Name: pan-myeloid differentiation of human cord blood derived cd34+ hematopoietic stem and progenitor cells
Uploaded: 2019-08-09T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pan-myeloid Differentiation of Human Cord Blood Derived CD34+ Hematopoietic Stem and Progenitor Cells at JoVE.com

Los autores quieren agradecer a Wendy Barrett, Rachel Caballero y Gabriella Ruiz de Maricopa Integrated Health Systems por las unidades de sangre de cordón de sin identificación y donado, Mrinalini Kala por la asistencia con la citometría de flujo, y Gay Crooks y Christopher Seet por consejos sobre la diferenciación mieloide ex vivo. Este trabajo fue apoyado por fondos a S.S. de los Institutos Nacionales de Salud (R21CA170786 y R01GM127464) y la Sociedad Americana contra el Cáncer (la Beca de Investigación Institucional 74-001-34-IRG). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.

La sangre del cordón umbilical humano para la experimentación fue donada por individuos sanos después del consentimiento informado a Maricopa Integrated Health Systems (MIHS), Phoenix. Las unidades desidentificadas se obtuvieron a través de un Acuerdo de Transferencia de Materiales entre MIHS y la Universidad de Arizona.
1. Reactivos y búferes
NOTA: Preparar todos los reactivos y tampones en condiciones estériles en un gabinete de seguridad biol...

<ol>
	<li>Hao, Q. L., Shah, A. J., Thiemann, F. T., Smogorzewska, E. M., Crooks, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+comparison+of+CD34+++CD38-+cells+in+cord+blood+and+bone+marrow.">A functional comparison of CD34 + CD38- cells in cord blood and bone marrow.</a> Blood. 86 (10), 3745-3753 (1995).</li><li>Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+isolation+of+human+clonogenic+common+myeloid+progenitors.">Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11872-11877 (2002).</li><li>Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+clonogenic+common+lymphoid+progenitors+in+mouse+bone+marrow.">Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow.</a> Cell. 91 (5), 661-672 (1997).</li><li>Seita, J., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell:+self-renewal+versus+differentiation.">Hematopoietic stem cell: self-renewal versus differentiation.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. 2 (6), 640-653 (2010).</li><li>Haas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation-Induced+Emergency+Megakaryopoiesis+Driven+by+Hematopoietic+Stem+Cell-like+Megakaryocyte+Progenitors.">Inflammation-Induced Emergency Megakaryopoiesis Driven by Hematopoietic Stem Cell-like Megakaryocyte Progenitors.</a> Cell Stem Cell. 17 (4), 422-434 (2015).</li><li>Sanjuan-Pla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-biased+stem+cells+reside+at+the+apex+of+the+haematopoietic+stem-cell+hierarchy.">Platelet-biased stem cells reside at the apex of the haematopoietic stem-cell hierarchy.</a> Nature. 502 (7470), 232-236 (2013).</li><li>Bender, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+and+characterization+of+CD34++cells+from+normal+human+bone+marrow,+cord+blood,+peripheral+blood,+and+mobilized+peripheral+blood+from+patients+undergoing+autologous+stem+cell+transplantation.">Phenotypic analysis and characterization of CD34+ cells from normal human bone marrow, cord blood, peripheral blood, and mobilized peripheral blood from patients undergoing autologous stem cell transplantation.</a> Clinical Immunology and Immunopathology. 70 (1), 10-18 (1994).</li><li>Fritsch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+composition+of+CD34+subpopulations+differs+between+bone+marrow,+blood+and+cord+blood.">The composition of CD34 subpopulations differs between bone marrow, blood and cord blood.</a> Bone Marrow Transplantation. 17 (2), 169-178 (1996).</li><li>Nimgaonkar, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+population+of+CD34++cells+in+cord+blood.">A unique population of CD34+ cells in cord blood.</a> Stem Cells. 13 (2), 158-166 (1995).</li><li>Hordyjewska, A., Popiolek, L., Horecka, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+hematopoietic+stem+cells+of+umbilical+cord+blood.">Characteristics of hematopoietic stem cells of umbilical cord blood.</a> Cytotechnology. 67 (3), 387-396 (2015).</li><li>Bapat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+Disease+Mutations+of+Splicing+Factor+SRSF2+Cause+G2-M+Arrest+and+Skewed+Differentiation+of+Human+Hematopoietic+Stem+and+Progenitor+Cells.">Myeloid Disease Mutations of Splicing Factor SRSF2 Cause G2-M Arrest and Skewed Differentiation of Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells.</a> Stem Cells. 36, 1-13 (2018).</li><li>Yip, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+U2AF1S34F+mutation+induces+lineage-specific+splicing+alterations+in+myelodysplastic+syndromes.">The U2AF1S34F mutation induces lineage-specific splicing alterations in myelodysplastic syndromes.</a> Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2206-2221 (2017).</li><li>Yoo, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+differentiation+of+human+cord+blood+CD34++cells+during+ex+vivo+expansion+using+thrombopoietin,+flt3-ligand+and/or+granulocyte-colony+stimulating+factor.">Myeloid differentiation of human cord blood CD34+ cells during ex vivo expansion using thrombopoietin, flt3-ligand and/or granulocyte-colony stimulating factor.</a> British Journal of Haematology. 105 (4), 1034-1040 (1999).</li><li>Hao, Q. L., Smogorzewska, E. M., Barsky, L. W., Crooks, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+identification+of+single+CD34+CD38-+cells+with+both+lymphoid+and+myeloid+potential.">In vitro identification of single CD34+CD38- cells with both lymphoid and myeloid potential.</a> Blood. 91 (11), 4145-4151 (1998).</li><li>Moretta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+generation+of+human+innate+lymphoid+cells+is+influenced+by+the+source+of+hematopoietic+stem+cells+and+by+the+use+of+G-CSF.">The generation of human innate lymphoid cells is influenced by the source of hematopoietic stem cells and by the use of G-CSF.</a> European Journal of Immunology. 46 (5), 1271-1278 (2016).</li><li>Sanz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ordering+human+CD34+CD10-CD19++pre/pro-B-cell+and+CD19-+common+lymphoid+progenitor+stages+in+two+pro-B-cell+development+pathways.">Ordering human CD34+CD10-CD19+ pre/pro-B-cell and CD19- common lymphoid progenitor stages in two pro-B-cell development pathways.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5925-5930 (2010).</li><li>Egeland, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+differentiation+of+purified+CD34++cells+after+stimulation+with+recombinant+human+granulocyte-monocyte+colony-stimulating+factor+(CSF),+granulocyte-CSF,+and+interleukin-3.">Myeloid differentiation of purified CD34+ cells after stimulation with recombinant human granulocyte-monocyte colony-stimulating factor (CSF), granulocyte-CSF, and interleukin-3.</a> Blood. 78 (12), 3192-3199 (1991).</li><li>Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+proliferation+of+hematopoietic+stem+cells.">Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells.</a> Blood. 81 (11), 2844-2853 (1993).</li><li>Perdomo, J., Yan, F., Leung, H. H. L., Chong, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megakaryocyte+Differentiation+and+Platelet+Formation+from+Human+Cord+Blood-derived+CD34++Cells.">Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), e56420 (2017).</li><li>Palii, C. G., Pasha, R., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral-mediated+knockdown+during+ex+vivo+erythropoiesis+of+human+hematopoietic+stem+cells.">Lentiviral-mediated knockdown during ex vivo erythropoiesis of human hematopoietic stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (53), e2813 (2011).</li><li>Davies, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+ASXL1+impairs+the+granulomonocytic+lineage+potential+of+human+CD34(+)+progenitor+cells.">Silencing of ASXL1 impairs the granulomonocytic lineage potential of human CD34(+) progenitor cells.</a> British Journal of Haematology. 160 (6), 842-850 (2013).</li><li>Caceres, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TP53+suppression+promotes+erythropoiesis+in+del(5q)+MDS,+suggesting+a+targeted+therapeutic+strategy+in+lenalidomide-resistant+patients.">TP53 suppression promotes erythropoiesis in del(5q) MDS, suggesting a targeted therapeutic strategy in lenalidomide-resistant patients.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16127-16132 (2013).</li><li>Shi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ASXL1+plays+an+important+role+in+erythropoiesis.">ASXL1 plays an important role in erythropoiesis.</a> Scientific Reports. 6, 28789 (2016).</li><li>Mazumdar, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukemia-Associated+Cohesin+Mutants+Dominantly+Enforce+Stem+Cell+Programs+and+Impair+Human+Hematopoietic+Progenitor+Differentiation.">Leukemia-Associated Cohesin Mutants Dominantly Enforce Stem Cell Programs and Impair Human Hematopoietic Progenitor Differentiation.</a> Cell Stem Cell. 17 (6), 675-688 (2015).</li><li>Chung, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enforced+expression+of+an+Flt3+internal+tandem+duplication+in+human+CD34++cells+confers+properties+of+self-renewal+and+enhanced+erythropoiesis.">Enforced expression of an Flt3 internal tandem duplication in human CD34+ cells confers properties of self-renewal and enhanced erythropoiesis.</a> Blood. 105 (1), 77-84 (2005).</li><li>Ambrosini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-1beta+inhibits+ILC3+while+favoring+NK-cell+maturation+of+umbilical+cord+blood+CD34(+)+precursors.">IL-1beta inhibits ILC3 while favoring NK-cell maturation of umbilical cord blood CD34(+) precursors.</a> European Journal of Immunology. 45 (7), 2061-2071 (2015).</li><li>Batard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-(beta)1+maintains+hematopoietic+immaturity+by+a+reversible+negative+control+of+cell+cycle+and+induces+CD34+antigen+up-modulation.">TGF-(beta)1 maintains hematopoietic immaturity by a reversible negative control of cell cycle and induces CD34 antigen up-modulation.</a> Journal of Cell Science. 113, 383-390 (2000).</li><li>Huang, N., Lou, M., Liu, H., Avila, C., Ma, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+potent+small+molecule+capable+of+regulating+polyploidization,+megakaryocyte+maturation,+and+platelet+production.">Identification of a potent small molecule capable of regulating polyploidization, megakaryocyte maturation, and platelet production.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 9 (1), 136 (2016).</li></ol>

El protocolo descrito aquí es adecuado para la diferenciación ex vivo de CD34+ HSCCP derivados ucB a los cuatro linajes mieloides. La incubación inicial con una mezcla de citoquinas que consiste en Células SCF, TPO, Flt3L e IL3 estimula las células CD34+. Posteriormente, la diferenciación se logra con un cóctel de SCF, IL3, Flt3L, EPO y TPO. En esta mezcla, SCF, IL3 y Flt3L son importantes para la supervivencia y proliferación de CD34+ HSCs. EPO y TPO promueven la diferenciación ...

La diferenciación normal de las células madre hematopoyéticas (HSC) es fundamental para el mantenimiento de los niveles fisiológicos de todos los linajes de células sanguíneas. Durante la diferenciación, en una respuesta coordinada a las señales extracelulares, incluidos los factores de crecimiento y las citoquinas, los HSC dan lugar primero a células progenitoras multipotentes (MPP) que tienen potencial linfo-mieloides1,2,3 ,4 (Figura 1). Los PMP dan lugar a progenitores mieloides comunes (CMP) y progenitores linfoides comunes (CLP) que están restringidos al linaje. Los CLP se diferencian en los linajes linfoides compuestos por Células, T y células asesinas naturales. Los CMP generan los linajes mieloides a través de dos poblaciones de progenitores más restringidas, progenitores de eritroides de megacarilocitos (MEP) y progenitores de monocitos granulocitos (GMP). Los eurodiputados dan lugar a megacariocitos y eritrocitos, mientras que los GMP dan lugar a granulocitos y monocitos. Además de surgir a través de los CMP, se ha informado que los megacariocitostambién surgen directamente de los HSC o de los primeros PMP a través de vías no canónicas 5,6.
Las células hematopoyéticas del tallo y del progenitor (HSPC) se caracterizan por el marcador de superficie CD34 y la falta de marcadores específicos de linaje (Lin-). Otros marcadores de superficie que se emplean comúnmente para distinguir las poblaciones de Progenitores DeSC y mieloides incluyen CD38, CD45RA y CD1232 (Figura1). Los HSC y los MPP son Lin-/CD34+/CD38- y Lin-/CD34+/CD38+, respectivamente. Las poblaciones de progenitores comprometidos mieloides se distinguen por la presencia o ausencia de CD45RA y CD123. Los CMP son Lin-/CD34+/CD38+/CD45RA-/CD123lo, los GMP son Lin-/CD34+/CD38+/CD45RA+/CD123lo, y los MEP son Lin-/CD34+ /CD38+/CD45RA-/CD123-.
La población total decélulas madre y progenitora CD34 se puede obtener de la sangre del cordón umbilical humano (UCB), la médula ósea y la sangre periférica. CD34+ células constituyen 0.02% a 1.46% del total de células mononucleares (MNC) en UCB humano, mientras que su porcentaje varía entre 0.5% y 5.3% en la médula ósea y es mucho menor a 0.01% en sangre periférica7,8,9 . La capacidad proliferativa y el potencial de diferenciación de las células UCB derivadas CD34+ es significativamente mayor que la de la médula ósea o las células sanguíneas periféricas1,10, ofreciendo así una clara ventaja para obtener material suficiente para los análisis moleculares en combinación con la realización de caracterización inmunofenotípica y morfológica de las células durante la diferenciación.
La diferenciación ex vivo de la sangre del cordón umbilical derivada de CD34+ HSPCs es un modelo ampliamente aplicado para investigar los mecanismos normales de la hematopoyesis y la enfermedad hematopoyética. Cuando se cultiva con las citoquinas apropiadas, los UCB CD34+ HSCCP pueden ser inducidos a diferenciar a lo largo de los linajes mieloides o linfoides11,12,13,14,15 , 16. Aquí, describimos protocolos para el aislamiento y la caracterización inmunofenotípica de los CD34+ HSCCP de UCB humano, y para su diferenciación a las células de linaje mieloides. Este sistema de cultivo se basa en la diferenciación inducida por citoquinas de los HSCCP en presencia de células estromales MS-5 para imitar el microambiente en la médula ósea. Las condiciones de cultivo causan una expansión inicial de las células CD34 +, seguidas de su diferenciación a las células que expresan marcadores para las cuatro células de linaje mieloides, a saber, granulocitos (CD66b), monocitos (CD14), megacariocitos (CD41) y eritrocitos (CD235a). Las aplicaciones del protocolo CD34+ diferenciación celular incluyen estudios sobre mecanismos moleculares que regulan la hematopoyesis, y investigaciones sobre el impacto de mutaciones asociadas a la enfermedad mieloide y moléculas pequeñas en la auto-renovación y la auto-renovación y diferenciación de los HSCCP.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:785px;" width="786">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">0.4% Trypan blue solution</td>
			<td style="width:112px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15250-061</td>
			<td style="width:339px;">Dilute working stock to 0.2% in sterile 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">0.5 M UltraPure Ethylene diamine tetra acetic acid, pH 8.0</td>
			<td style="width:112px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:119px;">15575-038</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">10x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:112px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">14185052</td>
			<td style="width:339px;">Dilute to 1x with sterile distilled water &#38; pH to 7.2</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">2.5% Trypsin, no phenol red</td>
			<td style="width:112px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15090046</td>
			<td style="width:339px;">Dilute working stock to 1x with sterile 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">30 &#181;m Pre-separation filters</td>
			<td style="width:112px;">Miltenyi biotech</td>
			<td style="width:119px;">130-041-407</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">35% sterile Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A7979</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">7-AAD</td>
			<td style="width:112px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">420404</td>
			<td style="width:339px;">Used as a live/dead stain to eliminate dead cells from FACS analysis</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-human CD10-FITC antibody (Clone HI10a)</td>
			<td style="width:112px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">312207</td>
			<td style="width:339px;">Use 1:20 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Anti-human CD11b-FITC (activated) antibody (Clone CBRM1/5)</td>
			<td style="width:112px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">301403</td>
			<td style="width:339px;">Use 1:5 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-human CD123-APC antibody (Clone 6H6)</td>
			<td style="width:112px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">306012</td>
			<td style="width:339px;">Use 1:20 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-human CD14-PE antibody (Clone M5E2)</td>
			<td style="width:112px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">301806</td>
			<td style="width:339px;">Use 1:20 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-human CD19-FITC antibody (Clone 4G7)</td>
			<td style="width:112px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">347543</td>
			<td style="width:339px;">Use 1:5 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-human CD235a-APC antibody (Clone GA-R2 (HIR2))</td>
			<td style="width:112px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">551336</td>
			<td style="width:339px;">Use 1:20 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-human CD235a-FITC antibody (Clone HIR2)</td>
			<td style="width:112px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">306609</td>
			<td style="width:339px;">Use 1:50 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-human CD34-APC-Cy7 antibody (Clone 581)</td>
			<td style="width:112px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">343514</td>
			<td style="width:339px;">Use 1:20 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-human CD38-PE antibody (Clone HIT2)</td>
			<td style="width:112px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">303506</td>
			<td style="width:339px;">Use 1:20 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-human CD3-FITC antibody (Clone UCHT1)</td>
			<td style="width:112px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">300405</td>
			<td style="width:339px;">Use 1:20 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-human CD41a-PerCP-Cy5.5 antibody (Clone HIP8)</td>
			<td style="width:112px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">303720</td>
			<td style="width:339px;">Use 1:20 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-human CD45Ra-PE-Cy7 antibody (Clone HI100)</td>
			<td style="width:112px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">304126</td>
			<td style="width:339px;">Use 1:20 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-human CD66b-PE-Cy7 antibody (Clone G10F5)</td>
			<td style="width:112px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">305116</td>
			<td style="width:339px;">Use 1:20 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-human CD7-FITC antibody (Clone CD7-6B7)</td>
			<td style="width:112px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">343103</td>
			<td style="width:339px;">Use 1:20 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP231-100</td>
			<td style="width:339px;">Filter sterilize before use</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM) powder with L-Glutamine&#160;</td>
			<td style="width:112px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">12100046</td>
			<td style="width:339px;">Reconstitute 1 packet to make 1 L of DMEM media&#160; with sodium bicarbonate, 10% FBS &#38; 1% penicillin &#38; streptomycin&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Fetal bovine serum, Australian source, heat inactivated</td>
			<td style="width:112px;">Omega Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB-22 Lot #609716</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Human CD34 microbead kit&#160;</td>
			<td style="width:112px;">Miltenyi biotech</td>
			<td style="width:119px;">130-046-702</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Human Thrombopoietin (TPO), research grade</td>
			<td style="width:112px;">Miltenyi biotech</td>
			<td style="width:119px;">130-094-011</td>
			<td style="width:339px;">Make a stock of 100 &#181;g/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 50 ng/mL for both myeloid differentiation &#38; stimulation medium</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:112px;">Omega Scientific</td>
			<td style="width:119px;">GS-60</td>
			<td style="width:339px;">2 mM concentration in stimulation medium</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">LS Columns</td>
			<td style="width:112px;">Miltenyi biotech</td>
			<td style="width:119px;">130-042-401</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">MACS Multi stand</td>
			<td style="width:112px;">Miltenyi biotech</td>
			<td style="width:119px;">130-042-303</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">MidiMACS magnetic separator</td>
			<td style="width:112px;">Miltenyi biotech</td>
			<td style="width:119px;">130-042-302</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">MNC fractionation media (Ficol-Paque PLUS)</td>
			<td style="width:112px;">GE Healthcare Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">17-1440-03</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">MS-5 cells</td>
			<td style="width:112px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:339px;">Gift from the laboratory of Gay Crooks, UCLA</td>
		</tr>
		<tr height="148">
			<td height="148" style="height:148px;width:216px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P6148</td>
			<td style="width:339px;">Heat 800 mL of 1x PBS in a glass beaker on a stir plate in a chemical hood to ~65 &#176;C. Add 10 g of paraformaldehyde powder. To completely dissolve the paraformaldehyde, raise the pH by adding 1 N NaOH. Cool and filter the solution and make up the volume to 1 L with 1x PBS. Adjust the pH to 7.2.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Penicillin &#38; Streptomycin</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P4458-100ml</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Poly-L lysine</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P2636</td>
			<td style="width:339px;">Make a 10 mg/mL stock in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Recombinant human erythropoietin-alpha (rHu EPO-&#945;)</td>
			<td style="width:112px;">BioBasic</td>
			<td style="width:119px;">RC213-15</td>
			<td style="width:339px;">Make a stock of 2000 units/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 4 units/mL for myeloid differentiation</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Recombinant human fibronectin fragment (RetroNectin)</td>
			<td style="width:112px;">Takara&#160;</td>
			<td style="width:119px;">T100B</td>
			<td style="width:339px;">Use 20 &#181;g/mL diluted in sterile 1x PBS to coat wells prior to stimulation of CD34+ HSCs.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Recombinant human Flt-3 ligand (rHu Flt-3L)</td>
			<td style="width:112px;">BioBasic</td>
			<td style="width:119px;">RC214-16</td>
			<td style="width:339px;">Make a stock of 100 &#181;g/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation &#38; 50 ng/mL in stimulation medium</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Recombinant human interleukin-3 (rHu IL-3)</td>
			<td style="width:112px;">BioBasic</td>
			<td style="width:119px;">RC212-14</td>
			<td style="width:339px;">Make a stock of 100 &#181;g/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation &#38; 20 ng/mL in stimulation medium</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Recombinant human stem cell factor (rHu SCF)</td>
			<td style="width:112px;">BioBasic</td>
			<td style="width:119px;">RC213-12</td>
			<td style="width:339px;">Make a stock of 100 &#181;g/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation &#38; 50 ng/mL in stimulation medium</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Serum free medium (X-Vivo-15)</td>
			<td style="width:112px;">Lonza&#160;</td>
			<td style="width:119px;">04-418Q</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP328-500</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Wright-Giemsa stain, modified</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">WG16-500</td>
			<td style="width:339px;">Use according to manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Equipment&#160;</td>
			<td style="width:112px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">BD LSR II flow cytometer</td>
			<td style="width:112px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:112px;">Sorvall Legend RT</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Light microscope</td>
			<td style="width:112px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pan-myeloid differentiation of human cord blood derived cd34+ hematopoietic stem and progenitor cells

La diferenciación ex vivo de células madre hematopoyéticas humanas es un modelo ampliamente utilizado para estudiar la hematopoyesis. El protocolo descrito aquí es para la diferenciación inducida por citoquinas de CD34+ células madre hematopoyéticas y células progenitoras a las cuatro células de linaje mieloides. CD34+ células están aisladas de la sangre del cordón umbilical humano y co-cultivadas con células estromales MS-5 en presencia de citoquinas. Se describe la caracterización inmunofenotípica de las células madre y progenitora, y las células de linaje mieloides diferenciadas. Usando este protocolo, las células CD34+ pueden ser incubadas con moléculas pequeñas o transducidas con lentivirus para expresar mutaciones de la enfermedad mieloide para investigar su impacto en la diferenciación mieloide.

La aplicación de los protocolos anteriores produce 5,6 (a 0,5) x 108 MNCs y 1 (a 0,3) x 106 CD34+ células de una unidad de sangre de cordón umbilical de 100 ml. El porcentaje del total de CD34+ celdas oscila entre 80-90% (Figura2A,B). 5 demuestra que las células CD34+ consisten típicamente en HSC s20% y MPP de 72% que son Lin-/CD34 + /CD3...

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Pan-myeloid Differentiation of Human Cord Blood Derived CD34+ Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Aquí, presentamos un protocolo para la caracterización inmunophenotípica y la diferenciación inducida por citoquinas de la sangre de cordón umbilical derivada CD34+ células madre hematopoyéticas y células progenitoras a los cuatro linajes mieloides. Las aplicaciones de este protocolo incluyen investigaciones sobre el efecto de mutaciones de la enfermedad mieloide o moléculas pequeñas en la diferenciación mieloide de las células CD34+.

Diferenciación panmieloide de la sangre de cordón humano derivada CD34+ Células hematopoyéticas del tallo y progenitor

Ex vivo differentiation of human hematopoietic stem cells is a widely used model for studying hematopoiesis. The protocol described here is for cytokine ...

Este protocolo se puede utilizar para estudiar los cambios moleculares y celulares que se producen durante la diferenciación mieloide normal del tallo hematopoyético positivo CD34 humano y las células progenitoras. La principal ventaja de este protocolo es que permite la diferenciación de células positivas CD34 a lo largo de los cuatro linajes mieloides incluyendo megacariocitos, eritrocitos, granulocitos y monocitos. Demostrando el procedimiento estará Aditi Bapat, un post-doc de mi laboratorio.Para el aislamiento de células mononucleares de una muestra de sangre de cordón umbilical humano, esterilizar la superficie externa de una bolsa de sangre de cordón umbilical con 70% etanol antes de transferir el contenido de la bolsa a una botella de plástico estéril de 250 mililitros dentro de un gabinete de seguridad biológica. Diluir la sangre con un volumen igual de la solución salina tamponada de Hank a temperatura ambiente, y añadir 15 mililitros de medio de fraccionamiento celular mononuclear a cada uno de los cinco tubos cónicos estériles de 50 mililitros. Después de una mezcla suave, vierta cuidadosamente 30 mililitros de la sangre del cordón umbilical diluido en el medio de fraccionamiento mononuclear en cada tubo, sosteniendo los tubos de 50 mililitros en un ángulo para ayudar a evitar mezclar las capas.Separe las células por centrifugación de gradiente de densidad, y retire los 15 a 20 mililitros superiores de plasma por encima de la capa de célula mononuclear. Utilice una pipeta para transferir cuidadosamente la capa de celda mononuclear expuesta a un nuevo tubo de 50 mililitros, juntando las células mononucleares de dos a tres tubos juntos, y lleve el volumen final en cada tubo hasta 50 mililitros con tampón PBE frío. Pele el mononuclear de las muestras de células por centrifugación, y aspirar a los sobrenadantes.Toque suavemente cada tubo para aflojar los pellets de la célula y diluir los pellets en cinco mililitros de tampón PBE helado. Combine las células de tres a cuatro tubos en un tubo cónico de 50 mililitros, y lave todos los tubos con cinco mililitros de tampón PBE fresco para recoger las células restantes. Después de contar, traiga el volumen final en el tubo hasta 50 mililitros con tampón PBE helado fresco, y recoja las células por centrifugación.Para aislar las células mononucleares positivas CD34, vuelva a suspender el pellet en 50 mililitros de tampón PBE fresco antes de recoger las células con otra centrifugación. Después de desechar el sobrenadante, toque suavemente para aflojar el pellet y vuelva a suspender las células en una de las 10 a las ocho células mononucleares por cada 300 microlitros de concentración de Tampón PBE helada. Bloquee cualquier unión inespecífica con 100 microlitros del reactivo de bloqueo del receptor Fc, mezcle suavemente y luego agregue 100 microlitros de microperlas CD34 de un kit de micropera CD34 humano de clasificación celular activado magnética por uno por 10 a las ocho células con mezcla suave, e incubar las células durante 30 minutos a cuatro grados Celsius.Mientras las células están incubando, coloque una columna LS y un filtro de preseparación en un campo magnético separador MACS. Equilibre la columna con dos mililitros de tampón PBE helado y el filtro de preseseleccionado con un mililitro de tampón. Deje que la columna se vacíe en un tubo cónico de 15 mililitros y deseche el flujo a través.Al final de la incubación, llevar el volumen final de la muestra de célula mononuclear hasta 15 mililitros con lúxifado PBE frío fresco y sedimentar las células por centrifugación. Vuelva a suspender el pellet en un mililitro de tampón PBE helado y cargue las células en el filtro de preseselección en la columna. Enjuague el tubo con tres mililitros de tampón PBE frío y añada el tampón al filtro de presegueta.Lave la columna cuatro veces con otros tres mililitros de tampón de PBE helado por lavado sin el filtro, lo que permite que la columna drene completamente entre cada lavado. Después del lavado final, mueva la columna a un nuevo tubo de 15 mililitros y sumerja cinco mililitros de PBE frío fresco a través de la columna en el tubo. Para determinar las fracciones de las poblaciones de tallo y progenitor en el recién aislado CD34 positivo células madre y progenitora, recoger las células por centrifugación y re-suspender el pellet en un uno veces 10 a las seis células por cada 50 microlitros de concentración de tampón de citometría de flujo.A continuación, transfiera las células en 50 alícuotas de microlitros por tubo de clasificación celular activado por fluorescencia de cinco mililitros de acuerdo con el protocolo experimental de tinción de citometría de flujo. Agregue el cóctel de anticuerpos adecuado y la tinción viva/muerta a las células, ajustando el volumen a 100 microlitros totales. Después de 20 minutos en la oscuridad protegido de la luz, lave las células con un mililitro de tampón de citometría de flujo fresco por tubo, y vuelva a suspender las células en 500 microlitros de tampón de citometría de flujo fresco por tubo.Luego analice las células en un citometro de flujo de acuerdo con los protocolos citométricos de flujo estándar. Para diferenciar las células positivas CD34 aisladas de microperla en células de linaje mieloide, cubra primero los pozos de una placa estéril de 48 pozos sin recubrimiento con 200 microlitros por pozo de solución de fibronectina humana recombinante en PBS durante dos horas a temperatura ambiente. Al final de la incubación, deseche la solución de fibronectina de cada pozo y bloquee los pozos con 200 microlitros de albúmina sérica 2%bovina.Después de 30 minutos a temperatura ambiente, lave los pozos dos veces con 500 microlitros de PBS estériles por lavado. Re-suspender las células positivas CD34 recién aisladas a cinco veces 10 las cinco células por mililitro de concentración media de estimulación caliente. A continuación, sembrar 200 microlitros de células en cada pozo de la placa recubierta de fragmento de fibronectina y colocar la placa en la incubadora de cultivo celular durante 48 horas.Al final de la incubación, recoger las células con pipeteo suave, y lavar los pozos con 500 microlitros de caliente Dulbecco modificado Medio Eagle, la agrupación de los lavados con la suspensión celular. Después de contar, vuelva a suspender las células a una concentración media de diferenciación de 2,5 veces 10 por mililitro de mieloide. Microlitros de capa 200 de células positivas CD34 por pozo en una placa de cultivo de tejido MS-5 sembrada de células estromales 48 pozos.A continuación, coloque la placa en la incubadora de cultivo celular, reemplazando suavemente 100 microlitros del sobrenadante en cada pozo con 100 microlitros de medio de diferenciación mieloide 2X fresco cada tres a cuatro días. En el día 21, cosecha las células para el análisis de la expresión del marcador de linaje mieloide por citometría de flujo como se acaba de demostrar. El porcentaje típico de células positivas CD34 totales aisladas de la sangre del cordón umbilical por separación de microperas, como lo demuestra, oscila entre el 80 y el 90%Análisis inmunofenotípico revela que estas células positivas CD34 suelen consistir en una población de células madre hematopoyéticas positivas CD38 CD38 positivas de aproximadamente 20%linaje y una población de células madre vugeno positiva CD38.Dentro de la población multitenidor de células progenitoras, alrededor del 25% de las células expresan marcadores comunes de progenitores mieloides, alrededor del 15% marcadores de progenitor de monocitos de granulocitos expresos, y alrededor del 56% expresan marcadores de progenitor de megacariocitos eritroideos exprés. El inmunofenotipado también demuestra que el porcentaje de células positivas CD34 reduce de aproximadamente 90%en aislamiento a menos del 25% en el día 21. El análisis de la población negativa CD34 demuestra un aumento concomitante en el porcentaje de células que expresan marcadores de linaje mieloide maduros.Además, las células manchadas Wright-Giemsa demuestran características morfológicas distintas en los días uno y 21 con los cultivos indiferenciados que exhiben núcleos grandes y redondos y muy poco citoplasma y los cultivos diferenciados que muestran características morfológicas de las células de linaje, incluyendo los cuales son monocitos, granulocitos y eritroblastos. Recuerde verter la sangre del cordón umbilical diluido en el medio de fraccionamiento de células mononucleares sin mezclar las capas, y no perturbe las células positivas MS-5 y CD34 al cambiar el medio. Siguiendo este protocolo de diferenciación, los cultivos celulares positivos CD34 se pueden analizar en busca de cambios morfológicos, efectos apoptóticos, cambios en los patrones de ciclo celular y el grado de diferenciación.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Pan-myeloid Differentiation of Human Cord Blood Derived CD34+ Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

La inducción directa de las células madre neurales humanas a partir de células de sangre periférica progenitoras hematopoyéticas

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

Aislamiento de células neurales madre / progenitoras de la región periventricular de la rata de Adultos y de la médula espinal humana

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues

El aislamiento y la diferenciación de células madre derivadas de tejido adiposo subcutáneo de la especie porcina tejidos adiposos

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. ...

Chondrogenic Differentiation Induction of Adipose-derived Stem Cells by Centrifugal Gravity

La diferenciación condrogénica de inducción de las células madre derivadas de tejido adiposo por la gravedad centrífuga

Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Dirige la diferenciación de progenitores hematopoyéticos primitivo y definitivo de las células madre Pluripotent humanas

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

Diferenciación de los condrocitos de las células madre pluripotentes humanas inducidas por la sangre periféricas derivadas de la sangre

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Formación de gránulos condrogénicos a partir de células madre pluripotentes inducidas derivadas de sangre del cordón umbilical

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...