Name: a plasma sample preparation for mass spectrometry using an automated workstation
Uploaded: 2020-04-24T13:30:00
Duration: 7 min 12 s
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कोई नहीं.

<ol>
	<li>Fu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Reproducible+Automated+Proteomics+Sample+Preparation+Workflow+for+Quantitative+Mass+Spectrometry.">Highly Reproducible Automated Proteomics Sample Preparation Workflow for Quantitative Mass Spectrometry.</a> Journal of Proteome Research. 17 (1), 420-428 (2018).</li><li>Lehmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+mass+spectrometry+proteomics+(cMSP)+for+medical+laboratory:+What+does+the+future+hold?.">Clinical mass spectrometry proteomics (cMSP) for medical laboratory: What does the future hold?.</a> Clinica Chimica Acta. 467, 51-58 (2017).</li><li>Abbatiello, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Interlaboratory+Study+to+Develop,+Analytically+Validate+and+Apply+Highly+Multiplexed,+Quantitative+Peptide+Assays+to+Measure+Cancer-Relevant+Proteins+in+Plasma.">Large-Scale Interlaboratory Study to Develop, Analytically Validate and Apply Highly Multiplexed, Quantitative Peptide Assays to Measure Cancer-Relevant Proteins in Plasma.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 14 (9), 2357-2374 (2015).</li><li>Kuster, B., Schirle, M., Mallick, P., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scoring+proteomes+with+proteotypic+peptide+probes.">Scoring proteomes with proteotypic peptide probes.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (7), 577-583 (2005).</li><li>Carr, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+peptide+measurements+in+biology+and+medicine:+best+practices+for+mass+spectrometry-based+assay+development+using+a+fit-for-purpose+approach.">Targeted peptide measurements in biology and medicine: best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (3), 907-917 (2014).</li><li>Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pivotal+role+of+computers+and+software+in+mass+spectrometry+-+SEQUEST+and+20+years+of+tandem+MS+database+searching.">Pivotal role of computers and software in mass spectrometry - SEQUEST and 20 years of tandem MS database searching.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (11), 1804-1813 (2015).</li><li>Nilsson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+in+high-throughput+proteomics:+ready+for+the+big+time.">Mass spectrometry in high-throughput proteomics: ready for the big time.</a> Nature Methods. 7 (9), 681-685 (2010).</li><li>Van Eyk, J. E., Sobhani, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+Medicine.">Precision Medicine.</a> Circulation. 138 (20), 2172-2174 (2018).</li><li>Hoofnagle, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+the+Generation,+Quantification,+Storage,+and+Handling+of+Peptides+Used+for+Mass+Spectrometry-Based+Assays.">Recommendations for the Generation, Quantification, Storage, and Handling of Peptides Used for Mass Spectrometry-Based Assays.</a> Clinical Chemistry. 62 (1), 48-69 (2016).</li><li>Wijayawardena, B., Fu, Q., Johnson, C., Van Eyk, J. E., Kowalski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Reproducible+Automated+Proteomics+Sample+Preparation+on+Biomek+i-Series.">Highly Reproducible Automated Proteomics Sample Preparation on Biomek i-Series.</a> Technical note, Beckman Coulter Life Science. Document # AAG-4890APP02. 19, (2019).</li></ol>

बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए नमूना प्रसंस्करण के लिए प्रोटीन डेनाटुरिशन, कमी और एल्किलेशन की आवश्यकता होती है ताकि सिस्टीन को अवरुद्ध किया जा सके, और पेप्टाइड्स में प्रोटीन को क्लीव करने के लिए ट्राइप्सिन पाचन होता है। प्रत्येक रासायनिक या एंजाइमैटिक प्रतिक्रिया को एक निर्धारित समय पर शुरू करने और नियंत्रित तापमान पर प्रदर्शन करने की आवश्यकता होती है, और इस प्रक्रिया में हर कदम में कई तरल हस्तांतरण कदम शामिल हैं जहां प्रयोगात्मक भिन्नता शुरू की जा सकती है। स्वचालित नमूना प्रसंस्करण इस दुविधा का समाधान प्रदान करता है। वर्तमान में उपलब्ध तरल हैंडलिंग सिस्टम में अभिकर्मकों को 96-अच्छी प्लेटों में स्थानांतरित करने की क्षमता है, जो सिर और टिप प्रकार के आधार पर उपयोग की जाती है, और 14 डिग्री सेल्सियस से लेकर 70 डिग्री सेल्सियस तक नियंत्रित तापमान के तहत, यदि वांछित हो तो मिलाते हुए नमूनों को इनक्यूबेट करने के लिए। हम एक स्वचालित तरल हैंडलर का इस्तेमाल किया एक ९६ अच्छी तरह से प्रारूप में एसआरएम परख के लिए प्लाज्मा प्रक्रिया ।
सीरम, प्लाज्मा और अन्य जैविक नमूनों में प्रोटीन के जटिल मिश्रण के भीतर कई हजारों प्रोटीज़ दरार साइटें हैं; और इनमें से प्रत्येक प्रोटीन में दरार साइट पहुंच और परिणामस्वरूप पेप्टाइड्स की स्थिरता को प्रभावित करने वाले अद्वितीय गुण होते हैं। इसलिए, एक नमूना प्रसंस्करण प्रक्रिया डिजाइन करना असंभव है जो हर प्रोटीन के लिए इष्टतम है। सबसे अच्छा विकल्प के रूप में संभव के रूप में सुसंगत होना है ।
स्थिरता प्राप्त करने के लिए, हमने स्वचालित तरल हैंडलर द्वारा किए गए प्रत्येक पाइपटिंग चरण को अनुकूलित किया। हमने पहली बार तरल के प्रकार (प्लाज्मा, जलीय, या कार्बनिक) और इसी गुणों (चिपचिपाहट, सामंजस्य और अस्थिरता), हार्डवेयर (वर्कस्टेशन पाइपिंग-हेड और प्लेट हथियाने वाली बाहों) और लैबवेयर द्वारा लगाई गई मात्रा और बाधाओं पर विचार किया। हम तो गति और आकांक्षा के लिए हवा अंतर पीछे, गति और वितरण के लिए दरार मात्रा, और बल और मिश्रण की अवधि के लिए, जबकि आकांक्षा के बादFigure 13एक टिप Supplemental Table 1स्पर्श को शामिल करने और/ स्थिरता के लिए पूर्व-जांच की गई एक अद्वितीय एसवाईएल पेप्टाइड को प्रत्येक रिएजेंट में नुकीला किया गया था ताकि प्रत्येक तरल हैंडलिंग चरण की सटीकता की निगरानी करना संभव हो सके। अनुकूलन के बाद, अधिकांश संक्रमणों के लिए प्रक्रिया सीवी 10% से कम थी, स्वचालित वर्कस्टेशन के साथ अच्छी प्रजनन क्षमता का प्रदर्शन करते हुए(चित्रा 9, चित्रा 10, चित्रा 11 और चित्रा 12)।
यहां प्रस्तुत स्वचालित कार्यप्रवाह में बेहतर प्रजनन क्षमता और मैनुअल तरीकों की तुलना में थ्रूपुट के साथ लगातार एंजाइमैटिक पाचन की व्यवस्था की गई है(चित्र 9, चित्रा 10)। यह दृष्टिकोण बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा बायोमार्कर खोज और सत्यापन की सटीकता और विश्वसनीयता में सुधार करने का वादा करता है।

मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) आधारित प्रोटीन और पेप्टाइड क्वांटिफिकेशन को बुनियादी अनुसंधान और नैदानिक प्रयोगशालाओं2,,3में प्लाज्मा विश्लेषण के लिए बायोएनालिटिकल उपकरण के रूप में तेजी से लागू किया जा रहा है । अपेक्षित इंस्ट्रूमेंटेशन और सूचनाएं तेजी से बढ़ी हैं क्योंकि एमएस एक ही एमएस रन4में सैकड़ों पेप्टाइड्स की मात्रा निर्धारित करने की क्षमता के कारण विशिष्ट पेप्टाइड दृश्यों को लक्षित करके प्रोटीन या संशोधित प्रोटीन की मात्रा निर्धारित करने के लिए पसंद की विधि बन गई है । नमूना तैयारी किसी भी प्रोटेमिक विश्लेषण के लिए नींव के रूप में कार्य करता है। एमएस विश्लेषण से पहले, जैविक नमूने में प्रोटीन आमतौर पर विकृत, कम, अल्काटेड, ट्राइप्टिक पेप्टाइड्स में पचाजाते हैं, और5को डिसाल्टेड करते हैं। अनियंत्रित संशोधनों को रोकने और यह सुनिश्चित करने के लिए कि सभी साइस्टीन के पास एक ही द्रव्यमान है, अल्किलेशन ब्लॉक सिस्टीन होते हैं। इसके बाद, पेप्टाइड्स में प्रोटीन को पचाने के लिए ट्राइप्सिन जोड़ा जाता है। इनमें से प्रत्येक चरण को अनुकूलन की आवश्यकता होती है, और पूरी प्रक्रिया पारंपरिक रूप से मैन्युअल रूप से की जाती है, जिससे विश्लेषणात्मक त्रुटियों को लागू करने की अनुमति होती है।
पारंपरिक बायोमार्कर विकास पाइपलाइन में दो मुख्य प्रक्रियाएं शामिल हैं: वैश्विक प्रोटीन खोज के लिए शॉटगन प्रोटेओमिक्स एक गहन प्रोटीन इन्वेंट्री6 बनाने के लिए और उच्च सटीक और उच्च थ्रूपुट प्रोटीन क्वांटिटेशन7के उद्देश्य से सत्यापन और सत्यापन के लिए लक्षित प्रोटेओमिक्स। एमएस दृष्टिकोण की परवाह किए बिना, नमूना तैयारी एक ही है और एक पेप्टाइड मिश्रण में प्रोटीन के एंजाइमैटिक दरार पर केंद्र है । जैसा कि वैन आइक और सोभानी8द्वारा प्रस्तावित है, एक विधि है जो खोज और लक्षित परख दोनों के लिए सटीक, सटीक और प्रजनन विश्लेषण के लिए अनुमति देती है, खोज बायोमार्कर को नैदानिक लागू परखों में प्रभावी ढंग से स्थानांतरित करने के लिए वांछित है। ऐसा करने के लिए, नमूना तैयारी का स्वचालन सहायक होगा और उच्च-थ्रूपुट विश्लेषण के लिए दक्षता बढ़ाने की क्षमता प्रदान करेगा। मैनुअल तरीके आमतौर पर संशोधित बायोएनालिटिकल मेथोड सत्यापन मार्गदर्शन में खाद्य एवं औषधि प्रशासन (एफडीए) द्वारा निर्दिष्ट स्वीकार्य सीमाओं से परे विश्लेषणात्मक त्रुटियों को पेश करते हैं, जिसमें बायोमार्कर और निदान2,,9शामिल हैं। बायोमार्कर अनुसंधान की सुविधा के लिए तेजी से, अत्यधिक सटीक और हाथों से मुक्त एमएस प्रोटीन नमूना तैयारी कार्यप्रवाह का विकास आवश्यक होगा, जिसके लिए हजारों जैविक नमूनों को तैयार करने और विश्लेषण करने की आवश्यकता है। एमएस नमूना तैयारी में कई कदम हैं जहां त्रुटियों को पेश किया जा सकता है, और प्रक्रिया थकाऊ और समय लेने वाली है।
हमारी बेहतर विधि में, एक स्वचालित वर्कस्टेशन को कुल 6 चरणों(चित्रा 1)में सभी आवश्यक प्लाज्मा नमूना तैयारी प्रक्रियाओं को करने के लिए प्रोग्राम किया गया था: 1) सटीक तरल हस्तांतरण; 2) प्रतिक्रिया शुरू की और एक सुसंगत समय पर बंद कर दिया है; 3) प्रतिक्रिया नियंत्रित तापमान (यानी, इनक्यूबेटर) पर की जाती है; और 4) प्रतिक्रिया सभी प्रतिक्रियाओं के लिए एक समान मिश्रण है। हमने 96-अच्छी तरह से प्रारूप में एलसी-एमएस आधारित प्रोटीन और पेप्टाइड क्वाटिफिकेशन की गुणवत्ता और पुन: प्रवर्तक थ्रूपुट सुनिश्चित करने के लिए एक्सोजेनस गुणवत्ता नियंत्रण प्रोटीन और आंतरिक मानकों (स्थिर आइसोटोप-लेबल पेप्टाइड मानक) को जोड़ने को भी लागू किया। अभिकर्मक तैयारी, काम के समय के घंटे और कुल १,०००,००० पाइपिंग कदम सहित व्यक्तिगत ट्यूबों में ९६ नमूनों को संसाधित करने की आवश्यकता होगी । स्वचालन हाथ पर समय और शामिल मानव बातचीत की संख्या कम कर देता है ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>A Pooled healthy human plasma</td>
			<td>Bioreclamation Inc.</td>
			<td></td>
			<td>human plasma tested in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile, HPLC Grade</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A998SK1</td>
			<td>LC MS/MS solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-Galactosidase Recombinant from E.Coli</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3153-5MG</td>
			<td>exogenous control proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biomek i7 Automated Workstation</td>
			<td>Beckman Coulter, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>The proteomic sample preparation workstation: Biomek automated workstations are not intended or validated for use in the diagnosis of disease or other conditions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biomek i-Series Tips 230&#181;L Non-Sterile</td>
			<td>Beckman Coulter, Inc.</td>
			<td>B85903&#160;</td>
			<td>Tips, i7 consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biomek i-Series Tips 90&#181;L Non-Sterile</td>
			<td>Beckman Coulter, Inc.</td>
			<td>B85881&#160;</td>
			<td>Tips, i7 consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FG, Kit Trypsin TPCK</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>4445250</td>
			<td>Trypsin used in digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, green/clear&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#hsp9641</td>
			<td>Autosampler plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octyl B-D-Glucopyranoside</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O9882-5G</td>
			<td>detergent used in digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene, 96-Round Deep Well Plates Sterile</td>
			<td>Beckman Coulter, Inc.</td>
			<td>267007</td>
			<td>Reagent and digestion plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prominence UFLCXR HPLC system</td>
			<td>Shimadzu, Japan</td>
			<td></td>
			<td>High flow LC sytem</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QTRAP 6500</td>
			<td>SCIEX</td>
			<td></td>
			<td>Mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, HPLC Grade</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>W54</td>
			<td>LC MS/MS solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xbridge BEH30 C18 2.1mm x 100mm</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003564</td>
			<td>LC MSMS column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a plasma sample preparation for mass spectrometry using an automated workstation

प्रोटेओमिक्स में बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए नमूना तैयार करने के लिए पेप्टाइड मिश्रण में प्रोटीन के एंजाइमैटिक क्लीवेज की आवश्यकता होती है। इस प्रक्रिया में डेन्यूमेंट, कमी, एल्किलेशन और क्लीवेज प्राप्त करने के लिए कई ऊष्मायन और तरल हस्तांतरण चरण शामिल हैं। एक स्वचालित वर्कस्टेशन पर इस कार्यप्रवाह को अनुकूलित करने से दक्षता में वृद्धि हो सकती है और विचरण के गुणांक को कम किया जा सकता है, जिससे नमूना प्रकारों के बीच सांख्यिकीय तुलना के लिए अधिक विश्वसनीय डेटा प्रदान किया जा सकता है। हमने पहले एक स्वचालित प्रोटेओमिक नमूना तैयारी कार्यप्रवाह1वर्णित किया था। यहां, हम निम्नलिखित फायदों के साथ अधिक कुशल और बेहतर नियंत्रित कार्यप्रवाह के विकास की रिपोर्ट करते हैं: 1) अभिकर्मकों के संयोजन से तरल हस्तांतरण चरणों की संख्या नौ से घटाकर छह कर दी जाती है; 2) कई चैनलों के साथ 96-पोजीशन पाइपिंग सिर का उपयोग करके चयनात्मक टिप पाइपटिंग द्वारा पाइपिंग समय कम हो जाता है; 3) क्षमता थ्रूपुट 45 डेक पदों तक की उपलब्धता से बढ़ जाती है; 4) प्रणाली का पूरा बाड़े बेहतर तापमान और पर्यावरण नियंत्रण प्रदान करता है और नमूनों या अभिकर्मकों के संदूषण की क्षमता को कम करता है; और 5) स्थिर आइसोटोप लेबल पेप्टाइड्स के अलावा, साथ ही प्रत्येक नमूने के लिए, पूरी प्रक्रिया में निगरानी और गुणवत्ता नियंत्रण संभव बनाता है। ये हार्डवेयर और प्रक्रिया सुधार अच्छी प्रजनन क्षमता प्रदान करते हैं और अंतर-परख और अंतर-परख परिशुद्धता (20% से कम का सीवी) में सुधार करते हैं एलसी-एमएस आधारित प्रोटीन और पेप्टाइड क्वांटिफिकेशन के लिए। 96-अच्छी प्लेट में 96 नमूनों को पचाने के लिए पूरा कार्यप्रवाह लगभग 5 घंटे में पूरा किया जा सकता है।

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A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

यहां, हम बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित मात्रात्मक प्रोटेओमिक विश्लेषण के लिए एक स्वचालित प्लाज्मा प्रोटीन पाचन विधि प्रस्तुत करते हैं। इस प्रोटोकॉल में, प्रोटीन डेन्यूमेंटेशन, कमी, एल्किलेशन और ट्राइप्सिन पाचन प्रतिक्रियाओं के लिए तरल हस्तांतरण और ऊष्मायन कदम सुव्यवस्थित और स्वचालित होते हैं। वांछित परिशुद्धता के साथ 96-अच्छी तरह से प्लेट तैयार करने में लगभग पांच घंटे लगते हैं।

एक स्वचालित वर्कस्टेशन का उपयोग करके मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए प्लाज्मा नमूना तैयारी

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

यह स्वचालित कार्यप्रवाह उत्कृष्ट प्रजनन क्षमता और थ्रूपुट के साथ एक सुसंगत प्रोटीन एंजाइमेटिक पाचन प्रदान करता है। यह बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा बायोमार्कर खोज, सत्यापन और नैदानिक अनुप्रयोग की सटीकता और विश्वसनीयता में सुधार करता है। इस तकनीक का लाभ यह है कि पूरे कार्यप्रवाह को लगभग पांच घंटे में 96 नमूनों के लिए पूरा किया जा सकता है जिसमें अधिकांश प्रोटीन के लिए अंतर-परख और 20% से कम के अंतर-परख सीवी हैं।यह सटीक उच्च थ्रूपेड नमूना तैयारी हमें बड़े पैमाने पर ऊतक या बायोफ्लुइड के रोग प्रोटोम की जांच करने में सक्षम बनाता है। इसके अलावा, स्वचालित प्रोटेओमिक नमूना तैयारी वर्कफ्लो उच्च सामग्री और मात्रात्मक प्रोटेओमिक विश्लेषण के लिए एक ठोस आधार प्रदान करता है। प्रक्रिया का प्रदर्शन डॉ किन फू, देवदार सिनाई में उच्च थ्रूपुट केंद्र के निदेशक और श्री केसी जॉनसन, मेरी प्रयोगशाला से एक अनुसंधान सहयोगी होगा ।विश्लेषण शुरू करने से पहले, एक ९६ दौर गहरी अच्छी तरह से प्रोपलीन प्लेट में पूल्ड स्वस्थ मानव प्लाज्मा के पांच माइक्रोलीटर जोड़ें । जब सभी नमूने लोड किए गए हों, तो तरल हैंडलर डिवाइस सॉफ्टवेयर खोलें और विधि टैब के नीचे, स्वचालित तरल हैंडलर को उन्मुख करने के लिए घर सभी कुल्हाड़ियों का चयन करें। पुष्टि करें कि सभी वर्कस्टेशन सीरिंज में कोई दृश्यमान हवा के बुलबुले नहीं होते हैं और एक नई विधि खोलते हैं और विधि शुरू करने के लिए रन पर क्लिक करें।ऑटोसंप्लर के लिए उपयोग करने के लिए एक मूल्य दर्ज करें विधि के अंत में तैयार एक ऑटोसंप्लर प्लेट है और ठीक क्लिक करें। पहले कॉलम प्रॉम्प्ट के लिए उपयोग करने के लिए एक मूल्य दर्ज करें और ओके पर क्लिक करें। अंतिम कॉलम के लिए उपयोग करने के लिए एक मूल्य दर्ज करें और ठीक क्लिक करें। यदि कम से कम 20 माइक्रोलीटर के नमूना वॉल्यूम के साथ एक नमूना प्लेट का उपयोग किया जा रहा है, तो नमूना प्लेट त्वरित और क्लिक ओके के लिए उपयोग करने के लिए एक मूल्य दर्ज करें। गाइडेड लैबवेयर सेटअप विंडो में दिए गए निर्देशों का पालन करें और जारी रखें क्लिक करें। उपयुक्त अभिकर् ता को उपयुक्त कुओं में लोड करें और आगे क्लिक करें। रिएजेंट, रिएक्शन, सैंपल और ऑटोसंप्लर प्लेट्स, छह-वेल 90 माइक्रोलीटर टिप बॉक्स, एक खाली 90 माइक्रोलीटर टिप बॉक्स और एक पूर्ण 230 माइक्रोलीटर टिप बॉक्स सहित स्वचालित तरल हैंडलर डेक को बाहर रखने के लिए फिर से क्लिक करें।फिर विधि शुरू करने के लिए फिनिश पर क्लिक करें। अपकेंद्रित्र संकेत के बाद जारी रखने पर, प्रतिक्रिया प्लेट को पुनः प्राप्त करें और प्लेट को अपकेंद्रित्र में रखें। अपकेंद्रित्र के अंत में, स्वचालित तरल हैंडलर के भीतर अपनी स्थिति के लिए प्रतिक्रिया प्लेट वापस और जारी रखें क्लिक करें ।तरल क्रोमेटोग्राफी और टैंडेम मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए, पेप्टाइड्स को सी18 2.1 बाय 100 मिलीमीटर 3.5 माइक्रोमीटर कॉलम में उच्च प्रवाह उच्च दबाव तरल क्रोमेटोग्राफी द्वारा 250 माइक्रोलीटर प्रति मिनट की प्रवाह दर के साथ हल करें और ट्रिपल क्वाड्रपोल मास स्पेक्ट्रोमीटर पर लाइन में विश्लेषण करें। लोड होने के पांच मिनट बाद, कॉलम को 5% बफर बी समाधान के साथ बराबर करें और पेप्टाइड्स को 30 मिनट से अधिक बफर बी के रैखिक 5-35% ढाल के साथ एल्यूट करें। एल्यूशन के अंत में, 10 मिनट के लिए 98% बफर बी के साथ कॉलम को धोएं और इसके बाद अगले नमूने को लोड करने से पहले 5% बफर बी के साथ पांच मिनट का धोना।ऑनलाइन डायवर्जन के लिए, आयन स्रोत में प्रवेश करने से पहले पोस्ट-कॉलम एल्यूंट को बर्बाद करने के लिए दो-चरण स्विचिंग वाल्व का उपयोग करें। जब सभी नमूनों को eluted किया गया है, तो कई प्रतिक्रिया निगरानी डेटा को संसाधित किया जा सकता है। इस प्रतिनिधि विश्लेषण में, नुकीला बीटा-गल और प्रसंस्कृत प्लाज्मा एल्बुमिन प्रोटीन से तीन बीटा-गल पेप्टाइड्स और दो एल्बुमिन पेप्टाइड्स की निगरानी की गई।स्वचालित नमूना तैयारी वर्कफ्लो की सटीकता की गणना कुल प्रोटेओमिक चयनित प्रतिक्रिया निगरानी वर्कफ्लो के विचरण के गुणांक के प्रतिशत के रूप में की गई थी, जो तरल क्रोमेटोग्राफी टैंडेम मास स्पेक्ट्रोमेट्री के विचरण के प्रतिशत गुणांक को घटा देता है। जैसा कि उम्मीद थी, मानव सीरम एल्बुमिन और बीटा-गल प्रोटीन दोनों के लिए अच्छी सिग्नल तीव्रता देखी गई। तरल स्थानांतरित चरणों की सटीकता की निगरानी करने के लिए, स्थिर आइसोटोप-लेबल पेप्टाइड मानकों को स्वतंत्र रिएजेंट ट्रांसफर चरणों में अंतर्जात मानव सीरम एल्बुमिन और एक्सोजेनस बीटा-गल प्रोटीन के लिए नुकीला किया जा सकता है।स्वचालित प्रोटेओमिक नमूना तैयारी वर्कफ्लो को मान्य करने के लिए, विचरण मूल्यों के इंट्राडे गुणांक की गणना उसी दिन तैयार 21 कुओं से की गई थी। ४० प्रोटीन के लिए विचरण का मतलब इंट्राडे प्रतिशत गुणांक 4-20% से लेकर प्लेट आधारित स्वचालित वर्कफ्लो के किनारे प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए, विचरण के प्रतिशत गुणांक की गणना नामित स्तंभों और पंक्तियों के भीतर विशिष्ट कुओं से की जा सकती है । इस प्रतिनिधि प्रयोग में, कई प्रतिक्रिया निगरानी संकेत तीव्रता कॉलम और पंक्ति विन्यास के सभी में 3-22% से लेकर विचरण के प्रतिशत गुणांक के साथ समान थे सबसे महत्वपूर्ण कदम वांछित ९६-अच्छी तरह से प्लेट मानचित्र के अनुसार सही ढंग से एक नमूना जोड़ रहे है और सही ढंग से सॉफ्टवेयर द्वारा निर्देश के अनुसार अभिकर्षक प्लेट की स्थापना ।यह स्वचालित प्रोटेओमिक नमूना तैयारी विधि शोधकर्ताओं को बड़े पैमाने पर विश्वसनीय और मात्रात्मक प्रोटेओमिक्स डेटा एकत्र करने की अनुमति देती है।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

प्रोटीन संरचना और गतिशीलता के अध्ययन के लिए समय का समाधान electrospray ionization हाइड्रोजन-ड्यूटेरियम एक्सचेंज मास स्पेक्ट्रोमेट्री

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

ब्लू मूल निवासी पृष्ठ और प्रोटीन सहसंबंध रूपरेखा द्वारा समानता शुद्ध प्रोटीन परिसरों का समाधान करना

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

मात्रात्मक मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए लिपिड बूंद अलगाव

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Glycoproteomics of the Extracellular Matrix: A Method for Intact Glycopeptide Analysis Using Mass Spectrometry

बाह्य मैट्रिक्स की Glycoproteomics: मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग अक्षुण्ण Glycopeptide विश्लेषण के लिए एक विधि

Fibrosis is a hallmark of many cardiovascular diseases and is associated with the exacerbated secretion and deposition of the extracellular matrix (ECM). ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

आरएनए-बाइंडिंग क्षेत्रों की सामूहिक स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित पहचान के लिए नमूना तैयारी

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

Formalin की इष्टतम तैयारी के लिए निर्धारित नमूनों पेप्टाइड आधारित मैट्रिक्स असिस्टेड लेजर Desorption/Ionization मास स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग वर्कफ़्लोज़

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

पेप्टाइड संवर्धन और मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा प्रोटीन सर्वव्यापकता साइटों का पता लगाना

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

न्यूनतम पृष्ठभूमि स्कैटिंग के साथ मैक्रोआण्विक एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी के लिए एक ऑल-इन-वन नमूना धारक

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

जांच इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए नमूना तैयारी

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

सचारोमाइसेस सेरेविसी के सेलुलर लिपिडोम का मात्रात्मक विश्लेषण टैंडेम मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ मिलकर तरल क्रोमेटोग्राफी का उपयोग करके

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...