Name: a plasma sample preparation for mass spectrometry using an automated workstation
Uploaded: 2020-04-24T13:30:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation at JoVE.com

<ol>
	<li>Fu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Reproducible+Automated+Proteomics+Sample+Preparation+Workflow+for+Quantitative+Mass+Spectrometry.">Highly Reproducible Automated Proteomics Sample Preparation Workflow for Quantitative Mass Spectrometry.</a> Journal of Proteome Research. 17 (1), 420-428 (2018).</li><li>Lehmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+mass+spectrometry+proteomics+(cMSP)+for+medical+laboratory:+What+does+the+future+hold?.">Clinical mass spectrometry proteomics (cMSP) for medical laboratory: What does the future hold?.</a> Clinica Chimica Acta. 467, 51-58 (2017).</li><li>Abbatiello, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Interlaboratory+Study+to+Develop,+Analytically+Validate+and+Apply+Highly+Multiplexed,+Quantitative+Peptide+Assays+to+Measure+Cancer-Relevant+Proteins+in+Plasma.">Large-Scale Interlaboratory Study to Develop, Analytically Validate and Apply Highly Multiplexed, Quantitative Peptide Assays to Measure Cancer-Relevant Proteins in Plasma.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 14 (9), 2357-2374 (2015).</li><li>Kuster, B., Schirle, M., Mallick, P., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scoring+proteomes+with+proteotypic+peptide+probes.">Scoring proteomes with proteotypic peptide probes.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (7), 577-583 (2005).</li><li>Carr, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+peptide+measurements+in+biology+and+medicine:+best+practices+for+mass+spectrometry-based+assay+development+using+a+fit-for-purpose+approach.">Targeted peptide measurements in biology and medicine: best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (3), 907-917 (2014).</li><li>Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pivotal+role+of+computers+and+software+in+mass+spectrometry+-+SEQUEST+and+20+years+of+tandem+MS+database+searching.">Pivotal role of computers and software in mass spectrometry - SEQUEST and 20 years of tandem MS database searching.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (11), 1804-1813 (2015).</li><li>Nilsson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+in+high-throughput+proteomics:+ready+for+the+big+time.">Mass spectrometry in high-throughput proteomics: ready for the big time.</a> Nature Methods. 7 (9), 681-685 (2010).</li><li>Van Eyk, J. E., Sobhani, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+Medicine.">Precision Medicine.</a> Circulation. 138 (20), 2172-2174 (2018).</li><li>Hoofnagle, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+the+Generation,+Quantification,+Storage,+and+Handling+of+Peptides+Used+for+Mass+Spectrometry-Based+Assays.">Recommendations for the Generation, Quantification, Storage, and Handling of Peptides Used for Mass Spectrometry-Based Assays.</a> Clinical Chemistry. 62 (1), 48-69 (2016).</li><li>Wijayawardena, B., Fu, Q., Johnson, C., Van Eyk, J. E., Kowalski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Reproducible+Automated+Proteomics+Sample+Preparation+on+Biomek+i-Series.">Highly Reproducible Automated Proteomics Sample Preparation on Biomek i-Series.</a> Technical note, Beckman Coulter Life Science. Document # AAG-4890APP02. 19, (2019).</li></ol>

עיבוד לדוגמה לספקטרומטר מסה דורש הדנטורציה של חלבונים, הפחתה והאלדילציה כדי לחסום את הציסטנים, וטריפסין העיכול לקליב חלבונים לתוך פפטידים. כל תגובה כימית או אנזימטית צריכה להיות מאותחלת בזמן ייעודי ומבוצעת בטמפרטורה מבוקרת, וכל צעד בתהליך כרוך בצעדים מרובים של העברת נוזלים שבהם ניתן להציג וריאציה ניסיונית. עיבוד לדוגמה אוטומטי מספק פתרון לדילמה זו. כיום זמין מערכות טיפול נוזלי יש את היכולת להעביר ריאגנטים לתוך 96-היטב צלחות עם דיוק ודיוק של פחות מ 5%, בהתאם לראש וסוג טיפ בשימוש, וכלה בדגימות דגירה, עם טלטול במידת הצורך, תחת טמפרטורות מבוקרת הנע בין 14 ° צ' ל 70 ° c. השתמשנו במטפל נוזלי אוטומטי כדי לעבד פלזמה עבור srm בחני בפורמט 96.
ישנם אלפי אתרי מחשוף הפרוטאז בתוך תערובות מורכבות של חלבונים בסרום, פלזמה, ודגימות ביולוגיות אחרות; וכל אחד מחלבונים אלה יש מאפיינים ייחודיים המשפיעים על נגישות אתר המחשוף ואת היציבות של הפפטידים הנובעים. לכן, אי אפשר לעצב תהליך עיבוד לדוגמה אופטימלי לכל חלבון. החלופה הטובה ביותר. היא להיות עקבית ככל האפשר
כדי להשיג עקביות, היינו ממוטבים לכל צעד שבוצע על ידי המפעיל הנוזלי האוטומטי. לראשונה שקלנו את אמצעי האחסון הנדרש ואילוצים המוטלים על ידי סוג של נוזל (פלזמה, מים, או אורגני) ומאפיינים המקביל (צמיגות, לכידות, ותנודתיות), חומרה (תחנת עבודה ליטוף ראש וצלחת לתפוס זרועות), ו labware. לאחר מכן השתנו המהירות והפער האווירי הנגרר לשאיפה, המהירות ונפח ההתפרצות לחילוק, והכוח והמשך של ערבוב, תוך שילוב של מגע התשר לאחר שאיפה ו/או מחלק, במידת הצורך, כדי לסלק נוזלים הקפדה על החלק החיצוני של הטיפים (איור 13, תוספת טבלה 1) פפטיד SIL ייחודי, מראש הוקרן ליציבות, היה מחודדים לכל מגיב כדי לאפשר לעקוב אחר הדיוק של כל שלב טיפול נוזלי. לאחר האופטימיזציה, תהליך קורות החיים עבור רוב המעברים היו פחות מ 10%, הפגנת השגות טוב עם תחנת העבודה האוטומטית (איור 9, איור 10, איור 11 ואיור 12).
זרימת העבודה האוטומטית המוצגת כאן מספקת את העיכול האנזימטי העקבי באמצעות שיפור ותפוקה משופרות בהשוואה לשיטות ידניות (איור 9, איור 10). גישה זו מבטיחה לשפר את הדיוק והמהימנות של גילוי ביומיקר ואימות באמצעות ספקטרומטר מסה.

חלבון מבוסס ספקטרומטריה (MS) מבוססי חלבונים וכימות פפטיד מיושם יותר ויותר ככלי יואנליטיים עבור ניתוח פלזמה במחקר בסיסי מעבדות קליני2,3. מיכשור ואינפורמטיקה המחויבים יש מתקדמים במהירות כמו MS הפכה את השיטה של בחירה עבור כימות חלבונים או חלבונים שונה על ידי התמקדות רצפי פפטיד ספציפיים בשל יכולתה לכמת מאות פפטידים בהפעלה אחת MS4. ההכנה לדוגמא משמשת כבסיס לניתוח הפרוטאומית כלשהו. לפני הניתוח MS, החלבונים במדגם ביולוגי הם בדרך כלל באופן מצומצם, מופחת, האלקין, מתעכל לתוך פפטידים טריפטיים, ו התפלה5. אלקיללציה חוסם cysteines כדי למנוע שינויים בלתי מבוקרת ולהבטיח לכל cysteines יש מסה זהה. לאחר מכן, טריפסין מתווסף כדי לעכל חלבונים לתוך פפטידים. כל אחד מהצעדים הללו מחייב אופטימיזציה, והתהליך כולו מבוצע באופן מסורתי ידנית, ומאפשר הקדמה של שגיאות אנליטיות.
צינור הפיתוח המסורתי בסמנים מורכב משני תהליכים עיקריים: פרוטאומיקס רובה עבור גילוי חלבון גלובלי כדי ליצור מלאי חלבון מעמיק6 ו פרוטמרים ממוקדות עבור אימות ואימות מכוון בדיוק גבוהה ותפוקה גבוהה של חלבון ככמת7. ללא קשר לגישה MS, הכנת המדגם הוא אותו ומרכזים על מחשוף אנזימטי של חלבונים לתוך תערובת פפטיד. כפי שהוצע על ידי ואן Eyk ו סוהני8, לאחר שיטה המאפשרת ניתוח מדויק, מדויק, ולאחר החשיפה הן לגילוי ממוקד הרצוי ביעילות לעבור בדיקות ביואריטים של גילוי קליני מיושם. לשם כך, אוטומציה של הכנה לדוגמה תהיה מועילה ותספק את היכולת להגביר את היעילות לניתוח בתפוקה גבוהה. שיטות ידניות מציגות בדרך כלל שגיאות אנליטיות מעבר למגבלות המקובלות שנקבעו על ידי מינהל המזון והתרופות (FDA) בהנחיות אימות השיטות הביואנליטיות המתוקנים, הכוללות סמנים ודיאגנוסטיקה2,9. הפיתוח של מהיר, מאוד מדויק, ואת הידיים ללא מדגם MS חלבון הכנה לדוגמה יהיה צורך להקל על מחקר ביולוגי, אשר דורש הכנת וניתוח אלפי דגימות ביולוגיות. הכנה לדוגמה MS יש שלבים רבים שבהם ניתן להציג שגיאות, והתהליך הוא מייגע וגוזלת זמן.
בשיטה המשופרת שלנו, תחנת עבודה אוטומטית הייתה מתכנתים לבצע את כל הליכי ההכנה לדגימת פלזמה הדרושים בסך של 6 צעדים (איור 1) כדי להבטיח: 1) העברות נוזלים מדויקות; 2) התגובה מתחילה ומופסקת בזמן עקבי; 3) התגובה מבוצעת בטמפרטורה מבוקרת (כלומר, חממה); ו -4) לתגובה יש ערבוב אחיד לכל התגובות. אנו מיושמים גם הוספת בקרת איכות אקסוגני חלבונים ותקנים פנימיים (תקני האיזוטופ מסומן על-ידי האיזוטופים) כדי להבטיח תפוקה באיכות ובלתי מזדהות של חלבון מבוסס LC-MS ו-פפטיד לכמת בפורמט 96. כולל הכנה מגיב, שעות של זמן עבודה וכולל סך של 1,000,000 ליטוף צעדים יידרש לעבד 96 דגימות בצינורות בודדים. אוטומציה מפחיתה את הזמן ומספר האינטראקציות האנושיות הכרוכות בכך.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>A Pooled healthy human plasma</td>
			<td>Bioreclamation Inc.</td>
			<td></td>
			<td>human plasma tested in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile, HPLC Grade</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A998SK1</td>
			<td>LC MS/MS solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-Galactosidase Recombinant from E.Coli</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3153-5MG</td>
			<td>exogenous control proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biomek i7 Automated Workstation</td>
			<td>Beckman Coulter, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>The proteomic sample preparation workstation: Biomek automated workstations are not intended or validated for use in the diagnosis of disease or other conditions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biomek i-Series Tips 230&#181;L Non-Sterile</td>
			<td>Beckman Coulter, Inc.</td>
			<td>B85903&#160;</td>
			<td>Tips, i7 consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biomek i-Series Tips 90&#181;L Non-Sterile</td>
			<td>Beckman Coulter, Inc.</td>
			<td>B85881&#160;</td>
			<td>Tips, i7 consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FG, Kit Trypsin TPCK</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>4445250</td>
			<td>Trypsin used in digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, green/clear&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#hsp9641</td>
			<td>Autosampler plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octyl B-D-Glucopyranoside</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O9882-5G</td>
			<td>detergent used in digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene, 96-Round Deep Well Plates Sterile</td>
			<td>Beckman Coulter, Inc.</td>
			<td>267007</td>
			<td>Reagent and digestion plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prominence UFLCXR HPLC system</td>
			<td>Shimadzu, Japan</td>
			<td></td>
			<td>High flow LC sytem</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QTRAP 6500</td>
			<td>SCIEX</td>
			<td></td>
			<td>Mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, HPLC Grade</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>W54</td>
			<td>LC MS/MS solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xbridge BEH30 C18 2.1mm x 100mm</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003564</td>
			<td>LC MSMS column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a plasma sample preparation for mass spectrometry using an automated workstation

הכנה לדוגמא לניתוח ספקטרומטר המסה בפרוטאומניקס דורשת מחשוף אנזימטי של חלבונים לתערובת פפטיד. תהליך זה כולל מספר רב של תהליכי דגירה והעברת נוזלים על מנת להשיג דנטורציה, הפחתה, האלקילציה והמחשוף. התאמת זרימת עבודה זו לתחנת עבודה אוטומטית יכולה להגביר את היעילות ולצמצם את מקדמי השונות, ובכך לספק נתונים אמינים יותר להשוואות סטטיסטיות בין סוגי דגימה. בעבר תיארנו הכנה לדוגמה של פרוטאומית אוטומטית1. כאן, אנו מדווחים על פיתוח של זרימת עבודה יעילה ומבוקרת יותר עם היתרונות הבאים: 1) מספר צעדי ההעברה הנוזליים מצטמצם מ -9 עד 6 על-ידי שילוב ריאגנטים; 2) זמן הליטוף מופחת באמצעות טיפ סלקטיבי ליטוף באמצעות מ96 מיקום מראש עם ערוצים מרובים; 3) תפוקה פוטנציאלית מוגברת על-ידי הזמינות של עד 45 עמדות הסיפון; 4) המארז המלא של המערכת מספק טמפרטורה משופרת בקרת הסביבה ומפחית את הפוטנציאל לזיהום של דגימות או ריאגנטים; ו-5) התוספת של איזוטופ יציב המכונה פפטידים, כמו גם חלבון β-גלטוסידאז, לכל מדגם עושה ניטור ובקרת איכות אפשרי בכל התהליך כולו. שיפורים אלה בחומרה ובתהליך מספקים מענה טוב לתוכנה ומשפרים את הדיוק בתוך הספק והאיכות הבין-שיטת (CV) של פחות מ -20%) עבור מבוסס LC-MS חלבון וכימות פפטיד. את זרימת העבודה כולה לעיכול 96 דגימות בצלחת 96-באר ניתן להשלים בערך 5 שעות.

Watch this Scientific Journal Video about A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation at JoVE.com

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

כאן, אנו מציגים שיטת העיכול האוטומטית של חלבון פלזמה לניתוח מבוסס ספקטרומטר מערכות מבוססות-פרוטאומית כמותית. בפרוטוקול זה, שלבי העברת הנוזלים והדגירה עבור הדנטורציה של חלבונים, הפחתה, האלקילציה וטריפסין תגובות לעיכול הם יעילים ואוטומטיים. זה לוקח בערך חמש שעות להכין צלחת 96-באר עם דיוק הרצוי.

הכנה לדגימת פלזמה לספקטרומטר מסה באמצעות תחנת עבודה אוטומטית

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

זרימת עבודה אוטומטית זו מספקת עיכול אנזימטי עקבי של חלבונים עם יכולת שכפול ותפוקה מעולות. זה משפר את הדיוק והמהימנות של גילוי סמן ביולוגי, אימות, ויישום קליני על ידי ספקטרומטריית מסה. היתרון של טכנולוגיה זו הוא שניתן להשלים את זרימת העבודה כולה עבור 96 דגימות תוך כחמש שעות עם קורות חיים תוך-חקירה ובין-תזה של פחות מ-20% עבור רוב החלבונים.הכנה מדויקת זו של דגימת תפוקה גבוהה מאפשרת לנו לחקור פרוטאומים של מחלות של רקמות או ביופלואידים בקנה מידה גדול יותר. בנוסף, זרימת העבודה האוטומטית של הכנת מדגם פרוטומי מספקת בסיס איתן לתוכן גבוה וניתוח פרוטומי כמותי. הדגמת ההליך תהיה ד"ר קין פו, מנהל מרכז תפוקה גבוהה בסידר סיני ומר קייסי ג'ונסון, עמית מחקר מהמעבדה שלי.לפני תחילת הניתוח, להוסיף חמישה microliters של פלזמה אנושית בריאה בריכה לתוך 96 עגול עמוק גם פרופילן צלחת. לאחר שכל הדגימות נטענו, פתח את תוכנת התקן המטפל בנוזלים ותחת לשונית השיטה, בחר בבית את כל הצירים כדי לכוון את המטפל האוטומטי בנוזלים. ודא שכל מזרקי תחנת העבודה אינם מכילים בועות אוויר גלויות ופתיח שיטה חדשה ולחץ על הפעל כדי ליזום את השיטה.הזינו True להזנת ערך לשימוש עבור בקשה לדגימה אוטומטית כדי להכין לוח דגימה אוטומטית בסוף השיטה ולחצו על הלחצן 'אשר'. הזן ערך בהזנת ערך לשימוש עבור שורת הפקודה של העמודה הראשונה ולחץ על אישור. הזינו 12 בהזנת ערך לשימוש עבור שורת הפקודה האחרונה ולחצו על הלחצן 'אשר'. אם נעשה שימוש בצלחת לדוגמה עם אמצעי אחסון לדוגמה של לפחות 20 מיקרוליטרים, הזן true בהזנת ערך לשימוש עבור שורת הפקודה לדוגמה של הלוח ולחץ על אישור. בצע את ההוראות בחלון התקנת כלי Labware מודרכים ולחץ על המשך. טען את חברי ההנהלה המתאימים לתוך הבאר המתאימה ולחץ על הבא. לחץ שוב על הבא כדי לפרוס את סיפון המטפל בנוזלים האוטומטי כפי שמודגם כולל לוחות ריאגנט, תגובה, מדגם ודגימה אוטומטית, שש בארות 90 תיבות קצה מיקרוליטר, תיבת קצה ריקה של 90 מיקרוליטר ותיבת קצה מלאה של 230 מיקרוליטר.לאחר מכן לחץ על סיום כדי להתחיל את פעולת השירות. בהמשך לאחר הנחיה צנטריפוגה, לאחזר את צלחת התגובה ולהנחות את הצלחת לתוך הצנטריפוגה. בסוף הצנטריפוגה, להחזיר את צלחת התגובה למיקום שלה בתוך המטפל בנוזל אוטומטי ולחץ על המשך.עבור כרומטוגרפיה נוזלית וניתוח ספקטרומטריית מסת טנדם, פתור את הפפטידים ב C18 2.1 על ידי 100 מילימטר 3.5 מיקרומטר עמודה על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה בלחץ גבוה עם קצב זרימה של 250 microliters לדקה ונותחו בשורה על ספקטרומטר מסה מרובע משולש. חמש דקות לאחר הטעינה, יש לצייד את העמודה בתמיסת B של 5%buffer ולהטפס את הפפטידים עם מעבר צבע ליניארי של 5-35% של מאגר B במשך 30 דקות. בסוף האלוטיון, שטף את העמודה עם 98%buffer B למשך 10 דקות ולאחר מכן שטיפה של חמש דקות עם 5%buffer B לפני טעינת הדגימה הבאה.עבור ההסחה המקוונת, השתמש בשסתום מיתוג דו-פאזי כדי להסיט את הפסולת שלאחר העמודה לפסולת לפני שהיא נכנסת למקור היונים. כאשר כל הדגימות כבר eluted, נתוני ניטור תגובה מרובים ניתן לעבד. בניתוח מייצג זה, שלושה פפטידים בטא-גל ושני פפטידים אלבומין היו במעקב של בטא-גל ממוסדד וחלבוני אלבומין פלזמה מעובדים.הדיוק של זרימת העבודה האוטומטית להכנת מדגם חושב כאחוז מקדם השונות של זרימת העבודה הכוללת של ניטור התגובה שנבחרה פרוטומית מינוס מקדם האחוזים של השונות של ספקטרומטריית מסת הדו-מס של הכרומטוגרפיה הנוזלית. כצפוי, עוצמת אות טובה נצפתה הן עבור אלבומין סרום אנושי והן עבור חלבוני בטא-גל. כדי לנטר את הדיוק של צעדי העברת הנוזל, ניתן לסמן איזוטופ יציב בתקני פפטיד עבור אלבומין סרום אנושי אנדוגני וחלבון בטא-גל אקסוגני בשלבי העברה עצמאיים של רייג'נט.כדי לאמת את זרימת העבודה האוטומטית של הכנת מדגם פרוטומי, מקדם תוך יומי של ערכי שונות חושב מ- 21 בארות שהוכנו באותו יום. מקדם השונות התוך יומי הממוצע עבור 40 חלבונים נע בין 4-20%כדי להעריך את אפקט הקצה של זרימת העבודה האוטומטית המבוססת על לוח, ניתן לחשב את מקדם אחוז השונות מ בארות ספציפיות בתוך עמודות ושורות ייעודיות. בניסוי מייצג זה, עוצמת האותות של ניטור התגובות המרובים הייתה דומה בכל תצורות העמודות וה השורות עם מקדם האחוזים של השונות הנע בין 3-22%, השלבים החשובים ביותר הם הוספת מדגם נכון בהתאם למפת הלוחות הרצויה של 96 באר והגדרת לוחית ריאגנט נכונה בהתאם להוראת התוכנה.שיטת הכנה אוטומטית זו של מדגם פרוטומי מאפשרת לחוקרים לאסוף נתוני פרוטומיקה אמינים וכמותיים בקנה מידה גדול.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

פתרון מתחמי פרוטאין טהור זיקה לפי דף Native הכחול פרופיל מתאם חלבון

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

בידוד אגל ליפידים על ניתוח כמותי ספקטרומטריית מסה

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Glycoproteomics of the Extracellular Matrix: A Method for Intact Glycopeptide Analysis Using Mass Spectrometry

Glycoproteomics של מטריקס: שיטה Intact ניתוח Glycopeptide באמצעות ספקטרומטריית מסה

Fibrosis is a hallmark of many cardiovascular diseases and is associated with the exacerbated secretion and deposition of the extracellular matrix (ECM). ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

הכנת הדוגמא לזיהוי מבוססי ספקטרומטר מסה של RNA-איגוד אזורים

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

הכנה אופטימלית של פורמלין קבוע דוגמאות עבור פפטיד מבוסס מטריקס בסיוע לייזר Desorption/יינון ספקטרומטר מסה הדמיה זרימות עבודה

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

איתור מקומות לגילוי החלבון על ידי העשרה מפפטיד וספקטרומטר מסה

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

מחזיק מדגם All-in-one עבור קריסטלוגרפיה Macromolecular X-ray עם פיזור רקע מינימלי

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

הכנה לדוגמא לתרסיס אלקטרונון מהמוני ספקטרומטר מונמטריה

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

ניתוח כמותי של הליפידום הסלולר באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית משולב עם טנדם מסה ספקטרומטריה

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...