Name: a plasma sample preparation for mass spectrometry using an automated workstation
Uploaded: 2020-04-24T13:30:00
Duration: 7 min 12 s
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	<li>Fu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Reproducible+Automated+Proteomics+Sample+Preparation+Workflow+for+Quantitative+Mass+Spectrometry.">Highly Reproducible Automated Proteomics Sample Preparation Workflow for Quantitative Mass Spectrometry.</a> Journal of Proteome Research. 17 (1), 420-428 (2018).</li><li>Lehmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+mass+spectrometry+proteomics+(cMSP)+for+medical+laboratory:+What+does+the+future+hold?.">Clinical mass spectrometry proteomics (cMSP) for medical laboratory: What does the future hold?.</a> Clinica Chimica Acta. 467, 51-58 (2017).</li><li>Abbatiello, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Interlaboratory+Study+to+Develop,+Analytically+Validate+and+Apply+Highly+Multiplexed,+Quantitative+Peptide+Assays+to+Measure+Cancer-Relevant+Proteins+in+Plasma.">Large-Scale Interlaboratory Study to Develop, Analytically Validate and Apply Highly Multiplexed, Quantitative Peptide Assays to Measure Cancer-Relevant Proteins in Plasma.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 14 (9), 2357-2374 (2015).</li><li>Kuster, B., Schirle, M., Mallick, P., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scoring+proteomes+with+proteotypic+peptide+probes.">Scoring proteomes with proteotypic peptide probes.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (7), 577-583 (2005).</li><li>Carr, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+peptide+measurements+in+biology+and+medicine:+best+practices+for+mass+spectrometry-based+assay+development+using+a+fit-for-purpose+approach.">Targeted peptide measurements in biology and medicine: best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (3), 907-917 (2014).</li><li>Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pivotal+role+of+computers+and+software+in+mass+spectrometry+-+SEQUEST+and+20+years+of+tandem+MS+database+searching.">Pivotal role of computers and software in mass spectrometry - SEQUEST and 20 years of tandem MS database searching.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (11), 1804-1813 (2015).</li><li>Nilsson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+in+high-throughput+proteomics:+ready+for+the+big+time.">Mass spectrometry in high-throughput proteomics: ready for the big time.</a> Nature Methods. 7 (9), 681-685 (2010).</li><li>Van Eyk, J. E., Sobhani, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+Medicine.">Precision Medicine.</a> Circulation. 138 (20), 2172-2174 (2018).</li><li>Hoofnagle, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+the+Generation,+Quantification,+Storage,+and+Handling+of+Peptides+Used+for+Mass+Spectrometry-Based+Assays.">Recommendations for the Generation, Quantification, Storage, and Handling of Peptides Used for Mass Spectrometry-Based Assays.</a> Clinical Chemistry. 62 (1), 48-69 (2016).</li><li>Wijayawardena, B., Fu, Q., Johnson, C., Van Eyk, J. E., Kowalski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Reproducible+Automated+Proteomics+Sample+Preparation+on+Biomek+i-Series.">Highly Reproducible Automated Proteomics Sample Preparation on Biomek i-Series.</a> Technical note, Beckman Coulter Life Science. Document # AAG-4890APP02. 19, (2019).</li></ol>

Die Probenverarbeitung für die Massenspektrometrie erfordert Proteindenaturierung, Reduktion und Alkylierung, um Zysen zu blockieren, und Trypsinverdauung, um Proteine in Peptide zu spalten. Jede chemische oder enzymatische Reaktion muss zu einem bestimmten Zeitpunkt eingeleitet und bei einer kontrollierten Temperatur durchgeführt werden, und jeder Schritt im Prozess umfasst mehrere Flüssigkeitsübertragungsschritte, bei denen experimentelle Variationen eingeführt werden können. Die automatisierte Probenverarbeitung bietet eine Lösung für dieses Dilemma. Die derzeit erhältlichen Flüssigkeitshandhabungssysteme sind in der Lage, Reagenzien mit einer Genauigkeit und Genauigkeit von weniger als 5 % in 96-Well-Platten zu übertragen und Proben bei kontrollierten Temperaturen von 14 °C bis 70 °C zu bebrüten und Proben zu bebrüten, wobei sie auf Wunsch geschüttelt werden. Wir verwendeten einen automatisierten Flüssigkeitshandler, um Plasma für SRM-Assays in einem 96-Well-Format zu verarbeiten.
Es gibt viele Tausende von Protease-Spaltungsstellen innerhalb der komplexen Mischungen von Proteinen in Serum, Plasma und anderen biologischen Proben; und jedes dieser Proteine hat einzigartige Eigenschaften, die die Zugänglichkeit der Spaltungsstelle und die Stabilität der resultierenden Peptide beeinträchtigen. Es ist daher unmöglich, ein Probenverarbeitungsverfahren zu entwerfen, das für jedes Protein optimal ist. Die beste Alternative ist, so konsequent wie möglich zu sein.
Um Konsistenz zu erreichen, haben wir jeden Pipettierschritt optimiert, der vom automatisierten Flüssigkeitshandler durchgeführt wird. Wir berücksichtigten zunächst das benötigte Volumen und die Einschränkungen, die durch den Typ der Flüssigkeit (Plasma, wässrig oder organisch) und die entsprechenden Eigenschaften (Viskosität, Kohäsion und Volatilität), Hardware (Arbeitsplatzpipettierkopf und plattengreifende Arme) und Labware auferlegt werden. Wir variierten dann die Geschwindigkeit und den nachlaufenden Luftspalt für die Aspiration, die Geschwindigkeit und das Ausblasvolumen für die Abgabe sowie die Kraft und Dauer des Mischens, wobei wir eine Spitzenberührung nach dem Absetzen und/oder dosieren, falls erforderlich, einbauen, um flüssigkeitsbindend an der Außenseite der Spitzen zu beseitigen (Abbildung 13, Ergänzungstabelle 1). Ein einzigartiges SIL-Peptid, das auf Stabilität vorgeschirmt wurde, wurde in jedes Reagenz gespritzt, um die Präzision jedes Flüssigkeitsbehandlungsschritts zu überwachen. Nach der Optimierung lagen die Prozess-Lebensläufe für die meisten Übergänge unter 10 %, was eine gute Reproduzierbarkeit mit dem automatisierten Arbeitsplatz zeigte (Abbildung 9, Abbildung 10, Abbildung 11 und Abbildung 12).
Der hier vorgestellte automatisierte Workflow bietet eine konsistente enzymatische Verdauung mit verbesserter Reproduzierbarkeit und Durchsatz im Vergleich zu manuellen Methoden (Abbildung 9, Abbildung 10). Dieser Ansatz verspricht, die Genauigkeit und Zuverlässigkeit der Biomarker-Erkennung und -Validierung durch Massenspektrometrie zu verbessern.

Die Massenspektrometrie (MS) -basierte Protein- und Peptidquantifizierung wird zunehmend als bioanalytisches Werkzeug für die Plasmaanalyse in der Grundlagenforschung und klinischen Laboratorien2,3eingesetzt. Die erforderliche Instrumentierung und Informatik haben sich schnell weiterentwickelt, da MS zur Methode der Wahl für die Quantifizierung von Proteinen oder modifizierten Proteinen geworden ist, indem bestimmte Peptidsequenzen aufgrund seiner Fähigkeit, Hunderte von Peptiden in einem einzigen MS-Lauf4zu quantifizieren, gezielt sind. Die Probenvorbereitung dient als Grundlage für jede proteomische Analyse. Vor der MS-Analyse werden die Proteine in einer biologischen Probe in der Regel denaturiert, reduziert, alkyliert, in tryptische Peptide verdaut und5entsalzt. Alkylierung blockiert Zysen, um unkontrollierte Modifikationen zu verhindern und sicherzustellen, dass alle Cysteins die gleiche Masse haben. Als nächstes wird Trypsin hinzugefügt, um Proteine in Peptide zu verdauen. Jeder dieser Schritte erfordert eine Optimierung, und der gesamte Prozess wird traditionell manuell durchgeführt, sodass analytische Fehler auftreten können.
Die traditionelle Biomarker-Entwicklungspipeline besteht aus zwei Hauptprozessen: Schrotflintenproteomik für die globale Proteinentdeckung, um ein detailliertes Proteininventar zu erstellen6 und gezielte Proteomik zur Verifizierung und Validierung, die auf hochpräzise und hochdurchsatzreiche Proteinquantierung7abzielt. Unabhängig vom MS-Ansatz ist die Probenvorbereitung gleich und konzentriert sich auf die enzymatische Spaltung von Proteinen in eine Peptidmischung. Wie von Van Eyk und Sobhani8vorgeschlagen, ist eine Methode mit einer Methode, die eine genaue, präzise und reproduzierbare Analyse sowohl für Entdeckungen als auch für gezielte Assays ermöglicht, wünschenswert, um Entdeckungsbiomarker effektiv auf klinisch implementierte Assays zu verschieben. Dazu ist die Automatisierung der Probenvorbereitung hilfreich und bietet die Möglichkeit, die Effizienz bis hin zur Analyse mit hohem Durchsatz zu steigern. Manuelle Methoden führen in der Regel zu analytischen Fehlern, die über akzeptable Grenzwerte hinausgehen, die von der Food and Drug Administration (FDA) in der überarbeiteten Anleitung zur Validierung bioanalytischer Methoden festgelegt wurden, die Biomarker und Diagnostika2,9enthält. Die Entwicklung eines schnellen, hochpräzisen und freihändigen MS-Proteinprobenvorbereitungs-Workflows wird notwendig sein, um die Biomarkerforschung zu erleichtern, die die Vorbereitung und Analyse tausender biologischer Proben erfordert. Die MS-Beispielvorbereitung hat viele Schritte, in denen Fehler auftreten können, und der Prozess ist mühsam und zeitaufwändig.
In unserer verbesserten Methode wurde eine automatisierte Workstation so installiert, dass alle notwendigen Plasmaprobenvorbereitungsverfahren in insgesamt 6 Schritten durchgeführt werden (Abbildung 1), um sicherzustellen, dass 1) genaue Flüssigkeitsübertragungen durchgeführt werden; 2) die Reaktion wird zu einem konsistenten Zeitpunkt eingeleitet und gestoppt; 3) die Reaktion wird bei einer kontrollierten Temperatur (d. h. Inkubator) durchgeführt; und 4) die Reaktion hat eine gleichmäßige Mischung für alle Reaktionen. Wir haben auch die Zugabe von exogenen Qualitätskontrollproteinen und internen Standards (stabile, isotopmarkierte Peptidstandards) implementiert, um einen qualitativ hochwertigen und reproduzierbaren Durchsatz von LC-MS-basierter Protein- und Peptidquantifizierung in einem 96-Well-Format zu gewährleisten. Inklusive Reagenzvorbereitung, Arbeitszeitstunden und insgesamt 1.000.000 Pipettierschritten wären 96 Proben in einzelnen Rohren zu verarbeiten. Automatisierung reduziert die praktische Zeit und die Anzahl der menschlichen Interaktionen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>A Pooled healthy human plasma</td>
			<td>Bioreclamation Inc.</td>
			<td></td>
			<td>human plasma tested in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile, HPLC Grade</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A998SK1</td>
			<td>LC MS/MS solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-Galactosidase Recombinant from E.Coli</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3153-5MG</td>
			<td>exogenous control proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biomek i7 Automated Workstation</td>
			<td>Beckman Coulter, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>The proteomic sample preparation workstation: Biomek automated workstations are not intended or validated for use in the diagnosis of disease or other conditions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biomek i-Series Tips 230&#181;L Non-Sterile</td>
			<td>Beckman Coulter, Inc.</td>
			<td>B85903&#160;</td>
			<td>Tips, i7 consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biomek i-Series Tips 90&#181;L Non-Sterile</td>
			<td>Beckman Coulter, Inc.</td>
			<td>B85881&#160;</td>
			<td>Tips, i7 consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FG, Kit Trypsin TPCK</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>4445250</td>
			<td>Trypsin used in digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, green/clear&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#hsp9641</td>
			<td>Autosampler plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octyl B-D-Glucopyranoside</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O9882-5G</td>
			<td>detergent used in digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene, 96-Round Deep Well Plates Sterile</td>
			<td>Beckman Coulter, Inc.</td>
			<td>267007</td>
			<td>Reagent and digestion plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prominence UFLCXR HPLC system</td>
			<td>Shimadzu, Japan</td>
			<td></td>
			<td>High flow LC sytem</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QTRAP 6500</td>
			<td>SCIEX</td>
			<td></td>
			<td>Mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, HPLC Grade</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>W54</td>
			<td>LC MS/MS solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xbridge BEH30 C18 2.1mm x 100mm</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003564</td>
			<td>LC MSMS column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a plasma sample preparation for mass spectrometry using an automated workstation

Die Probenvorbereitung für die Massenspektrometrie-Analyse in der Proteomik erfordert eine enzymatische Spaltung von Proteinen in eine Peptidmischung. Dieser Prozess beinhaltet zahlreiche Inkubations- und Flüssigkeitstransferschritte, um Denaturierung, Reduktion, Alkylierung und Spaltung zu erreichen. Die Anpassung dieses Workflows an eine automatisierte Arbeitsstation kann die Effizienz steigern und die Varianzkoeffizienten reduzieren und somit zuverlässigere Daten für statistische Vergleiche zwischen Stichprobentypen liefern. Wir haben zuvor einen automatisierten proteomischen Probenvorbereitungsworkflow1beschrieben. Hier berichten wir über die Entwicklung eines effizienteren und besser gesteuerten Workflows mit folgenden Vorteilen: 1) Die Anzahl der Flüssigkeitstransferschritte wird durch die Kombination von Reagenzien von neun auf sechs reduziert; 2) Pipettierzeit wird durch selektive Spitzenpipettierung mit einem 96-Positionen Pipettierkopf mit mehreren Kanälen reduziert; 3) Potenzieller Durchsatz wird durch die Verfügbarkeit von bis zu 45 Deckpositionen erhöht; 4) Vollständige Gehäuse des Systems bietet verbesserte Temperatur- und Umweltkontrolle und reduziert das Kontaminationspotenzial von Proben oder Reagenzien; und 5) Die Zugabe von stabilen, isotopmarkierten Peptiden sowie dem Protein "Galactosidase" zu jeder Probe ermöglicht die Überwachung und Qualitätskontrolle während des gesamten Prozesses. Diese Hardware- und Prozessverbesserungen bieten eine gute Reproduzierbarkeit und verbessern die Intra-Assay- und Inter-Assay-Präzision (CV von weniger als 20 %) für die LC-MS-basierte Protein- und Peptidquantifizierung. Der gesamte Workflow zur Verdauung von 96 Proben in einer 96-Well-Platte kann in ca. 5 Stunden abgeschlossen werden.

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A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

Hier stellen wir eine automatisierte Plasmaprotein-Verdauungsmethode für die Massenspektrometrie-basierte quantitative proteomische Analyse vor. In diesem Protokoll werden die Flüssigkeitsübertragungs- und Inkubationsschritte zur Proteindenaturierung, Reduktion, Alkylierung und Trypsinverdauungsreaktionen gestrafft und automatisiert. Es dauert etwa fünf Stunden, um eine 96-Well-Platte mit der gewünschten Präzision vorzubereiten.

Eine Plasma-Probenvorbereitung für die Massenspektrometrie mit einer automatisierten Workstation

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Dieser automatisierte Workflow bietet eine konsistente proteinenzymatische Verdauung mit hervorragender Reproduzierbarkeit und Durchsatz. Dies verbessert die Genauigkeit und Zuverlässigkeit der Biomarker-Erkennung, Validierung und klinischen Anwendung durch Massenspektrometrie. Der Vorteil dieser Technologie ist, dass der gesamte Arbeitsablauf für 96 Proben in etwa fünf Stunden mit Intra-Assay und Inter-Assay CV von weniger als 20% für die Mehrheit der Proteine abgeschlossen werden kann.Diese genaue Probenpräparation mit hohem Durchsatz ermöglicht es uns, Krankheitsproteome von Geweben oder Biofluiden in größerem Maßstab zu untersuchen. Darüber hinaus bietet der automatisierte proteomische Probenvorbereitungsworkflow eine solide Grundlage für einen hohen Gehalt und eine quantitative proteomische Analyse. Demonstriert wird das Verfahren von Dr. Qin Fu, Direktor des High Throughput Center bei Cedar Sinai und Mr.Casey Johnson, einem wissenschaftlichen Mitarbeiter aus meinem Labor.Bevor Sie mit der Analyse beginnen, fügen Sie fünf Mikroliter gepooltes gesundes menschliches Plasma in eine 96 runde, tiefe Brunnenpropylenplatte ein. Wenn alle Proben geladen wurden, öffnen Sie die Software für flüssiges Handlergerät, und wählen Sie unter der Registerkarte Methode alle Achsen nach Hause aus, um den automatisierten Flüssigkeitshandler auszurichten. Vergewissern Sie sich, dass alle Workstation-Spritzen keine sichtbaren Luftblasen enthalten, öffnen Sie eine neue Methode, und klicken Sie auf Ausführen, um die Methode zu initiieren.Geben Sie true in die Eingabe eines Werts ein, der für die Autosampler-Eingabeaufforderung verwendet werden soll, um eine Autosampler-Platte am Ende der Methode vorbereiten zu lassen, und klicken Sie auf OK. Geben Sie einen wert in die Eingabe ein, der für die eingabeaufforderung für die erste Spalte verwendet werden soll, und klicken Sie auf OK. Geben Sie 12 in die Eingabe eines Werts ein, der für die letzte Spaltenaufforderung verwendet werden soll, und klicken Sie auf OK. Wenn eine Probenplatte mit Probenvolumina von mindestens 20 Mikrolitern verwendet wird, geben Sie true in die Eingabe eines Werts ein, der für die Probenplattenaufforderung verwendet werden soll, und klicken Sie auf OK. Folgen Sie den Anweisungen im Fenster Guided Labware Setup und klicken Sie auf Fortfahren. Die entsprechenden Reagenzien in die entsprechenden Brunnen laden und auf Weiter klicken. Klicken Sie erneut auf Weiter, um das automatisierte Flüssigkeitshandlerdeck mit Reagenz-, Reaktions-, Proben- und Autosamplerplatten, sechs-gut 90 Mikroliter-Spitzenboxen, einer leeren 90-Mikroliter-Spitzenbox und einer kompletten 230-Mikroliter-Spitzenbox auszurichten.Klicken Sie dann auf Fertig stellen, um die Methode zu beginnen. Bei der Weiterfahrt nach der Zentrifugationsaufforderung die Reaktionsplatte abrufen und in die Zentrifuge legen. Am Ende der Zentrifugation die Reaktionsplatte innerhalb des automatisierten Flüssigkeitshandlers an ihre Position zurückbringen und auf Weiter klicken.Für die Flüssigchromatographie und Die Tandem-Massenspektrometrie-Analyse sollten die Peptide in einer C18 2,1 x 100 Millimeter 3,5 Mikrometer-Säule durch Hochstrom-Hochdruckflüssigkeitschromatographie mit einer Durchflussrate von 250 Mikroliterpro Minute aufgelöst und in Zeile auf einem Dreifach-Quadrupol-Massenspektrometer analysiert werden. Gleichsetzen Sie die Säule fünf Minuten nach dem Laden mit einer 5%puffer B-Lösung aus und löschen Sie die Peptide mit einem linearen 5-35%Gradienten des Puffers B über 30 Minuten. Waschen Sie am Ende der Elution die Säule mit 98% Puffer B 10 Minuten lang, gefolgt von einer fünfminütigen Wäsche mit 5%Puffer B, bevor Sie die nächste Probe laden.Für die Online-Umleitung verwenden Sie ein Zweiphasen-Schaltventil, um das Postkolonnen-Eluent in Abfall umzuleiten, bevor es in die Ionenquelle gelangt. Wenn alle Proben eluiert wurden, können mehrere Reaktionsüberwachungsdaten verarbeitet werden. In dieser repräsentativen Analyse wurden drei Beta-Gal-Peptide und zwei Albuminpeptide aus gespitzten Beta-Gal- und verarbeiteten Plasmaalbuminproteinen überwacht.Die Genauigkeit des automatisierten Probenvorbereitungs-Workflows wurde als Prozentsatz des Varianzkoeffizienten des gesamten proteomischen ausgewählten Reaktionsüberwachungsworkflows abzüglich des prozentualen Varianzkoeffizienten der Flüssigchromatographie-Tandemmassenspektrometrie berechnet. Wie erwartet wurden sowohl für das humane Serumalbumin als auch für Beta-Gal-Proteine gute Signalintensitäten beobachtet. Um die Präzision der Flüssigkeitsübertragungsschritte zu überwachen, können stabile isotop-markierte Peptidstandards für das endogene humane Serumalbumin und das exogene Beta-Gal-Protein in unabhängigen Reagenzübertragungsschritten gespickt werden.Zur Validierung des automatisierten proteomischen Probenvorbereitungs-Workflows wurden die Intraday-Varianzwerte aus 21 Am selben Tag vorbereiteten Brunnen berechnet. Der durchschnittliche Intraday-Prozent-Varianzkoeffizient für 40 Proteine reichte von 4-20%Um den Kanteneffekt des plattenbasierten automatisierten Workflows zu bewerten, kann der prozentuale Varianzkoeffizient aus bestimmten Brunnen innerhalb bestimmter Spalten und Zeilen berechnet werden. In diesem repräsentativen Experiment waren die Signalintensitäten mehrerer Reaktionen in allen Spalten- und Reihenkonfigurationen ähnlich, wobei der prozentuale Varianzkoeffizient von 3-22% lag. Die wichtigsten Schritte sind das korrekte Hinzufügen einer Probe gemäß der gewünschten 96-Well-Plattenkarte und die korrekte Einrichtung der Reagenzienplatte gemäß der Anleitung der Software.Diese automatisierte proteomische Probenvorbereitungsmethode ermöglicht es Forschern, zuverlässige und quantitative Proteomikdaten in großem Maßstab zu sammeln.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisations Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie zur Struktur Protein Studium und Dynamik

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Forschung

Biochemie

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Auflösen von Affinity Purified Protein-Komplexen von Blue native PAGE und Protein Correlation Profilieren

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Lipid Droplet Isolierung für die quantitative Massenspektrometrie-Analyse

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Glycoproteomics of the Extracellular Matrix: A Method for Intact Glycopeptide Analysis Using Mass Spectrometry

Glycoproteomics der extrazellulären Matrix: eine Methode zur Intact Glycopeptidthioestern Analyse unter Verwendung von Massenspektrometrie

Fibrosis is a hallmark of many cardiovascular diseases and is associated with the exacerbated secretion and deposition of the extracellular matrix (ECM). ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Probenvorbereitung für Masse Spektrometrie-basierte Identifikation der RNA-bindende Regionen

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

Optimale Vorbereitung von Formalin fixiert Proben für Peptid-Matrix basierten Assisted Laser Desorption/Ionisierung Massenspektrometrie Imaging-Workflows

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Nachweis von Protein-Ubiquitinationsstellen durch Peptidanreicherung und Massenspektrometrie

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

Ein All-in-One-Probenhalter für makromolekulare Röntgenkristallographie mit minimaler Hintergrundstreuung

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Probenvorbereitung für Probe Elektrospray-Ionen-Massenspektrometrie

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analyse des Zelllipidoms von Saccharomyces Cerevisiae mit Flüssigchromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...