Name: pan-myeloid differentiation of human cord blood derived cd34+ hematopoietic stem and progenitor cells
Uploaded: 2019-08-09T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pan-myeloid Differentiation of Human Cord Blood Derived CD34+ Hematopoietic Stem and Progenitor Cells at JoVE.com

Författarna vill tacka Wendy Barrett, Rachel Caballero, och Gabriella Ruiz av Maricopa integrerat hälsosystem för de identifierade och donerade navelsträngsblod enheter, Mrinalini kala för hjälp med flödescytometri, och homosexuella skurkar och Christopher seet för och råd om myeloisk ex vivo-differentiering. Detta arbete stöddes av medel till S.S. från National Institutes of Health (R21CA170786 och R01GM127464) och American Cancer Society (det institutionella Forskningsbidraget 74-001-34-IRG). Innehållet är uteslutande författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de officiella åsikter som finns hos National Institutes of Health.

Human navelsträngsblod för experiment skänktes av friska individer efter informerat samtycke till Maricopa Integrated Health Systems (MIHS), Phoenix. De deidentifierade enheterna erhölls genom ett material överföringsavtal mellan MIHS och University of Arizona.
1. reagenser och buffertar
Anmärkning: Bered alla reagenser och buffertar under sterila förhållanden i ett biologiskt säkerhetsskåp.
<ol><li>Förbered steril PBS-BSA-EDTA (PBE) b...

<ol>
	<li>Hao, Q. L., Shah, A. J., Thiemann, F. T., Smogorzewska, E. M., Crooks, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+comparison+of+CD34+++CD38-+cells+in+cord+blood+and+bone+marrow.">A functional comparison of CD34 + CD38- cells in cord blood and bone marrow.</a> Blood. 86 (10), 3745-3753 (1995).</li><li>Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+isolation+of+human+clonogenic+common+myeloid+progenitors.">Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11872-11877 (2002).</li><li>Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+clonogenic+common+lymphoid+progenitors+in+mouse+bone+marrow.">Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow.</a> Cell. 91 (5), 661-672 (1997).</li><li>Seita, J., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell:+self-renewal+versus+differentiation.">Hematopoietic stem cell: self-renewal versus differentiation.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. 2 (6), 640-653 (2010).</li><li>Haas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation-Induced+Emergency+Megakaryopoiesis+Driven+by+Hematopoietic+Stem+Cell-like+Megakaryocyte+Progenitors.">Inflammation-Induced Emergency Megakaryopoiesis Driven by Hematopoietic Stem Cell-like Megakaryocyte Progenitors.</a> Cell Stem Cell. 17 (4), 422-434 (2015).</li><li>Sanjuan-Pla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-biased+stem+cells+reside+at+the+apex+of+the+haematopoietic+stem-cell+hierarchy.">Platelet-biased stem cells reside at the apex of the haematopoietic stem-cell hierarchy.</a> Nature. 502 (7470), 232-236 (2013).</li><li>Bender, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+and+characterization+of+CD34++cells+from+normal+human+bone+marrow,+cord+blood,+peripheral+blood,+and+mobilized+peripheral+blood+from+patients+undergoing+autologous+stem+cell+transplantation.">Phenotypic analysis and characterization of CD34+ cells from normal human bone marrow, cord blood, peripheral blood, and mobilized peripheral blood from patients undergoing autologous stem cell transplantation.</a> Clinical Immunology and Immunopathology. 70 (1), 10-18 (1994).</li><li>Fritsch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+composition+of+CD34+subpopulations+differs+between+bone+marrow,+blood+and+cord+blood.">The composition of CD34 subpopulations differs between bone marrow, blood and cord blood.</a> Bone Marrow Transplantation. 17 (2), 169-178 (1996).</li><li>Nimgaonkar, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+population+of+CD34++cells+in+cord+blood.">A unique population of CD34+ cells in cord blood.</a> Stem Cells. 13 (2), 158-166 (1995).</li><li>Hordyjewska, A., Popiolek, L., Horecka, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+hematopoietic+stem+cells+of+umbilical+cord+blood.">Characteristics of hematopoietic stem cells of umbilical cord blood.</a> Cytotechnology. 67 (3), 387-396 (2015).</li><li>Bapat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+Disease+Mutations+of+Splicing+Factor+SRSF2+Cause+G2-M+Arrest+and+Skewed+Differentiation+of+Human+Hematopoietic+Stem+and+Progenitor+Cells.">Myeloid Disease Mutations of Splicing Factor SRSF2 Cause G2-M Arrest and Skewed Differentiation of Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells.</a> Stem Cells. 36, 1-13 (2018).</li><li>Yip, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+U2AF1S34F+mutation+induces+lineage-specific+splicing+alterations+in+myelodysplastic+syndromes.">The U2AF1S34F mutation induces lineage-specific splicing alterations in myelodysplastic syndromes.</a> Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2206-2221 (2017).</li><li>Yoo, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+differentiation+of+human+cord+blood+CD34++cells+during+ex+vivo+expansion+using+thrombopoietin,+flt3-ligand+and/or+granulocyte-colony+stimulating+factor.">Myeloid differentiation of human cord blood CD34+ cells during ex vivo expansion using thrombopoietin, flt3-ligand and/or granulocyte-colony stimulating factor.</a> British Journal of Haematology. 105 (4), 1034-1040 (1999).</li><li>Hao, Q. L., Smogorzewska, E. M., Barsky, L. W., Crooks, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+identification+of+single+CD34+CD38-+cells+with+both+lymphoid+and+myeloid+potential.">In vitro identification of single CD34+CD38- cells with both lymphoid and myeloid potential.</a> Blood. 91 (11), 4145-4151 (1998).</li><li>Moretta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+generation+of+human+innate+lymphoid+cells+is+influenced+by+the+source+of+hematopoietic+stem+cells+and+by+the+use+of+G-CSF.">The generation of human innate lymphoid cells is influenced by the source of hematopoietic stem cells and by the use of G-CSF.</a> European Journal of Immunology. 46 (5), 1271-1278 (2016).</li><li>Sanz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ordering+human+CD34+CD10-CD19++pre/pro-B-cell+and+CD19-+common+lymphoid+progenitor+stages+in+two+pro-B-cell+development+pathways.">Ordering human CD34+CD10-CD19+ pre/pro-B-cell and CD19- common lymphoid progenitor stages in two pro-B-cell development pathways.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5925-5930 (2010).</li><li>Egeland, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+differentiation+of+purified+CD34++cells+after+stimulation+with+recombinant+human+granulocyte-monocyte+colony-stimulating+factor+(CSF),+granulocyte-CSF,+and+interleukin-3.">Myeloid differentiation of purified CD34+ cells after stimulation with recombinant human granulocyte-monocyte colony-stimulating factor (CSF), granulocyte-CSF, and interleukin-3.</a> Blood. 78 (12), 3192-3199 (1991).</li><li>Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+proliferation+of+hematopoietic+stem+cells.">Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells.</a> Blood. 81 (11), 2844-2853 (1993).</li><li>Perdomo, J., Yan, F., Leung, H. H. L., Chong, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megakaryocyte+Differentiation+and+Platelet+Formation+from+Human+Cord+Blood-derived+CD34++Cells.">Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), e56420 (2017).</li><li>Palii, C. G., Pasha, R., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral-mediated+knockdown+during+ex+vivo+erythropoiesis+of+human+hematopoietic+stem+cells.">Lentiviral-mediated knockdown during ex vivo erythropoiesis of human hematopoietic stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (53), e2813 (2011).</li><li>Davies, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+ASXL1+impairs+the+granulomonocytic+lineage+potential+of+human+CD34(+)+progenitor+cells.">Silencing of ASXL1 impairs the granulomonocytic lineage potential of human CD34(+) progenitor cells.</a> British Journal of Haematology. 160 (6), 842-850 (2013).</li><li>Caceres, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TP53+suppression+promotes+erythropoiesis+in+del(5q)+MDS,+suggesting+a+targeted+therapeutic+strategy+in+lenalidomide-resistant+patients.">TP53 suppression promotes erythropoiesis in del(5q) MDS, suggesting a targeted therapeutic strategy in lenalidomide-resistant patients.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16127-16132 (2013).</li><li>Shi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ASXL1+plays+an+important+role+in+erythropoiesis.">ASXL1 plays an important role in erythropoiesis.</a> Scientific Reports. 6, 28789 (2016).</li><li>Mazumdar, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukemia-Associated+Cohesin+Mutants+Dominantly+Enforce+Stem+Cell+Programs+and+Impair+Human+Hematopoietic+Progenitor+Differentiation.">Leukemia-Associated Cohesin Mutants Dominantly Enforce Stem Cell Programs and Impair Human Hematopoietic Progenitor Differentiation.</a> Cell Stem Cell. 17 (6), 675-688 (2015).</li><li>Chung, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enforced+expression+of+an+Flt3+internal+tandem+duplication+in+human+CD34++cells+confers+properties+of+self-renewal+and+enhanced+erythropoiesis.">Enforced expression of an Flt3 internal tandem duplication in human CD34+ cells confers properties of self-renewal and enhanced erythropoiesis.</a> Blood. 105 (1), 77-84 (2005).</li><li>Ambrosini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-1beta+inhibits+ILC3+while+favoring+NK-cell+maturation+of+umbilical+cord+blood+CD34(+)+precursors.">IL-1beta inhibits ILC3 while favoring NK-cell maturation of umbilical cord blood CD34(+) precursors.</a> European Journal of Immunology. 45 (7), 2061-2071 (2015).</li><li>Batard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-(beta)1+maintains+hematopoietic+immaturity+by+a+reversible+negative+control+of+cell+cycle+and+induces+CD34+antigen+up-modulation.">TGF-(beta)1 maintains hematopoietic immaturity by a reversible negative control of cell cycle and induces CD34 antigen up-modulation.</a> Journal of Cell Science. 113, 383-390 (2000).</li><li>Huang, N., Lou, M., Liu, H., Avila, C., Ma, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+potent+small+molecule+capable+of+regulating+polyploidization,+megakaryocyte+maturation,+and+platelet+production.">Identification of a potent small molecule capable of regulating polyploidization, megakaryocyte maturation, and platelet production.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 9 (1), 136 (2016).</li></ol>

Det protokoll som beskrivs här lämpar sig för ex vivo-differentiering av UCB härledda CD34+ hspcs till de fyra myeloida linjerna. Initial inkubering med en cytokin-blandning bestående av SCF, TPO, Flt3L och IL3 stimulerar CD34+ cellerna. Därefter, differentiering uppnås med en cocktail av SCF, IL3, Flt3L, EPO, och TPO. I denna mix, SCF, IL3, och Flt3L är viktiga för överlevnad och spridning av CD34+ hscs. EPO och TPO främja differentiering mot erytrocyter och megakaryocyter, re...

Normal differentiering av hematopoietiska stamceller (HSCs) är avgörande för upprätthållandet av fysiologiska nivåer av alla blod cells linjer. Under differentiering, i ett samordnat svar på extracellulära signaler inklusive tillväxtfaktorer och cytokiner, hscs först ge upphov till multipotenta stamceller (MPP) celler som har Lympho-myeloid potential1,2,3 ,4 (figur 1). MPPs ger upphov till gemensamma myeloida stamceller (CMPs) och vanliga lymfoida stamceller (CLPs) som är härstamning begränsad. CLPs differentiera till lymfoida linjer som består av B, T, och naturliga mördarceller. CMPS generera myeloida linjer genom två mer begränsade stamceller, megakaryocyter erytroid stamceller (ledamöter), och granulocyt monocyt progenitorer (GMPs). Europaparlamentets ledamöter ger upphov till megakaryocyter och erytrocyter, medan GMPs ger granulocyter och monocyter. Förutom att uppstå genom CMPS, megakaryocyter har rapporterats att också uppstå direkt från hscs eller tidiga MPPS via icke-kanoniska vägar5,6.
Hematopoietiska Stem och stamceller (HSPCs) kännetecknas av ytan markör CD34 och avsaknaden av härstamning specifika markörer (lin-). Andra ytmarkörer som vanligen används för att särskilja HSCs-och myeloida stam populationer inkluderar CD38, CD45RA och CD1232 (figur 1). HSCs och MPPs är lin-/Cd34+/CD38- respektive lin-/CD34+/CD38+. Myeloid engagerade stamfader populationer kännetecknas av närvaron eller frånvaron av CD45RA och CD123. CMPS är lin-/CD34+/CD38+/CD45RA-/cd123Lo, GMPs är lin-/CD34+/CD38+/CD45RA+/cd123Lo, och ledamöterna är lin-/CD34+ /Cd38+/Cd45ra-/cd123-.
Den totala populationen av CD34+ Stem och stamceller kan erhållas från humant navelsträngsblod (UCB), benmärg och perifert blod. CD34+ celler utgör 0,02% till 1,46% av totala mononukleära celler (mnk) i humant UCB, medan deras andel varierar mellan 0,5% och 5,3% i benmärg och är mycket lägre vid ~ 0,01% i perifert blod7,8,9 . Den proliferativa kapaciteten och differentierings potentialen hos UCB-härledda CD34+ -celler är signifikant högre än för benmärg eller perifera blodkroppar1,10, vilket ger en klar fördel för att erhålla tillräckligt material för molekylära analyser i kombination med att utföra immunophenotypic och morfologisk karakterisering av cellerna under differentiering.
Ex vivo differentiering av navelsträngsblod härrör CD34+ hspcs är en allmänt tillämpad modell för att undersöka normal hematopoies och hematopoietiska sjukdomsmekanismer. När de odlas med lämpliga cytokiner kan UCB CD34+ hspcs induceras för att differentiera längs myeloida eller lymfoida linjer11,12,13,14,15 , 16. här beskriver vi protokoll för isolering och immunophenotypic karakterisering av CD34+ hspcs från Human UCB, och för deras differentiering till myeloida Lineage celler. Detta kultur system bygger på cytokininducerad differentiering av HSPCs i närvaro av MS-5 stromaceller för att efterlikna mikromiljön i benmärgen. Kulturen villkor orsakar en första expansion av CD34+ celler, följt av deras differentiering till celler som uttrycker markörer för de fyra myeloida Lineage celler, nämligen granulocyter (CD66b), MONOCYTER (CD14), megakaryocyter (CD41), och erytrocyter (CD235a). Tillämpningar av CD34+ celldifferentiering protokollet omfattar studier om molekylära mekanismer som reglerar hematopoies, och utredningar av effekterna av myeloisk sjukdom associerade mutationer och små molekyler på självförnyelse och differentiering av HSPCs.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:785px;" width="786">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">0.4% Trypan blue solution</td>
			<td style="width:112px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15250-061</td>
			<td style="width:339px;">Dilute working stock to 0.2% in sterile 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">0.5 M UltraPure Ethylene diamine tetra acetic acid, pH 8.0</td>
			<td style="width:112px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:119px;">15575-038</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">10x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:112px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">14185052</td>
			<td style="width:339px;">Dilute to 1x with sterile distilled water &#38; pH to 7.2</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">2.5% Trypsin, no phenol red</td>
			<td style="width:112px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15090046</td>
			<td style="width:339px;">Dilute working stock to 1x with sterile 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">30 &#181;m Pre-separation filters</td>
			<td style="width:112px;">Miltenyi biotech</td>
			<td style="width:119px;">130-041-407</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">35% sterile Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A7979</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">7-AAD</td>
			<td style="width:112px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">420404</td>
			<td style="width:339px;">Used as a live/dead stain to eliminate dead cells from FACS analysis</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-human CD10-FITC antibody (Clone HI10a)</td>
			<td style="width:112px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">312207</td>
			<td style="width:339px;">Use 1:20 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Anti-human CD11b-FITC (activated) antibody (Clone CBRM1/5)</td>
			<td style="width:112px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">301403</td>
			<td style="width:339px;">Use 1:5 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-human CD123-APC antibody (Clone 6H6)</td>
			<td style="width:112px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">306012</td>
			<td style="width:339px;">Use 1:20 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-human CD14-PE antibody (Clone M5E2)</td>
			<td style="width:112px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">301806</td>
			<td style="width:339px;">Use 1:20 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-human CD19-FITC antibody (Clone 4G7)</td>
			<td style="width:112px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">347543</td>
			<td style="width:339px;">Use 1:5 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-human CD235a-APC antibody (Clone GA-R2 (HIR2))</td>
			<td style="width:112px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">551336</td>
			<td style="width:339px;">Use 1:20 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-human CD235a-FITC antibody (Clone HIR2)</td>
			<td style="width:112px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">306609</td>
			<td style="width:339px;">Use 1:50 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-human CD34-APC-Cy7 antibody (Clone 581)</td>
			<td style="width:112px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">343514</td>
			<td style="width:339px;">Use 1:20 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-human CD38-PE antibody (Clone HIT2)</td>
			<td style="width:112px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">303506</td>
			<td style="width:339px;">Use 1:20 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-human CD3-FITC antibody (Clone UCHT1)</td>
			<td style="width:112px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">300405</td>
			<td style="width:339px;">Use 1:20 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-human CD41a-PerCP-Cy5.5 antibody (Clone HIP8)</td>
			<td style="width:112px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">303720</td>
			<td style="width:339px;">Use 1:20 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-human CD45Ra-PE-Cy7 antibody (Clone HI100)</td>
			<td style="width:112px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">304126</td>
			<td style="width:339px;">Use 1:20 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-human CD66b-PE-Cy7 antibody (Clone G10F5)</td>
			<td style="width:112px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">305116</td>
			<td style="width:339px;">Use 1:20 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-human CD7-FITC antibody (Clone CD7-6B7)</td>
			<td style="width:112px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">343103</td>
			<td style="width:339px;">Use 1:20 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP231-100</td>
			<td style="width:339px;">Filter sterilize before use</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM) powder with L-Glutamine&#160;</td>
			<td style="width:112px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">12100046</td>
			<td style="width:339px;">Reconstitute 1 packet to make 1 L of DMEM media&#160; with sodium bicarbonate, 10% FBS &#38; 1% penicillin &#38; streptomycin&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Fetal bovine serum, Australian source, heat inactivated</td>
			<td style="width:112px;">Omega Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB-22 Lot #609716</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Human CD34 microbead kit&#160;</td>
			<td style="width:112px;">Miltenyi biotech</td>
			<td style="width:119px;">130-046-702</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Human Thrombopoietin (TPO), research grade</td>
			<td style="width:112px;">Miltenyi biotech</td>
			<td style="width:119px;">130-094-011</td>
			<td style="width:339px;">Make a stock of 100 &#181;g/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 50 ng/mL for both myeloid differentiation &#38; stimulation medium</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:112px;">Omega Scientific</td>
			<td style="width:119px;">GS-60</td>
			<td style="width:339px;">2 mM concentration in stimulation medium</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">LS Columns</td>
			<td style="width:112px;">Miltenyi biotech</td>
			<td style="width:119px;">130-042-401</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">MACS Multi stand</td>
			<td style="width:112px;">Miltenyi biotech</td>
			<td style="width:119px;">130-042-303</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">MidiMACS magnetic separator</td>
			<td style="width:112px;">Miltenyi biotech</td>
			<td style="width:119px;">130-042-302</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">MNC fractionation media (Ficol-Paque PLUS)</td>
			<td style="width:112px;">GE Healthcare Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">17-1440-03</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">MS-5 cells</td>
			<td style="width:112px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:339px;">Gift from the laboratory of Gay Crooks, UCLA</td>
		</tr>
		<tr height="148">
			<td height="148" style="height:148px;width:216px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P6148</td>
			<td style="width:339px;">Heat 800 mL of 1x PBS in a glass beaker on a stir plate in a chemical hood to ~65 &#176;C. Add 10 g of paraformaldehyde powder. To completely dissolve the paraformaldehyde, raise the pH by adding 1 N NaOH. Cool and filter the solution and make up the volume to 1 L with 1x PBS. Adjust the pH to 7.2.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Penicillin &#38; Streptomycin</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P4458-100ml</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Poly-L lysine</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P2636</td>
			<td style="width:339px;">Make a 10 mg/mL stock in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Recombinant human erythropoietin-alpha (rHu EPO-&#945;)</td>
			<td style="width:112px;">BioBasic</td>
			<td style="width:119px;">RC213-15</td>
			<td style="width:339px;">Make a stock of 2000 units/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 4 units/mL for myeloid differentiation</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Recombinant human fibronectin fragment (RetroNectin)</td>
			<td style="width:112px;">Takara&#160;</td>
			<td style="width:119px;">T100B</td>
			<td style="width:339px;">Use 20 &#181;g/mL diluted in sterile 1x PBS to coat wells prior to stimulation of CD34+ HSCs.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Recombinant human Flt-3 ligand (rHu Flt-3L)</td>
			<td style="width:112px;">BioBasic</td>
			<td style="width:119px;">RC214-16</td>
			<td style="width:339px;">Make a stock of 100 &#181;g/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation &#38; 50 ng/mL in stimulation medium</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Recombinant human interleukin-3 (rHu IL-3)</td>
			<td style="width:112px;">BioBasic</td>
			<td style="width:119px;">RC212-14</td>
			<td style="width:339px;">Make a stock of 100 &#181;g/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation &#38; 20 ng/mL in stimulation medium</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Recombinant human stem cell factor (rHu SCF)</td>
			<td style="width:112px;">BioBasic</td>
			<td style="width:119px;">RC213-12</td>
			<td style="width:339px;">Make a stock of 100 &#181;g/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation &#38; 50 ng/mL in stimulation medium</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Serum free medium (X-Vivo-15)</td>
			<td style="width:112px;">Lonza&#160;</td>
			<td style="width:119px;">04-418Q</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP328-500</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Wright-Giemsa stain, modified</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">WG16-500</td>
			<td style="width:339px;">Use according to manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Equipment&#160;</td>
			<td style="width:112px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">BD LSR II flow cytometer</td>
			<td style="width:112px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:112px;">Sorvall Legend RT</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Light microscope</td>
			<td style="width:112px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pan-myeloid differentiation of human cord blood derived cd34+ hematopoietic stem and progenitor cells

Ex vivo differentiering av mänskliga hematopoietiska stamceller är en allmänt använd modell för att studera hematopoies. Det protokoll som beskrivs här är för cytokin inducerad differentiering av CD34+ hematopoietiska stamceller och stamceller till de fyra myeloida Lineage celler. CD34+ celler är isolerade från mänskliga navelsträngsblod och co-odlade med MS-5 stromaceller i närvaro av cytokiner. Immunophenotypic karakterisering av stammen och progenitorceller, och de differentierade myeloida härstamning celler beskrivs. Med hjälp av detta protokoll, CD34+ celler kan inkuberas med små molekyler eller sensorik med upphov att uttrycka myeloisk sjukdom mutationer att undersöka deras inverkan på myeloisk differentiering.

Tillämpningen av ovanstående protokoll ger 5,6 (± 0,5) x 108 mncs och 1 (± 0,3) x 106 CD34+ celler från en navelsträngsblod enhet av ~ 100 ml. Procentandelen av totalt CD34+ celler varierar mellan 80-90% (figur 2a, B). Immunophenotypic analys av systemet som beskrivs av Manz et al.5 visar att CD34+ celler vanligtvis består av ~ 20% hscs och ~ 72% MPPS som är lin-/Cd34+</sup...

Watch this Scientific Journal Video about Pan-myeloid Differentiation of Human Cord Blood Derived CD34+ Hematopoietic Stem and Progenitor Cells at JoVE.com

Pan-myeloid Differentiation of Human Cord Blood Derived CD34+ Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Här presenterar vi ett protokoll för immunophenotypic karakterisering och cytokin inducerad differentiering av navelsträngsblod härrör CD34+ hematopoietiska stamceller och stamceller till de fyra myeloida linjerna. Tillämpningarna av detta protokoll omfattar utredningar om effekten av myeloida sjukdoms mutationer eller små molekyler på myeloisk differentiering av CD34+ -cellerna.

Pan-myeloida differentiering av humant navelsträngsblod härrör CD34+ hematopoietiska Stem och progenitorceller

Ex vivo differentiation of human hematopoietic stem cells is a widely used model for studying hematopoiesis. The protocol described here is for cytokine ...

Detta protokoll kan användas för att studera de molekylära och cellulära förändringar som sker under den normala myeloisk differentiering av mänskliga CD34 positiva hematopoietiska stamceller och stamceller. Den största fördelen med detta protokoll är att det möjliggör differentiering av CD34 positiva celler längs alla fyra myeloida härstamningar inklusive megakaryocyter, erytrocyter, granulocyter, och monocyter. Demonstrera förfarandet kommer att Aditi Bapat, en post-doc från mitt laboratorium.För mononukleär cellisolering från ett humant navelsträngsblodprov, sterilisera den yttre ytan av en påse navelsträngsblod med 70%etanol innan du överför påsens innehåll till en steril 250 milliliter plastflaska i ett biologiskt säkerhetsskåp. Späd blodet med en lika stor volym av rumstemperatur Hanks buffrade saltlösning, och tillsätt 15 milliliter mononukleär cellfraktionering medium till var och en av fem sterila 50 milliliter koniska rör. Efter skonsam blandning häller du försiktigt 30 milliliter av det utspädda navelsträngsblodet på det mononukleära fraktioneringsmediet i varje rör, och håll de 50 milliliterrören i vinkel för att undvika att blanda lagren.Separera cellerna genom densitetsgradientcentrifugation, och avlägsna de översta 15 till 20 milliliter plasma ovanför det mononukleära cellskiktet. Använd en pipett för att noggrant överföra det exponerade mononukleära cellskiktet till ett nytt 50 milliliterrör, poola de mononukleära cellerna från två till tre rör tillsammans, och föra den slutliga volymen i varje rör upp till 50 milliliter med kall PBE-buffert. Pellet den mononukleära cellprover genom centrifugeringen, och aspirera supernatanterna.Knacka på varje rör försiktigt för att lossa cellpellets, och späd pellets i fem milliliter iskall PBE buffert. Kombinera cellerna från tre till fyra rör i en 50 milliliter koniska rör, och tvätta alla rör med fem milliliter färsk PBE buffert för att samla eventuella återstående celler. Efter räkning, ta med den slutliga volymen i röret upp till 50 milliliter med färsk iskall PBE buffert, och samla in cellerna genom centrifugeringen.För att isolera de CD34 positiva mononukleära cellerna, åter upphäva pelleten i 50 milliliter av färsk PBE buffert innan de samlar in cellerna med en annan centrifugation. När du har kastat supernatanten, knacka försiktigt för att lossa pelleten, och åter upphäva cellerna på en gång 10 till de åtta mononukleära cellerna per 300 mikroliter av iskall PBE buffertkoncentration. Blockera alla ospecifika bindningar med 100 mikroliter av Fc-receptorblockeringsreagens, blanda försiktigt och tillsätt sedan 100 mikroliter CD34-mikropärlor från en magnetisk aktiverad cellsortering av human CD34 mikropärlasats per en gång 10 till de åtta cellerna med mild blandning och inkubera cellerna i 30 minuter vid fyra grader Celsius.Medan cellerna inkuberar, placera en LS kolumn och pre-separation filter i en MACS separator magnetfält. Jämviktsrelibrera kolonnen med två milliliter iskall PBE-buffert och försepareringsfiltret med en milliliter buffert. Låt kolonnen tömmas i ett koniskt rör på 15 milliliter och kassera genomflödet.I slutet av inkubationen, föra den slutliga volymen av mononukleära cellprovet upp till 15 milliliter med färsk iskall PBE buffert och sediment cellerna genom centrifugeringen. Häng pelleten på nytt i en milliliter iskall PBE-buffert och lasta cellerna på förseparationsfiltret på kolonnen. Skölj röret med tre milliliter färsk iskall PBE-buffert och tillsätt bufferten i förseparationsfiltret.Tvätta kolonnen fyra gånger med ytterligare tre milliliter iskall PBE-buffert per tvätt utan filtret, vilket gör att kolonnen kan rinna helt av mellan varje tvätt. Efter den sista tvätten, flytta kolonnen till en ny 15 milliliter rör, och störta fem milliliter färsk iskall PBE genom kolumnen i röret. För att bestämma fraktionerna av stam- och stampopulationer i de nyligen isolerade CD34-positiva hematopoitiska stjälken och progenitorcellerna, samla in cellerna genom centrifugering och åter upphäva pelleten vid en en gång 10 till de sex cellerna per 50 mikroliter av flödescytometri buffertkoncentration.Därefter överför cellerna i 50 mikroliter alikvoter per fem milliliter fluorescens aktiverad cell-sortering röret enligt det experimentella flödet cytometry färgning protokollet. Tillsätt lämplig antikroppscocktail och levande/döda färgning i cellerna, justera volymen till 100 totala mikroliter. Efter 20 minuter i mörker skyddad från ljus, tvätta cellerna med en millimeter färskt flöde cytometri buffert per rör, och åter upphäva cellerna i 500 mikroliter av färskt flöde cytometri buffert per rör.Analysera sedan cellerna på en flödescytometer enligt standardflödescytometriska protokoll. För att differentiera microbead isolerade CD34 positiva stamceller och stamceller i myeloisk härstamning celler, först päls brunnarna i en steril, obestruket 48-väl platta med 200 mikroliter per brunn av rekombinant human fibronectin lösning i PBS i två timmar vid rumstemperatur. I slutet av inkubationen, kassera fibronectinlösningen från varje brunn och blockera brunnarna med 200 mikroliter av 2%bovint serumalbumin.Efter 30 minuter i rumstemperatur, tvätta brunnarna två gånger med 500 mikroliter steril PBS per tvätt. Åter avbryta de nyligen isolerade CD34 positiva cellerna vid en fem gånger 10 de fem cellerna per milliliter av varm stimulering medium koncentration. Därefter frö 200 mikroliter celler i varje brunn av fibronectin fragmentet belagda plattan och placera plattan i cellkulturen inkubatorn i 48 timmar.I slutet av inkubationen, samla cellerna med mild pipettering, och tvätta brunnarna med 500 mikroliter av uppvärmda Dulbecco modifierade Eagle medium, pooling tvättarna med cellen suspension. Efter räkning, åter avbryta cellerna på en 2,5 gånger 10 till de fyra cellerna per en milliliter av myeloisk differentiering medium koncentration. Layer 200 mikroliter av CD34 positiva celler per brunn i en MS-5 stromal cell seedade 48 väl vävnad kulturplåt.Placera sedan plattan i cellodlingen inkubator, försiktigt ersätta 100 mikroliter av supernatanten i varje brunn med 100 mikroliter av färska 2X myeloisk differentiering medium var tredje till fjärde dag. På dag 21, skörda cellerna för analys av myeloisk härstamning markör uttryck genom flöde cytometri som just visat. Den typiska procent av totala CD34 positiva celler isolerats från navelsträngsblod genom microbead separation som visat intervall mellan 80 till 90%Immunophenotypic analys visar att dessa CD34 positiva celler normalt består av en cirka 20%lineage negativa CD34 positiva CD38 negativa HEMATOPOIETIC stamcellspopulationen och en 72%lineage negativa CD34 positiva CD38 positiva multipotent progen cellpopulation.Inom den multipotenta stamceller befolkningen, omkring 25%av cellerna uttrycka gemensamma myeloida progenitor markörer, om 15%express granulocyte monocyt progenitor markörer, och om 56%express megakaryocyte erytroidar progenitor markörer. Immunophenotyping visar också att andelen CD34 positiva celler minskar från cirka 90%vid isolering till mindre än 25%på dag 21. Analys av CD34 negativa befolkningen visar en samtidig ökning av andelen celler som uttrycker mogna myeloisk härstamning markörer.Vidare, Wright-Giemsa färgade celler visar distinkt morfologiska egenskaper på dag ett och 21 med de odifferentierade kulturer uppvisar stora, runda kärnor och mycket lite cytoplasma och de differentierade kulturer visar morfologic egenskaper av härstamning celler inklusive som är monocyter, granulocyter och erytroblaster. Kom ihåg att hälla det utspädda navelsträngsblodet på det mononukleära cellfraktionationsmediet utan att blanda lagren, och stör inte ms-5- och CD34-positiva cellerna när du byter medium. Efter denna differentiering protokoll, kan CD34 positiva cellkulturer analyseras för morfologiska förändringar, apoptotiska effekter, förändringar i cellcykelmönster och graden av differentiering.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Pan-myeloid Differentiation of Human Cord Blood Derived CD34+ Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

Direkt Induktion av humana neurala stamceller från perifert blod hematopoetiska progenitorceller

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

Isolering av neurala stamceller / progenitorceller från periventrikulär regionen vuxen råtta och humant ryggmärgs

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues

Isolering och differentiering av Fett-Derived stamceller från svin subkutan fettvävnad

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. ...

Chondrogenic Differentiation Induction of Adipose-derived Stem Cells by Centrifugal Gravity

Kondrogena Differentiering Induktion av Fett härrörande stamceller genom Radial Gravity

Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Regisserad differentiering av primitiv och slutgiltig hematopoetiska progenitorceller från mänskliga pluripotenta stamceller

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

Differentierande kondrocyter från perifert blod härledda humana inducerade plöripotenta stamceller

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Kondrogen pelletsbildning från Cord Blood-härledda inducerade Pluripotenta stamceller

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...