Name: a plasma sample preparation for mass spectrometry using an automated workstation
Uploaded: 2020-04-24T13:30:00
Duration: 7 min 12 s
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	<li>Fu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Reproducible+Automated+Proteomics+Sample+Preparation+Workflow+for+Quantitative+Mass+Spectrometry.">Highly Reproducible Automated Proteomics Sample Preparation Workflow for Quantitative Mass Spectrometry.</a> Journal of Proteome Research. 17 (1), 420-428 (2018).</li><li>Lehmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+mass+spectrometry+proteomics+(cMSP)+for+medical+laboratory:+What+does+the+future+hold?.">Clinical mass spectrometry proteomics (cMSP) for medical laboratory: What does the future hold?.</a> Clinica Chimica Acta. 467, 51-58 (2017).</li><li>Abbatiello, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Interlaboratory+Study+to+Develop,+Analytically+Validate+and+Apply+Highly+Multiplexed,+Quantitative+Peptide+Assays+to+Measure+Cancer-Relevant+Proteins+in+Plasma.">Large-Scale Interlaboratory Study to Develop, Analytically Validate and Apply Highly Multiplexed, Quantitative Peptide Assays to Measure Cancer-Relevant Proteins in Plasma.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 14 (9), 2357-2374 (2015).</li><li>Kuster, B., Schirle, M., Mallick, P., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scoring+proteomes+with+proteotypic+peptide+probes.">Scoring proteomes with proteotypic peptide probes.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (7), 577-583 (2005).</li><li>Carr, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+peptide+measurements+in+biology+and+medicine:+best+practices+for+mass+spectrometry-based+assay+development+using+a+fit-for-purpose+approach.">Targeted peptide measurements in biology and medicine: best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (3), 907-917 (2014).</li><li>Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pivotal+role+of+computers+and+software+in+mass+spectrometry+-+SEQUEST+and+20+years+of+tandem+MS+database+searching.">Pivotal role of computers and software in mass spectrometry - SEQUEST and 20 years of tandem MS database searching.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (11), 1804-1813 (2015).</li><li>Nilsson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+in+high-throughput+proteomics:+ready+for+the+big+time.">Mass spectrometry in high-throughput proteomics: ready for the big time.</a> Nature Methods. 7 (9), 681-685 (2010).</li><li>Van Eyk, J. E., Sobhani, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+Medicine.">Precision Medicine.</a> Circulation. 138 (20), 2172-2174 (2018).</li><li>Hoofnagle, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+the+Generation,+Quantification,+Storage,+and+Handling+of+Peptides+Used+for+Mass+Spectrometry-Based+Assays.">Recommendations for the Generation, Quantification, Storage, and Handling of Peptides Used for Mass Spectrometry-Based Assays.</a> Clinical Chemistry. 62 (1), 48-69 (2016).</li><li>Wijayawardena, B., Fu, Q., Johnson, C., Van Eyk, J. E., Kowalski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Reproducible+Automated+Proteomics+Sample+Preparation+on+Biomek+i-Series.">Highly Reproducible Automated Proteomics Sample Preparation on Biomek i-Series.</a> Technical note, Beckman Coulter Life Science. Document # AAG-4890APP02. 19, (2019).</li></ol>

Le traitement d’échantillon pour la spectrométrie de masse exige la dénaturation de protéine, la réduction et l’alkylation pour bloquer les cystéines, et la digestion de la trypsine pour fendre des protéines dans des peptides. Chaque réaction chimique ou enzymatique doit être lancée à un moment désigné et effectuée à une température contrôlée, et chaque étape du processus comporte plusieurs étapes de transfert liquide où des variations expérimentales peuvent être introduites. Le traitement automatisé des échantillons constitue une solution à ce dilemme. Les systèmes de manutention liquide actuellement disponibles ont la capacité de transférer les réactifs dans des plaques de 96 puits avec une précision et une précision inférieures à 5 %, selon le type de tête et de pointe utilisé, et d’incuber des échantillons, avec des secousses si désirées, sous des températures contrôlées allant de 14 à 70 oC. Nous avons utilisé un gestionnaire liquide automatisé pour traiter le plasma pour les essais SRM dans un format de 96 puits.
Il y a plusieurs milliers de sites de clivage de protéase dans les mélanges complexes de protéines dans le sérum, le plasma, et d’autres échantillons biologiques ; et chacune de ces protéines a des propriétés uniques affectant l’accessibilité du site de clivage et la stabilité des peptides qui en résultent. Il est donc impossible de concevoir une procédure de traitement de l’échantillon qui est optimale pour chaque protéine. La meilleure alternative est d’être aussi cohérent que possible.
Pour atteindre la cohérence, nous avons optimisé chaque étape de tuyauterie effectuée par le gestionnaire liquide automatisé. Nous avons d’abord examiné le volume requis et les contraintes imposées par le type de liquide (plasma, aqueux ou organique) et les propriétés correspondantes (viscosité, cohésion et volatilité), le matériel (machine à piper-tête et les bras qui s’accrochent à la plaque) et les laboratoires. Nous avons ensuite varié la vitesse et l’écart d’air de fuite pour l’aspiration, la vitesse et le volume d’éruption pour la distribution, et la force et la durée du mélange, tout en incorporant une touche de pointe après aspiration et /ou de distribuer, si nécessaire, pour éliminer l’adhérence liquide à l’extérieur des conseils(figure 13, tableau supplémentaire 1). Un peptide SIL unique, pré-dépisté pour la stabilité, a été cloué dans chaque réactif pour permettre de surveiller la précision de chaque étape de manipulation liquide. Après optimisation, les CV de processus pour la majorité des transitions étaient inférieurs à 10 %, démontrant une bonne reproductibilité avec le poste de travail automatisé(figure 9, figure 10, figure 11 et figure 12).
Le flux de travail automatisé présenté ici prévoit une digestion enzymatique cohérente avec une reproductibilité et un débit améliorés par rapport aux méthodes manuelles(figure 9, figure 10). Cette approche promet d’améliorer la précision et la fiabilité de la découverte et de la validation des biomarqueurs par spectrométrie de masse.

La quantification des protéines et des peptides à base de spectrométrie de masse (SEP) est de plus en plus appliquée comme outil bioanalytique pour l’analyse plasmatique dans la recherche fondamentale et les laboratoires cliniques2,3. L’instrumentation et l’informatique requises ont progressé rapidement que la SP est devenue la méthode de choix pour quantifier les protéines ou les protéines modifiées en ciblant des séquences spécifiques de peptide en raison de sa capacité à quantifier des centaines de peptides dans une seule série de SP4. La préparation des échantillons sert de base à toute analyse protéomique. Avant l’analyse de la SP, les protéines d’un échantillon biologique sont généralement dénaturées, réduites, alkylées, digérées en peptides tryptiques et désaltées5. L’alkylation bloque les cystéines pour prévenir les modifications incontrôlées et s’assurer que toutes les cystéines ont la même masse. Ensuite, la trypsine est ajoutée pour digérer les protéines en peptides. Chacune de ces étapes nécessite une optimisation, et l’ensemble du processus est traditionnellement exécuté manuellement, permettant l’introduction d’erreurs analytiques.
Le pipeline traditionnel de développement des biomarqueurs se compose de deux processus principaux : la protéomique du fusil de chasse pour la découverte mondiale de protéines afin de créer un inventaire de protéines en profondeur6 et des protéomiques ciblés pour la vérification et la validation visant à la quantitation de protéines de haute précision et à haut débit7. Indépendamment de l’approche de LA SP, la préparation de l’échantillon est la même et se concentre sur le clivage enzymatique des protéines dans un mélange de peptide. Comme proposé par Van Eyk et Sobhani8, ayant une méthode qui permet une analyse précise, précise et reproductible pour la découverte et les essais ciblés est souhaité pour déplacer efficacement les biomarqueurs de découverte vers des essais cliniques mis en œuvre. Pour ce faire, l’automatisation de la préparation de l’échantillon sera utile et fournira la capacité d’augmenter l’efficacité à l’analyse à haut débit. Les méthodes manuelles introduisent généralement des erreurs analytiques au-delà des limites acceptables spécifiées par la Food and Drug Administration (FDA) dans le revised Bioanalytical Method Validation Guidance, qui comprend les biomarqueurs et les diagnostics2,9. Le développement d’un flux de travail rapide, très précis et sans main pour la préparation d’échantillons de protéines de SP sera nécessaire pour faciliter la recherche sur les biomarqueurs, qui nécessite la préparation et l’analyse de milliers d’échantillons biologiques. La préparation de l’échantillon de SP comporte de nombreuses étapes où des erreurs peuvent être introduites, et le processus est fastidieux et long.
Dans notre méthode améliorée, un poste de travail automatisé a été programmé pour effectuer toutes les procédures nécessaires de préparation d’échantillons plasmatiques dans un total de 6 étapes(figure 1) pour s’assurer : 1) des transferts liquides précis; 2) la réaction est initiée et arrêtée à un moment constant; 3) la réaction est effectuée à une température contrôlée (c.-à-d., incubateur); et 4) la réaction a un mélange uniforme pour toutes les réactions. Nous avons également mis en œuvre l’ajout de protéines exogènes de contrôle de la qualité et de normes internes (normes stables de peptide étiquetés par isotopes) afin d’assurer un débit de qualité et reproductible de la quantification des protéines et des peptides à base de LC-MS dans un format de 96 puits. En incluant la préparation des réactifs, les heures de travail et un total de 1 000 000 étapes de tuyauterie seraient nécessaires pour traiter 96 échantillons dans des tubes individuels. L’automatisation réduit le temps pratique et le nombre d’interactions humaines impliquées.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>A Pooled healthy human plasma</td>
			<td>Bioreclamation Inc.</td>
			<td></td>
			<td>human plasma tested in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile, HPLC Grade</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A998SK1</td>
			<td>LC MS/MS solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-Galactosidase Recombinant from E.Coli</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3153-5MG</td>
			<td>exogenous control proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biomek i7 Automated Workstation</td>
			<td>Beckman Coulter, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>The proteomic sample preparation workstation: Biomek automated workstations are not intended or validated for use in the diagnosis of disease or other conditions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biomek i-Series Tips 230&#181;L Non-Sterile</td>
			<td>Beckman Coulter, Inc.</td>
			<td>B85903&#160;</td>
			<td>Tips, i7 consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biomek i-Series Tips 90&#181;L Non-Sterile</td>
			<td>Beckman Coulter, Inc.</td>
			<td>B85881&#160;</td>
			<td>Tips, i7 consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FG, Kit Trypsin TPCK</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>4445250</td>
			<td>Trypsin used in digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, green/clear&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#hsp9641</td>
			<td>Autosampler plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octyl B-D-Glucopyranoside</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O9882-5G</td>
			<td>detergent used in digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene, 96-Round Deep Well Plates Sterile</td>
			<td>Beckman Coulter, Inc.</td>
			<td>267007</td>
			<td>Reagent and digestion plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prominence UFLCXR HPLC system</td>
			<td>Shimadzu, Japan</td>
			<td></td>
			<td>High flow LC sytem</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QTRAP 6500</td>
			<td>SCIEX</td>
			<td></td>
			<td>Mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, HPLC Grade</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>W54</td>
			<td>LC MS/MS solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xbridge BEH30 C18 2.1mm x 100mm</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003564</td>
			<td>LC MSMS column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a plasma sample preparation for mass spectrometry using an automated workstation

La préparation de l’échantillon pour l’analyse de spectrométrie de masse dans la protéomique exige le clivage enzymatique des protéines dans un mélange de peptide. Ce processus implique de nombreuses étapes d’incubation et de transfert liquide afin d’atteindre la dénaturation, la réduction, l’alkylation et le clivage. L’adaptation de ce flux de travail à un poste de travail automatisé peut accroître l’efficacité et réduire les coefficients de variance, fournissant ainsi des données plus fiables pour les comparaisons statistiques entre les types d’échantillons. Nous avons déjà décrit un flux de travail automatisé de préparation d’échantillons protéomiques1. Ici, nous rapportons le développement d’un flux de travail plus efficace et mieux contrôlé avec les avantages suivants : 1) Le nombre d’étapes de transfert liquide est réduit de neuf à six en combinant des réactifs ; 2) Le temps de tuyauterie est réduit par tuyauterie sélective de pointe utilisant une tête de tuyauterie de 96 positions avec plusieurs canaux ; 3) Le débit potentiel est augmenté par la disponibilité d’un plus grand nombre de positions de pont; 4) L’enceinte complète du système permet une amélioration de la température et du contrôle de l’environnement et réduit le risque de contamination d’échantillons ou de réactifs; et 5) L’ajout de peptides étiquetés isotopiques stables, ainsi que de protéines de galactosidase, à chaque échantillon rend possible la surveillance et le contrôle de la qualité tout au long du processus. Ces améliorations matérielles et de processus offrent une bonne reproductibilité et améliorent la précision intra-analyse et inter-analyse (CV de moins de 20 %) pour la quantification des protéines et des peptides à base de LC-MS. Le flux de travail total pour digérer 96 échantillons dans une plaque de 96 puits peut être complété en environ 5 heures.

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A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

Ici, nous présentons une méthode automatisée de digestion de protéine de plasma pour l’analyse protéomique quantitative spectrométrique-basée de masse. Dans ce protocole, les étapes de transfert et d’incubation liquides pour la dénaturation des protéines, la réduction, l’alkylation et les réactions de digestion de la trypsine sont rationalisées et automatisées. Il faut environ cinq heures pour préparer une plaque de 96 puits avec la précision désirée.

Préparation d’un échantillon de plasma pour la spectrométrie de masse à l’aide d’un poste de travail automatisé

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Ce flux de travail automatisé fournit une digestion enzymatique cohérente des protéines avec une excellente reproductibilité et débit. Cela améliore la précision et la fiabilité de la découverte, de la validation et de l’application clinique des biomarqueurs par spectrométrie de masse. L’avantage de cette technologie est que l’ensemble du flux de travail peut être complété pour 96 échantillons en environ cinq heures avec un CV intra-analyse et inter-analyse de moins de 20% pour la majorité des protéines.Cette préparation précise d’échantillons à haut débit nous permet d’étudier les protéomes de la maladie des tissus ou des biofluides à plus grande échelle. En outre, le workflow automatisé de préparation d’échantillons protéomiques fournit une base solide pour une teneur élevée et une analyse protéomique quantitative. Le Dr Qin Fu, directeur du High Throughput Center de Cedar Sinai, et M. Casey Johnson, associé de recherche de mon laboratoire, démontreront la procédure.Avant de commencer l’analyse, ajouter cinq microlitres de plasma humain sain mis en commun dans une plaque ronde de propylène de puits profond de 96 ronds. Lorsque tous les échantillons ont été chargés, ouvrez le logiciel du dispositif de manutention liquide et sous l’onglet méthode, sélectionnez à la maison tous les axes pour orienter le gestionnaire liquide automatisé. Confirmez que toutes les seringues du poste de travail ne contiennent pas de bulles d’air visibles et ouvrez une nouvelle méthode et cliquez sur Exécuter pour lancer la méthode.Entrez vrai dans l’entrée une valeur à utiliser pour autosampler prompt à avoir une plaque d’autosampler préparé à la fin de la méthode et cliquez sur OK. Entrez-en un dans l’entrée d’une valeur à utiliser pour la première colonne invite et cliquez sur OK. Entrez 12 dans l’entrée d’une valeur à utiliser pour la dernière colonne invite et cliquez sur OK. Si une plaque d’échantillon est utilisée avec des volumes d’échantillon d’au moins 20 microlitres, entrez vrai dans l’entrée une valeur à utiliser pour l’invite de plaque d’échantillon et cliquez sur OK. Suivez les instructions dans la fenêtre d’installation guidée Labware et cliquez sur Continuer. Chargez les reagents appropriés dans les puits appropriés et cliquez sur Suivant. Cliquez à nouveau sur Suivant pour poser le jeu automatisé de gestionnaire liquide tel qu’illustré, y compris le reagent, la réaction, l’échantillon et les plaques d’autosampler, six puits 90 boîtes de pointe de microlitres, une boîte vide de pointe de 90 microlitres, et une boîte pleine de pointe de 230 microlitres.Cliquez ensuite Sur Terminer pour commencer la méthode. À la suite de la centrifugation prompte, récupérer la plaque de réaction et placer la plaque dans la centrifugeuse. À la fin de la centrifugation, remettre la plaque de réaction à sa position dans le gestionnaire liquide automatisé et cliquez sur Continuer.Pour la chromatographie liquide et l’analyse de spectrométrie de masse tandem, résoudre les peptides dans une colonne C18 de 2,1 par 100 millimètres de 3,5 micromètres par chromatographie liquide haute pression à débit élevé avec un débit de 250 microlitres par minute et analysé en ligne sur un spectromètre de masse triple quadrupole. Cinq minutes après le chargement, équilibrer la colonne avec une solution B tampon de 5 % et éliser les peptides avec un gradient linéaire de 5 à 35 % du tampon B pendant 30 minutes. À la fin de l’éution, laver la colonne avec 98 % de tampon B pendant 10 minutes, suivie d’un lavage de cinq minutes avec 5 % de tampon B avant de charger l’échantillon suivant.Pour le détournement en ligne, utilisez une vanne de commutation en deux phases pour détourner l’élituent post-colonne vers les déchets avant qu’il n’entre dans la source iréo. Lorsque tous les échantillons ont été élucidés, des données de surveillance des réactions multiples peuvent être traitées. Dans cette analyse représentative, trois peptides de bêta-gal et deux peptides d’albumine ont été surveillés des protéines spiked de bêta-gal et d’albumine de plasma traitées.La précision du workflow automatisé de préparation de l’échantillon a été calculée comme le pourcentage du coefficient de variance du flux de travail total de surveillance des réactions sélectionnées protéomiques moins le coefficient en pourcentage de variance de la spectrométrie de masse tandem chromatographie liquide. Comme prévu, de bonnes intensités de signal ont été observées pour l’albumine humaine de sérum et les protéines de bêta-gal. Pour surveiller la précision des étapes de transfert de liquide, des normes stables de peptide étiquetées isotopiques peuvent être piquées pour l’albumine endogène de sérum humain et la protéine exogène de bêta-gal dans les étapes indépendantes de transfert de reagent.Pour valider le flux automatisé de préparation de l’échantillon protéomique, le coefficient intrajournal de la valeur de variance a été calculé à partir de 21 puits préparés le même jour. Le coefficient moyen de variance intrajournalière pour 40 protéines variait de 4 à 20 % Pour évaluer l’effet de bord du flux de travail automatisé à base de plaques, le coefficient de variance en pourcentage peut être calculé à partir de puits spécifiques dans des colonnes et des rangées désignées. Dans cette expérience représentative, les intensités multiples de signal de surveillance de réaction étaient semblables dans toutes les configurations de colonne et de ligne avec le coefficient de pourcentage de variance s’étendant de 3-22%Les étapes les plus importantes ajoutent un échantillon correctement selon la carte désirée de plaque de 96 puits et installent correctement la plaque de reagent selon l’instruction par le logiciel.Cette méthode automatisée de préparation d’échantillons protéomiques permet aux chercheurs de recueillir des données protéomiques fiables et quantitatives à grande échelle.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Recherche

Biochimie

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