høyere enn benmarg eller perifere blodlegemer1,10, og dermed gir en klar fordel for å oppnå tilstrekkelig materiale for molekylær analyser i kombinasjon med å utføre immunophenotypic og morfologiske karakterisering av cellene under differensiering.
Ex vivo differensiering av navlestreng blod avledet CD34+ HSPCs er en mye brukt modell for å undersøke normal hematopoiesen og blodkreft sykdom mekanismer. Når kultivert med de riktige cytokiner, kan UCB CD34+ HSPCs bli overtalt til å differensiere langs myelogen eller lymfoide linjene11,12,13,14,15 , 16. her beskriver vi protokoller for isolering og immunophenotypic KARAKTERISERING av CD34+ HSPCs fra Human UCB, og for deres differensiering til myelogen avstamning celler. Dette kultur systemet er basert på cytokin-indusert differensiering av HSPCs i nærvær av MS-5 stromal celler for å etterligne mikromiljøet i benmargen. Kulturen forholdene føre til en første utvidelse av CD34+ celler, etterfulgt av deres differensiering til celler som uttrykker markører for de fire myelogen avstamning celler, nemlig granulocytter (CD66b), MONOCYTTER (CD14), MEGAKARYOCYTTER (CD41), og erytrocytter (CD235a). Anvendelser av CD34+ celle differensiering protokollen inkluderer studier på molekylære mekanismer som regulerer hematopoiesen, og undersøkelser av virkningen av myelogen sykdom knyttet mutasjoner og små molekyler på selv-fornyelse og differensiering av HSPCs.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:785px;" width="786">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">0.4% Trypan blue solution</td>
			<td style="width:112px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15250-061</td>
			<td style="width:339px;">Dilute working stock to 0.2% in sterile 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">0.5 M UltraPure Ethylene diamine tetra acetic acid, pH 8.0</td>
			<td style="width:112px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:119px;">15575-038</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">10x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:112px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">14185052</td>
			<td style="width:339px;">Dilute to 1x with sterile distilled water &#38; pH to 7.2</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">2.5% Trypsin, no phenol red</td>
			<td style="width:112px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15090046</td>
			<td style="width:339px;">Dilute working stock to 1x with sterile 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">30 &#181;m Pre-separation filters</td>
			<td style="width:112px;">Miltenyi biotech</td>
			<td style="width:119px;">130-041-407</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">35% sterile Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A7979</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">7-AAD</td>
			<td style="width:112px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">420404</td>
			<td style="width:339px;">Used as a live/dead stain to eliminate dead cells from FACS analysis</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-human CD10-FITC antibody (Clone HI10a)</td>
			<td style="width:112px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">312207</td>
			<td style="width:339px;">Use 1:20 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Anti-human CD11b-FITC (activated) antibody (Clone CBRM1/5)</td>
			<td style="width:112px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">301403</td>
			<td style="width:339px;">Use 1:5 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-human CD123-APC antibody (Clone 6H6)</td>
			<td style="width:112px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">306012</td>
			<td style="width:339px;">Use 1:20 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-human CD14-PE antibody (Clone M5E2)</td>
			<td style="width:112px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">301806</td>
			<td style="width:339px;">Use 1:20 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-human CD19-FITC antibody (Clone 4G7)</td>
			<td style="width:112px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">347543</td>
			<td style="width:339px;">Use 1:5 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-human CD235a-APC antibody (Clone GA-R2 (HIR2))</td>
			<td style="width:112px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">551336</td>
			<td style="width:339px;">Use 1:20 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-human CD235a-FITC antibody (Clone HIR2)</td>
			<td style="width:112px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">306609</td>
			<td style="width:339px;">Use 1:50 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-human CD34-APC-Cy7 antibody (Clone 581)</td>
			<td style="width:112px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">343514</td>
			<td style="width:339px;">Use 1:20 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-human CD38-PE antibody (Clone HIT2)</td>
			<td style="width:112px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">303506</td>
			<td style="width:339px;">Use 1:20 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-human CD3-FITC antibody (Clone UCHT1)</td>
			<td style="width:112px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">300405</td>
			<td style="width:339px;">Use 1:20 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-human CD41a-PerCP-Cy5.5 antibody (Clone HIP8)</td>
			<td style="width:112px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">303720</td>
			<td style="width:339px;">Use 1:20 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-human CD45Ra-PE-Cy7 antibody (Clone HI100)</td>
			<td style="width:112px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">304126</td>
			<td style="width:339px;">Use 1:20 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-human CD66b-PE-Cy7 antibody (Clone G10F5)</td>
			<td style="width:112px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">305116</td>
			<td style="width:339px;">Use 1:20 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-human CD7-FITC antibody (Clone CD7-6B7)</td>
			<td style="width:112px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">343103</td>
			<td style="width:339px;">Use 1:20 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP231-100</td>
			<td style="width:339px;">Filter sterilize before use</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM) powder with L-Glutamine&#160;</td>
			<td style="width:112px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">12100046</td>
			<td style="width:339px;">Reconstitute 1 packet to make 1 L of DMEM media&#160; with sodium bicarbonate, 10% FBS &#38; 1% penicillin &#38; streptomycin&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Fetal bovine serum, Australian source, heat inactivated</td>
			<td style="width:112px;">Omega Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB-22 Lot #609716</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Human CD34 microbead kit&#160;</td>
			<td style="width:112px;">Miltenyi biotech</td>
			<td style="width:119px;">130-046-702</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Human Thrombopoietin (TPO), research grade</td>
			<td style="width:112px;">Miltenyi biotech</td>
			<td style="width:119px;">130-094-011</td>
			<td style="width:339px;">Make a stock of 100 &#181;g/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 50 ng/mL for both myeloid differentiation &#38; stimulation medium</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:112px;">Omega Scientific</td>
			<td style="width:119px;">GS-60</td>
			<td style="width:339px;">2 mM concentration in stimulation medium</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">LS Columns</td>
			<td style="width:112px;">Miltenyi biotech</td>
			<td style="width:119px;">130-042-401</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">MACS Multi stand</td>
			<td style="width:112px;">Miltenyi biotech</td>
			<td style="width:119px;">130-042-303</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">MidiMACS magnetic separator</td>
			<td style="width:112px;">Miltenyi biotech</td>
			<td style="width:119px;">130-042-302</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">MNC fractionation media (Ficol-Paque PLUS)</td>
			<td style="width:112px;">GE Healthcare Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">17-1440-03</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">MS-5 cells</td>
			<td style="width:112px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:339px;">Gift from the laboratory of Gay Crooks, UCLA</td>
		</tr>
		<tr height="148">
			<td height="148" style="height:148px;width:216px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P6148</td>
			<td style="width:339px;">Heat 800 mL of 1x PBS in a glass beaker on a stir plate in a chemical hood to ~65 &#176;C. Add 10 g of paraformaldehyde powder. To completely dissolve the paraformaldehyde, raise the pH by adding 1 N NaOH. Cool and filter the solution and make up the volume to 1 L with 1x PBS. Adjust the pH to 7.2.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Penicillin &#38; Streptomycin</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P4458-100ml</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Poly-L lysine</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P2636</td>
			<td style="width:339px;">Make a 10 mg/mL stock in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Recombinant human erythropoietin-alpha (rHu EPO-&#945;)</td>
			<td style="width:112px;">BioBasic</td>
			<td style="width:119px;">RC213-15</td>
			<td style="width:339px;">Make a stock of 2000 units/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 4 units/mL for myeloid differentiation</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Recombinant human fibronectin fragment (RetroNectin)</td>
			<td style="width:112px;">Takara&#160;</td>
			<td style="width:119px;">T100B</td>
			<td style="width:339px;">Use 20 &#181;g/mL diluted in sterile 1x PBS to coat wells prior to stimulation of CD34+ HSCs.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Recombinant human Flt-3 ligand (rHu Flt-3L)</td>
			<td style="width:112px;">BioBasic</td>
			<td style="width:119px;">RC214-16</td>
			<td style="width:339px;">Make a stock of 100 &#181;g/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation &#38; 50 ng/mL in stimulation medium</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Recombinant human interleukin-3 (rHu IL-3)</td>
			<td style="width:112px;">BioBasic</td>
			<td style="width:119px;">RC212-14</td>
			<td style="width:339px;">Make a stock of 100 &#181;g/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation &#38; 20 ng/mL in stimulation medium</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Recombinant human stem cell factor (rHu SCF)</td>
			<td style="width:112px;">BioBasic</td>
			<td style="width:119px;">RC213-12</td>
			<td style="width:339px;">Make a stock of 100 &#181;g/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation &#38; 50 ng/mL in stimulation medium</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Serum free medium (X-Vivo-15)</td>
			<td style="width:112px;">Lonza&#160;</td>
			<td style="width:119px;">04-418Q</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP328-500</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Wright-Giemsa stain, modified</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">WG16-500</td>
			<td style="width:339px;">Use according to manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Equipment&#160;</td>
			<td style="width:112px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">BD LSR II flow cytometer</td>
			<td style="width:112px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:112px;">Sorvall Legend RT</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Light microscope</td>
			<td style="width:112px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pan-myeloid differentiation of human cord blood derived cd34+ hematopoietic stem and progenitor cells

Ex vivo differensiering av menneskelig blodkreft stamceller er en mye brukt modell for å studere hematopoiesen. Protokollen som er beskrevet her er for cytokin indusert differensiering av CD34+ blodkreft stem og stamceller til de fire myelogen avstamning celler. CD34+ celler er isolert fra menneskelige navlestreng blod og co-KULTIVERT med MS-5 stromal celler i nærvær av cytokiner. Immunophenotypic karakterisering av stammen og stamceller, og de differensiert myelogen avstamning celler er beskrevet. Ved hjelp av denne protokollen, CD34+ celler kan være inkubert med små molekyler eller transduced med lentiviruses å uttrykke myelogen sykdom mutasjoner å undersøke deres innvirkning på myelogen differensiering.

Anvendelse av ovennevnte protokoller gir 5,6 (± 0,5) x 108 MNCs og 1 (± 0,3) x 106 CD34+ celler fra en ledningen blod enhet på ~ 100 ml. Prosentandelen av totalt CD34+ celler varierer mellom 80-90% (figur 2A, B). Immunophenotypic analyse av ordningen beskrevet av Manz et al.5 DEMONSTRERER at CD34+ celler vanligvis består av ~ 20% HSCs og ~ 72% MPPs som er Lin-/CD34+/CD38<...

Watch this Scientific Journal Video about Pan-myeloid Differentiation of Human Cord Blood Derived CD34+ Hematopoietic Stem and Progenitor Cells at JoVE.com

Pan-myeloid Differentiation of Human Cord Blood Derived CD34+ Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Her presenterer vi en protokoll for immunophenotypic karakterisering og cytokin indusert differensiering av ledningen blod avledet CD34+ blodkreft stem og stamceller til de fire myelogen linjene. Anvendelser av denne protokollen inkluderer undersøkelser om effekten av myelogen sykdom mutasjoner eller små molekyler på myelogen differensiering av CD34+ celler.

Pan-myelogen differensiering av Human Cord blod avledet CD34+ blodkreft stem og stamceller

Ex vivo differentiation of human hematopoietic stem cells is a widely used model for studying hematopoiesis. The protocol described here is for cytokine ...

Denne protokollen kan brukes til å studere molekylære og cellulære endringer som oppstår under normal myeloid differensiering av menneskelig CD34 positiv hematopoetisk stamme og stamceller. Den største fordelen med denne protokollen er at den tillater differensiering av CD34 positive celler langs alle fire myeloid avstamninger inkludert megakaryocytes, erytrocytter, granulocytter og monocytter. Å demonstrere prosedyren vil være Aditi Bapat, en post-doc fra laboratoriet mitt.For mononukleær celleisolasjon fra en menneskelig navlestreng blodprøve, sterilisere den ytre overflaten av en pose navlestreng blod med 70% etanol før du overfører posen innholdet i en steril 250 milliliter plastflaske i et biologisk sikkerhetsskap. Fortynn blodet med like mye romtemperatur Hanks bufrede saltvannsløsning, og tilsett 15 milliliter mononukleære cellefraksjonsmedium til hver av fem sterile 50 milliliter koniske rør. Etter mild blanding, hell forsiktig 30 milliliter av det fortynnede navlestrengblodet på det mononukleære fraksjoneringsmediet i hvert rør, og hold de 50 milliliter rørene i en vinkel for å unngå å blande lagene.Skill cellene etter tetthetsgradering sentrifugering, og fjern de øverste 15 til 20 milliliter plasma over det mononukleære cellelaget. Bruk en pipette til å overføre det eksponerte mononukleære cellelaget forsiktig til et nytt 50 milliliter rør, samle de mononukleære cellene fra to til tre rør sammen, og bringe det endelige volumet i hvert rør opp til 50 milliliter med kald PBE-buffer. Pellet de mononukleære celleprøvene ved sentrifugering, og aspirerer supernativa.Trykk forsiktig på hvert rør for å løsne cellepellets, og fortynne pellets i fem milliliter iskald PBE buffer. Kombiner cellene fra tre til fire rør i ett konisk rør på 50 milliliter, og vask alle rørene med fem milliliter fersk PBE-buffer for å samle inn eventuelle gjenværende celler. Etter telling, ta det endelige volumet i røret opp til 50 milliliter med frisk iskald PBE buffer, og samle cellene ved sentrifugering.For å isolere CD34 positive mononukleære celler, re-suspendere pellet i 50 milliliter fersk PBE buffer før samle cellene med en annen sentrifugering. Etter å ha kastet det overnaturlige, trykk forsiktig for å løsne pelleten, og re-suspendere cellene på en gang 10 til de åtte mononukleære cellene per 300 mikroliter iskald PBE bufferkonsentrasjon. Blokker eventuelle uspesifikke bindinger med 100 mikroliter fc reseptorblokkeringsreagens, bland forsiktig, og legg deretter til 100 mikroliter CD34 mikroperler fra et magnetisk aktivert cellesorteringsmenneske CD34 mikroperlesett per en gang 10 til de åtte cellene med mild blanding, og inkuber cellene i 30 minutter ved fire grader Celsius.Mens cellene inkuberer, plasserer du en LS-kolonne og et magnetfelt for forhåndsseparasjon i et MAGNETFELT FOR MACS-skilletegn. Likevekt kolonnen med to milliliter iskald PBE buffer og pre-separasjon filter med en milliliter buffer. La kolonnen tømmes i et konisk rør på 15 milliliter og kast gjennomstrømningen.På slutten av inkubasjonen, ta det endelige volumet av den mononukleære celleprøven opptil 15 milliliter med frisk iskald PBE-buffer og sediment cellene ved sentrifugering. Suspender pelleten på nytt i én milliliter iskald PBE-buffer og last cellene på preseparasjonsfilteret på kolonnen. Skyll røret med tre milliliter frisk iskald PBE-buffer og tilsett bufferen i preseparasjonsfilteret.Vask kolonnen fire ganger med ytterligere tre milliliter iskald PBE-buffer per vask uten filteret, slik at kolonnen kan tømmes helt mellom hver vask. Etter den siste vasken flytter du kolonnen inn i et nytt 15 milliliter rør, og stuper fem milliliter frisk iskald PBE gjennom kolonnen inn i røret. For å bestemme fraksjonene av stamceller og stamceller i den nyisolerte CD34-positive hematopoetiske stammen og stamcellene, samle cellene ved sentrifugering og re-suspendere pelleten på en gang 10 til de seks cellene per 50 mikroliter av strømningscytometribufferkonsentrasjon.Deretter overfører du cellene i 50 mikroliter aliquots per fem milliliter fluorescens aktivert cellesorteringsrør i henhold til den eksperimentelle strømningscytometrifargingsprotokollen. Tilsett riktig antistoffcocktail og levende / død farging til cellene, justere volumet til 100 totale mikroliter. Etter 20 minutter i mørket beskyttet mot lys, vask cellene med en milliliter frisk strømningscytometribuffer per rør, og re-suspendere cellene i 500 mikroliter frisk strømningscytometribuffer per rør.Analyser deretter cellene på et strømningscytometer i henhold til standard strømningscytokometriske protokoller. For å skille mikroperle isolert CD34 positiv stamme og stamceller i myeloid avstamning celler, først belegge brønnene av en steril, ubestrøket 48-brønns plate med 200 mikroliter per brønn av rekombinant human fibronectin løsning i PBS i to timer ved romtemperatur. På slutten av inkubasjonen, kast fibronectinløsningen fra hver brønn og blokker brønnene med 200 mikroliter på 2% storfe serumalbumin.Etter 30 minutter ved romtemperatur vask brønnene to ganger med 500 mikroliter steril PBS per vask. Re-suspendere de nyisolerte CD34 positive celler på en fem ganger 10 de fem cellene per milliliter varm stimulering middels konsentrasjon. Deretter frø 200 mikroliter av celler i hver brønn av fibronectin fragmentbelagt plate og plassere platen i cellekultur inkubatoren i 48 timer.På slutten av inkubasjonen, samle cellene med mild pipettering, og vask brønnene med 500 mikroliter av varmet Dulbeccos modifiserte Eagle medium, pooling vaskene med celle suspensjon. Etter telling, re-suspendere cellene på en 2,5 ganger 10 til de fire cellene per en milliliter myeloid differensiering middels konsentrasjon. Lag 200 mikroliter cd34 positive celler per brønn i en MS-5 stromal celle seeded 48 godt vev kultur plate.Plasser deretter platen i cellekulturinkubatoren, og skift forsiktig ut 100 mikroliter av supernatanten i hver brønn med 100 mikroliter friske 2X myeloid differensieringsmedium hver tredje til fire dager. På dag 21 høster du cellene for analyse av myeloid avstamning markør uttrykk ved flyt cytometri som nettopp demonstrert. Den typiske prosentandelen av totale CD34 positive celler isolert fra ledningsblod ved mikroperleseparasjon som demonstrerte områder mellom 80 til 90% Immunophenotypic analyse avslører at disse CD34 positive cellene vanligvis består av en ca 20% avstamning negativ CD34 positiv CD38 negativ hematopoetisk stamcellepopulasjon og en 72% avstamning negativ CD34 positiv CD38 positiv multi-potent stamcellepopulasjon.Innenfor den multi-potente stamcellepopulasjonen uttrykker ca 25% av cellene vanlige myeloid stamcellemarkører, ca 15% uttrykker granulocytt monocytt stamcellemarkører, og ca 56% uttrykke megakaryocytt erytroid stamcellemarkører. Immunofenotyping viser også at prosentandelen av CD34 positive celler reduseres fra ca 90% i isolasjon til mindre enn 25% på dag 21. Analyse av CD34 negativ populasjon viser en samtidig økning i andelen celler som uttrykker modne myeloide avstamning markører.Videre demonstrerer Wright-Giemsa fargede celler distinkte morfologiske egenskaper på dag én og 21 med de udifferensierte kulturene som viser store, runde kjerner og svært lite cytoplasma og de differensierte kulturene som viser morfologiske egenskaper av slektsceller, inkludert som er monocytter, granulocytter og erytroblaster. Husk å helle det fortynnede ledningsblodet på det mononukleære cellefraksjonsmediet uten å blande lagene, og ikke forstyrre MS-5- og CD34-positive celler når du endrer mediet. Etter denne differensieringsprotokollen kan CD34-positive cellekulturer analyseres for morfologiske endringer, apoptotiske effekter, endringer i cellesyklusmønstre og graden av differensiering.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Pan-myeloid Differentiation of Human Cord Blood Derived CD34+ Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

Direkte Induction of Human Neural stamceller fra perifert blod Hematopoietiske stamceller

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

Isolering av Neural Stem / stamceller fra periventricular Region of Adult Rat and Human Spinal Cord

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues

Isolasjon og Differensiering av adipose-avledet stamceller fra svine Subkutan fettvev

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. ...

Chondrogenic Differentiation Induction of Adipose-derived Stem Cells by Centrifugal Gravity

Chondrogenic Differensiering Induksjon av adipose-avledet stamceller ved Sentrifugal Gravity

Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Rettet differensiering av Primitive og Definitive blodkreft Progenitors fra menneskelige Pluripotent stamceller

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

Differensiering av kondrocytter fra perifert blod-avledede humane inducerte pluripotente stamceller

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Kondrogen pelletsdannelse fra Cord Blood-avledede Induced Pluripotent Stamceller

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...