Name: a plasma sample preparation for mass spectrometry using an automated workstation
Uploaded: 2020-04-24T13:30:00
Duration: 7 min 12 s
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	<li>Fu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Reproducible+Automated+Proteomics+Sample+Preparation+Workflow+for+Quantitative+Mass+Spectrometry.">Highly Reproducible Automated Proteomics Sample Preparation Workflow for Quantitative Mass Spectrometry.</a> Journal of Proteome Research. 17 (1), 420-428 (2018).</li><li>Lehmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+mass+spectrometry+proteomics+(cMSP)+for+medical+laboratory:+What+does+the+future+hold?.">Clinical mass spectrometry proteomics (cMSP) for medical laboratory: What does the future hold?.</a> Clinica Chimica Acta. 467, 51-58 (2017).</li><li>Abbatiello, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Interlaboratory+Study+to+Develop,+Analytically+Validate+and+Apply+Highly+Multiplexed,+Quantitative+Peptide+Assays+to+Measure+Cancer-Relevant+Proteins+in+Plasma.">Large-Scale Interlaboratory Study to Develop, Analytically Validate and Apply Highly Multiplexed, Quantitative Peptide Assays to Measure Cancer-Relevant Proteins in Plasma.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 14 (9), 2357-2374 (2015).</li><li>Kuster, B., Schirle, M., Mallick, P., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scoring+proteomes+with+proteotypic+peptide+probes.">Scoring proteomes with proteotypic peptide probes.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (7), 577-583 (2005).</li><li>Carr, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+peptide+measurements+in+biology+and+medicine:+best+practices+for+mass+spectrometry-based+assay+development+using+a+fit-for-purpose+approach.">Targeted peptide measurements in biology and medicine: best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (3), 907-917 (2014).</li><li>Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pivotal+role+of+computers+and+software+in+mass+spectrometry+-+SEQUEST+and+20+years+of+tandem+MS+database+searching.">Pivotal role of computers and software in mass spectrometry - SEQUEST and 20 years of tandem MS database searching.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (11), 1804-1813 (2015).</li><li>Nilsson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+in+high-throughput+proteomics:+ready+for+the+big+time.">Mass spectrometry in high-throughput proteomics: ready for the big time.</a> Nature Methods. 7 (9), 681-685 (2010).</li><li>Van Eyk, J. E., Sobhani, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+Medicine.">Precision Medicine.</a> Circulation. 138 (20), 2172-2174 (2018).</li><li>Hoofnagle, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+the+Generation,+Quantification,+Storage,+and+Handling+of+Peptides+Used+for+Mass+Spectrometry-Based+Assays.">Recommendations for the Generation, Quantification, Storage, and Handling of Peptides Used for Mass Spectrometry-Based Assays.</a> Clinical Chemistry. 62 (1), 48-69 (2016).</li><li>Wijayawardena, B., Fu, Q., Johnson, C., Van Eyk, J. E., Kowalski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Reproducible+Automated+Proteomics+Sample+Preparation+on+Biomek+i-Series.">Highly Reproducible Automated Proteomics Sample Preparation on Biomek i-Series.</a> Technical note, Beckman Coulter Life Science. Document # AAG-4890APP02. 19, (2019).</li></ol>

質量分析のサンプル処理には、システインをブロックするタンパク質変性、還元、アルキル化、およびタンパク質をペプチドに切断するためのトリプシン消化が必要です。各化学反応または酵素反応は、指定された時間に開始し、制御された温度で行う必要があり、プロセス内のすべてのステップは、実験的な変動を導入することができる複数の液体移動ステップを伴う。自動サンプル処理は、このジレンマに対する解決策となります。現在利用可能な液体処理システムは、使用される頭部と先端の種類に応じて、正確かつ精度が5%未満の96ウェルプレートに試薬を移管し、必要に応じて14°Cから70°Cの範囲の制御温度下で、必要に応じてサンプルをインキュベートする能力を有する。自動液体ハンドラを使用して、SRMアッセイ用のプラズマを96ウェル形式で処理しました。
血清、血漿、およびその他の生物学的サンプル中のタンパク質の複雑な混合物内に何千ものプロテアーゼ切断部位があります。これらのタンパク質のそれぞれは、切断部位のアクセシビリティおよび得られるペプチドの安定性に影響を与えるユニークな特性を有する。したがって、すべてのタンパク質に最適なサンプル処理手順を設計することは不可能です。最善の方法は、できるだけ一貫性を保つ方法です。
一貫性を実現するために、自動液体ハンドラによって実行される各ピペットステップを最適化しました。まず、液体の種類(プラズマ、水性、有機)と対応する特性(粘性、凝集度、揮発性)、ハードウェア(ワークステーションピペットヘッドとプレートをつかむアーム)、ラボウェアによって課される量と制約を考慮しました。その後、吸引の速度と後続のエアギャップ、分配のための速度と吹き出し量、および混合の力と持続時間を変えながら、吸引および/または分配後のチップタッチを組み込み、必要に応じて、先端の外側に付着する液体を排除した(図13、補足表1)。安定性を事前にスクリーニングした独自のSILペプチドを各試薬にスパイクし、各液体処理ステップの精度を監視することを可能にしました。最適化後、移行の大部分のプロセス CV は 10% 未満であり、自動化されたワークステーション (図 9、図 10、図 11、図 12)で再現性の良い結果を示しています。
ここで示す自動化されたワークフローは、手動の方法と比較して再現性とスループットを向上させた一貫した酵素消化を提供します(図9、図10)。このアプローチは、質量分析によるバイオマーカー発見と検証の精度と信頼性を向上させることが約束されています。

質量分析(MS)ベースのタンパク質およびペプチド定量は、基礎研究及び臨床検査所における血漿分析のためのバイオアナリシスツールとしてますます応用されている2,,3.必要な機器および情報学は、MSが単一のMSラン4で何百ものペプチドを定量する能力のために特定のペプチド配列を標的化することによってタンパク質または修飾タンパク質を定量するための選択方法となっているように急速に進歩している。サンプル調製は、任意のプロテオミクス分析の基礎として機能します。MS分析の前に、生物学的試料中のタンパク質は、典型的には変性、還元、アルキル化、トリプティックペプチドに消化され、5を脱塩する。アルキル化は、制御されていない変更を防ぎ、すべてのシステインが同じ質量を持っていることを保証するためにシステインをブロックします。次に、トリプシンを添加してタンパク質をペプチドに消化する。これらの各手順は最適化を必要とし、従来は全体のプロセスを手動で実行し、分析エラーを導入できます。
従来のバイオマーカー開発パイプラインは、グローバルタンパク質発見用ショットガンプロテオミクス、詳細なタンパク質インベントリ6を作成するショットガンプロテオミクス、高精度かつハイスループットなタンパク質定量7を目的とした検証と検証のための標的プロテオミクスの2つの主要プロセスで構成されています。MSアプローチにかかわらず、サンプル調製は同じであり、ペプチド混合物へのタンパク質の酵素的切断を中心とする。Van EykとSobhani8が提案したように、発見および標的アッセイの両方に対して正確で正確かつ再現性のある分析を可能にする方法を有することが、バイオマーカーの発見を臨床実施アッセイに効果的に移動することが望まれる。これを行うには、サンプル準備の自動化が役立ち、高スループット分析の効率を向上させる機能を提供します。手動メソッドは、通常、バイオマーカーと診断22,99を含む改訂されたバイオアナリシス法検証ガイダンスで食品医薬品局(FDA)によって指定された許容限界を超える分析誤差を導入する。バイオマーカーの研究を促進するためには、高速で高精度でハンズフリーなMSタンパク質サンプル調製ワークフローの開発が必要であり、何千もの生物学的サンプルを調製し分析する必要があります。MS サンプルの準備には、エラーが発生する多くの手順があり、プロセスは面倒で時間がかかります。
改良された方法では、自動化されたワークステーションが、必要なすべてのプラズマサンプル調製手順を合計6ステップ(図1)で実行するようにプログラムされ、1)正確な液体移送を確実に行いました。2)反応が開始され、一貫した時間に停止します。3)反応は、制御された温度(すなわち、インキュベーター)で行われる。4)反応は全ての反応に対して均一な混合を有する。また、外因性の品質管理タンパク質と内部標準(安定同位体標識ペプチド標準)を追加して、LC-MSベースのタンパク質およびペプチド定量の品質と再現性を96ウェル形式で実現しました。試薬の準備、作業時間、および個々のチューブ内の96サンプルを処理するためには、合計1,000,000のピペット処理ステップが必要です。自動化により、実践的な時間と、関係する人間との対話の数が削減されます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>A Pooled healthy human plasma</td>
			<td>Bioreclamation Inc.</td>
			<td></td>
			<td>human plasma tested in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile, HPLC Grade</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A998SK1</td>
			<td>LC MS/MS solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-Galactosidase Recombinant from E.Coli</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3153-5MG</td>
			<td>exogenous control proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biomek i7 Automated Workstation</td>
			<td>Beckman Coulter, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>The proteomic sample preparation workstation: Biomek automated workstations are not intended or validated for use in the diagnosis of disease or other conditions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biomek i-Series Tips 230&#181;L Non-Sterile</td>
			<td>Beckman Coulter, Inc.</td>
			<td>B85903&#160;</td>
			<td>Tips, i7 consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biomek i-Series Tips 90&#181;L Non-Sterile</td>
			<td>Beckman Coulter, Inc.</td>
			<td>B85881&#160;</td>
			<td>Tips, i7 consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FG, Kit Trypsin TPCK</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>4445250</td>
			<td>Trypsin used in digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, green/clear&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#hsp9641</td>
			<td>Autosampler plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octyl B-D-Glucopyranoside</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O9882-5G</td>
			<td>detergent used in digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene, 96-Round Deep Well Plates Sterile</td>
			<td>Beckman Coulter, Inc.</td>
			<td>267007</td>
			<td>Reagent and digestion plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prominence UFLCXR HPLC system</td>
			<td>Shimadzu, Japan</td>
			<td></td>
			<td>High flow LC sytem</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QTRAP 6500</td>
			<td>SCIEX</td>
			<td></td>
			<td>Mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, HPLC Grade</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>W54</td>
			<td>LC MS/MS solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xbridge BEH30 C18 2.1mm x 100mm</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003564</td>
			<td>LC MSMS column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a plasma sample preparation for mass spectrometry using an automated workstation

プロテオミクスにおける質量分析分析のためのサンプル調製には、タンパク質をペプチド混合物に酵素的に切断する必要があります。このプロセスは、変性、還元、アルキル化、および切断を達成するために、多数のインキュベーションおよび液体移動ステップを伴う。このワークフローを自動化されたワークステーションに適用することで、効率を高め、分散係数を削減できるため、サンプルタイプ間の統計的比較に対する信頼性の高いデータを提供できます。我々は、以前に、自動化されたプロテオームサンプル調製ワークフロー1を説明した。ここでは、より効率的で優れた制御ワークフローの開発を次の利点と報告します: 1)液体移送ステップの数は試薬を組み合わせることで9から6に減少します。2)ピペッティング時間は、複数のチャネルを有する96位のピペットヘッドを使用して選択的な先端ピペットによって減少する。3)最大45デッキポジションの可用性によって潜在的なスループットが増加します。4)システムの完全なエンクロージャは改善された温度および環境制御を提供し、サンプルまたは試薬の汚染のための潜在性を減らす;5) 安定同位体標識ペプチド、ならびにβ-ガラクトシダーゼタンパク質を各サンプルに添加することで、プロセス全体を通してモニタリングと品質管理が可能になります。これらのハードウェアとプロセスの改善により、良好な再現性を提供し、アッセイおよびアッセイ間精度(20%未満のCV)を改善LC-MSベースのタンパク質およびペプチド定量のため。96ウェルプレートで96サンプルを消化するためのワークフロー全体を約5時間で完了できます。

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A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

ここでは、質量分析ベースの定量プロテオミクス解析のための自動化された血漿タンパク質消化法を紹介する。このプロトコルでは、タンパク質変性、還元、アルキル化、トリプシン消化反応のための液体の移動およびインキュベーションステップが合理化され、自動化されています。所望の精密の96の井戸版を準備するのにおよそ5時間かかる。

自動ワークステーションを用いた質量分析のためのプラズマサンプル調製

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

この自動化されたワークフローは、再現性とスループットに優れた一貫したタンパク質酵素消化を提供します。これにより、質量分析によるバイオマーカー発見、検証、臨床応用の精度と信頼性が向上します。この技術の利点は、大多数のタンパク質に対して20%未満のアッセイおよび相互アッセイCVを使用して、約5時間で96個のサンプルのワークフロー全体を完了できることです。この正確な高スループットサンプル調製により、組織や生体液の疾患プロテオームを大規模に調査することができます。さらに、自動化されたプロテオームサンプル調製ワークフローは、高含量および定量プロテオミクス分析のための強固な基盤を提供します。この手順のデモンストレーションは、シダーシナイのハイスループットセンター所長の秦福博士と、私の研究室の研究員であるケイシー・ジョンソン氏です。分析を開始する前に、プールされた健康なヒトプラズマの5マイクロリットルを96ラウンドの深いウェルプロピレンプレートに加えます。すべてのサンプルがロードされたら、液体ハンドラデバイスソフトウェアを開き、メソッドタブで、すべての軸を選択して、自動液体ハンドラを向けます。すべてのワークステーションのシリンジに可視の気泡が含まれていないことを確認し、新しい方法を開き、[実行]をクリックしてメソッドを開始します。オートサンプラーのプロンプトに使用する値を入力して、メソッドの最後にオートサンプラープレートを準備し、[OK]をクリックします。最初の列に使用する値を入力し、[OK]をクリックします。最後の列プロンプトに使用する値を入力して、「OK」をクリックします。サンプルプレートを少なくとも 20 マイクロリットルのサンプルボリュームで使用する場合は、サンプルプレートに使用する値を入力するプロンプトに true と入力し、「OK」をクリックします。ガイド付き Labware セットアップ ウィンドウの指示に従い、[続行] をクリックします。適切な試薬を適切なウェルにロードし、[次へ]をクリックします。試薬、反応、サンプル、オートサンプラープレート、6ウェル90マイクロリットルチップボックス、空の90マイクロリットルチップボックス、フル230マイクロリットルチップボックスを含む図示に示すように、再び[Next]をクリックして、自動化された液体ハンドラデッキをレイアウトします。次に、[完了] をクリックしてメソッドを開始します。遠心分離後の継続時に、反応板を取り出し、遠心分離機に入れる。遠心分離の最後に、自動液体ハンドラ内の位置に反応プレートを戻し、[続行]をクリックします。液体クロマトグラフィーおよびタンデム質量分析では、C18 2.1 x 100ミリメートル3.5マイクロメートルカラムのペプチドを、毎分250マイクロリットルの流量を有する高圧液体クロマトグラフィーで、3倍極数質量分析計で一列に解析します。ローディングの5分後、5%バッファーB溶液でカラムを平衡化し、30分間にわたってリニアな5〜35%の緩衝剤Bでペプチドを溶出させる。溶出の終わりに、98%のバッファーBでカラムを10分間洗い、次のサンプルをロードする前に5%バッファBで5分間洗浄します。オンライン転用の場合、2相切替弁を使用して、後列溶離液をイオン源に入る前に無駄にします。すべてのサンプルが溶出すると、複数の反応モニタリングデータを処理できます。この代表的な分析では、3つのβ-galペプチドおよび2つのアルブミンペプチドを、スパイクされたβ-galおよび処理された血漿アルブミンタンパク質から監視した。自動サンプル調製ワークフローの精度は、選択した全プロテオミクス反応モニタリングワークフローの分散係数から、液体クロマトグラフィータンデム質量分析の分散係数の割合を差し引いた値として計算した。予想通り、ヒト血清アルブミンおよびβ-galタンパク質の両方に対して良好なシグナル強度が観察された。液体転写ステップの精度を監視するために、独立した試薬の移送ステップで内因性ヒト血清アルブミンおよび外因性β-galタンパク質に対して安定同位体標識ペプチド標準をスパイクすることができる。自動化されたプロテオームサンプル調製ワークフローを検証するために、同じ日に調製された21のウェルから、1日中の分散係数値を計算した。40個のタンパク質の平均日中分散係数は4~20%の範囲で、プレートベースの自動化ワークフローのエッジ効果を評価するために、分散係数パーセントは、指定された列および行内の特定のウェルから計算することができます。この代表的な実験では、複数の反応監視信号強度は、3-22%の範囲の分散係数パーセントを持つ列と行のすべての構成で類似していた最も重要なステップは、所望の96ウェルプレートマップに従ってサンプルを正しく追加し、ソフトウェアの指示に従って試薬プレートを正しく設定することです。この自動化されたプロテオームサンプル調製法により、研究者は信頼性の高い定量的プロテオミクスデータを大規模に収集することができます。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

時間分解エレクトロスプレーイオン化水素 - 重水素交換質量分析タンパク質の構造とダイナミクスを学ぶために

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Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

ブルーネイティブPAGEおよびタンパク質相関プロファイリングによってアフィニティー精製タンパク質複合体の解決

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

定量的質量分析のための脂肪滴の分離

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

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The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

ペプチド濃縮と質量分析によるタンパク質ユビキチン化部位の検出

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An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

背景散乱を最小限に抑えた高分子X線結晶学用オールインワンサンプルホルダー

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

プローブエレクトロスプレーイオン化質量分析のためのサンプル調製

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Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

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液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析法を用いたサッカロミセス・セレビシエ細胞リピドームの定量的解析

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...