Name: inducing and characterizing vesicular steatosis in differentiated heparg cells
Uploaded: 2019-07-18T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inducing and Characterizing Vesicular Steatosis in Differentiated HepaRG Cells at JoVE.com

Wir danken Prof. Christian Trepo (INSERM U871, Lyon, Frankreich), der freundlicherweise HepaRG-Zellen zur Verfügung gestellt hat. Wir danken Rita Appodia für die administrative Hilfe. Diese Arbeit wurde von MIUR- Ministero dell'istruzione, dell'université e della ricerca (FIRB 2011–2016 RBAP10XKNC) und der Universität Sapienza in Rom (prot. C26A13T8PS; Prot. C26A142MCH; Prot. C26A15LSXL).

1. Herstellung von Kulturmedien und Reagenzien
<ol><li>Vermehrungsmedium: Ergänzen Sie Williams E-Medium mit GlutaMAX, 10% fetalem Rinderserum (FBS), 1% Penicillin/Streptomycin, 5 g/ml Insulin und 0,5 m Hydrocortison-Hemisuccinat.</li>
	<li>Differenzierungsmedium: Ergänzung des E-Mediums von William mit GlutaMAX, 10% FBS, 1% Penicillin/Streptomycin, 5 g/ml Insulin, 50 M Hydrocortisonhemisuccinat und 2% DMSO.</li>
	<li>Gefriermedium: Ergänzung vermehrendes Medium mit 10% DMSO.</li>
	<li>Natriumoleat: in 99% Methanol ...

<ol>
	<li>Starley, B. Q., Calcagno, C. J., Harrison, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonalcoholic+fatty+liver+disease+and+hepatocellular+carcinoma:+a+weighty+connection.">Nonalcoholic fatty liver disease and hepatocellular carcinoma: a weighty connection.</a> Hepatology. 51 (5), 1820-1832 (2010).</li><li>Byrne, C. 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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytometric+analysis+for+drug-induced+steatosis+in+HepG2+cells.">Cytometric analysis for drug-induced steatosis in HepG2 cells.</a> Chemico-Biological Interactions. 181 (3), 417-423 (2009).</li><li>Hellerer, T., Ax&#228;ng, C., Brackmann, C., Hillertz, P., Pilon, M., Enejder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+lipid+storage+in+Caenorhabditis+elegans+using+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+(CARS)+microscopy.">Monitoring of lipid storage in Caenorhabditis elegans using coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (37), 14658-14663 (2007).</li><li>Le, T. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplet+functions+beyond+energy+storage.">Lipid droplet functions beyond energy storage.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (10), 1260-1272 (2017).</li><li>Cohen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+as+organelles.">Lipid droplets as organelles.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 337, 83-110 (2018).</li><li>Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+finally+get+a+little+R-E-S-P-E-C-T.">Lipid droplets finally get a little R-E-S-P-E-C-T.</a> Cell. 139 (5), 855-860 (2009).</li></ol>

Dieses Protokoll beschreibt, wie HepaRG-Zellen zu unterscheiden und wie vesikuläre Steatose durch Natriumoleatbehandlung induzieren (Abbildung 1A). Tatsächlich weist die HepaRG-Zelllinie im Vergleich zu anderen menschlichen Hepatozellulären Karzinom-Zelllinien Merkmale von erwachsenen menschlichen Hepatozyten auf, die eine wertvolle Alternative zu ex vivo kultivierten primären menschlichen Hepatozytendarstellen 13,14 <...

Lebersteatose ist definiert als intrahepatische Fettansammlung, innerhalb triglyceridhaltiger Lipidtröpfchen, von mindestens 5% des Lebergewichts. Längere Leberlipidspeicherung ist ein potenziell reversibler Prozess, jedoch kann es zu Leberstoffwechselfunktionsstörungen, Entzündungen und fortgeschritteneformen Formen der nichtalkoholischen Fettleber (NAFLD), die vorherrschende Ursache der chronischen Lebererkrankung in vielen Teilen der die Welt1,2. NAFLD ist eine multifaktorielle Erkrankung, die sich zu der aggressiveren alkoholfreien Steatohepatitis (NASH) entwickeln kann, die wiederum zu Zirrhose und in einem kleinen Prozentsatz der Patienten zu einem hepatozellulären Karzinom (HCC)1,3weiterführen kann. Derzeit gibt es keine zugelassene Therapie als spezifische Behandlung für NAFLD und die Kombination von Ernährungs- und Lebensstiländerungen bleibt die Säule des NAFLD- und NASH-Managements4,5,6.
Die molekularen Mechanismen, die zur Entwicklung der Lebersteatose bei der Pathogenese von NAFLD führen, müssen noch aufgeklärt werden7. In diesem Zusammenhang wurden Mausmodelle entwickelt, um das Fortschreiten der humanen Steatose-Krankheit zu untersuchen. Es gibt eine Vielzahl unterschiedlicher Modelle, und jedes hat seine Vor- und Nachteile, einschließlich genetischer, ernährungsphysiologischer und chemisch induzierter Modelle, die verschiedene Ansätze kombinieren. Genetisch veränderte (transgene oder Knockout) Mäuse entwickeln spontan Lebererkrankungen. Es sollte jedoch beachtet werden, dass diese Mutationen beim Menschen sehr selten sind und die Deletion oder Überexpression eines einzelnen Gens (z. B. ob/ob mouse) die Ätiologie der multifaktoriellen menschlichen Krankheit auf molekularer Ebene8,9nicht imitieren darf. Ebenso kann die Krankheit, die von Mäusen nach diätetische oder pharmakologische Manipulation erworben wird, nicht die Auswirkungen der menschlichen Ernährung imitieren, die mit der Entwicklung von NAFLD beim Menschen8verbunden ist. Tiermodelle haben jedoch Entwicklungen im Verständnis von NAFLD erleichtert, und dieser Ansatz ist derzeit die am häufigsten verwendete Strategie in der Laborforschung. Dennoch ist die Replikation der in Tiermodellen erzielten Ergebnisse beim Menschen wiederholt fehlgeschlagen, was zu einer schlechten Übersetzung in die Klinik10geführt hat.
Daher können In-vitro-Modelle von NAFLD eine grundlegende Rolle bei der Aufklärung der molekularen Mechanismen der NAFLD-Progression spielen, und sie stellen ein wertvolles Werkzeug dar, um eine große Anzahl von Verbindungen zu untersuchen. Primäre Zellkulturen, verewigte Zelllinien und Leberbiopsien wurden ausgiebig für Forschungszwecke verwendet11. Primäre menschliche Hepatozyten ähneln den klinischen Erkrankungen des Menschen, aber es gibt eine begrenzte Anzahl von Spendern, und primäre Zellkulturen zeigen aufgrund der Variabilität der Zellen eine schlechte Reproduzierbarkeit. Diese Beobachtungen, zusammen mit ethischen und logistischen Fragen, haben dazu geführt, dass die Verwendung von menschlichen primären Hepatozyten begrenzt wurde12. So stellen Leberzelllinien eine bequeme Alternative dar, die mehrere wesentliche Vorteile gegenüber der Primärkultur hat, da Leberzelllinien stetig wachsen, eine nahezu unbegrenzte Lebensdauer haben und einen stabilen Phänotyp haben. Darüber hinaus sind Zelllinien leicht zugänglich und die Kulturbedingungen von Leberzelllinien sind einfacher als die von primären Hepatozyten und sind zwischen verschiedenen Laboratorien standardisiert.
Hier beschreiben wir detailliert ein in vitro zellbasiertes Modell der vesikulären Lebersteatose, dargestellt durch hepatische differenzierte HepaRG-Zellen, die mit dem Fettsäure-Natriumoleat behandelt werden. Die HepaRG-Zelllinie wurde von einer weiblichen Patientin, die von einer Hepatitis-C-Infektion betroffen ist, und einem Edmondson-Grad-I-Gut differenzierten Lebertumor14festgestellt. Die HepaRG-Zelllinie ist eine menschliche bipotente Vorläuferzelllinie, die in der Lage ist, bei Exposition gegenüber 2% Dimethylsulfoxid (DMSO) zu zwei verschiedenen Zellphänotypen zu differenzieren: Gallen- und Hepatozyten-ähnliche Zellen. Differenzierte HepaRG-Zellen (dHepaRG) teilen einige Merkmale und Eigenschaften mit erwachsenen Hepatozyten und besitzen die Fähigkeit, leberspezifische Gene wie Albumin, AldolaseB, Cytochrom P450 2E1 (CYP2E1) und Cytochrom P450 3A4 (CYP3A4) stabil auszudrücken13 (Schritt 3). Die Behandlung von dHepaRG-Zellen mit dem Fettsäuresalz Natriumoleat (250 M) für 5 Tage führt zur Erzeugung von zytoplasmatischen Lipidtröpfchen, die die Auswirkungen der Fettleber14,15,17,18 ( Schritt 4). Die Anhäufung von Lipidtröpfchen kann leicht durch Oil Red O Färbung (Schritt 5) erkannt werden, einem Lysochrom-Fett-löslichen Farbstoff, der neutrale Triglyceride und Lipide rot-orange färbt. Zur effizienten Quantifizierung von Lipiden in fetthaltigem dHepaRG illustrieren wir hier die zytofluorimetrische Analyse nach der Färbung mit 4,4-Difluor-1,3,5,7-Tetramethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen (Bodipy 505/515) (Schritt 6), einer lipophilen fluoreszierenden Sonde, die intrazellulären Lipidkörpern und wurde zur Kennzeichnung von Lipidtröpfchen19verwendet. Darüber hinaus zeigen wir hier, wie die Steatose durch quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) (Schritt 7) Genexpression Deregulierung mehrerer metabolischer Gene in dHepaRG-Zellen zu bewerten. Um die Ansammlung von Lipidtröpfchen nach der Natriumoleatbehandlung weiter zu charakterisieren und zu quantifizieren, führten wir eine kohärente Anti-Stokes Raman Streumikroskopie (CARS) (Schritt 8) durch, eine innovative Technik, die die Visualisierung und Quantifizierung von Lipidtröpfchen ohne Kennzeichnung20,21.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:799px;" width="797">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Hyclone HyClone Fetal Clone II&#160;</td>
			<td style="width:240px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:143px;">SH30066</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">William&#8217;s E medium with GlutaMAX&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Thermofisher</td>
			<td>32551087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:240px;">SIGMA</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Insulin&#160;</td>
			<td style="width:240px;">SIGMA</td>
			<td>I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hydrocortisone hemisuccinate</td>
			<td style="width:240px;">SIGMA</td>
			<td>H2270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">DMSO, dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:240px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">D2438&#160;&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Sodium Oleate</td>
			<td style="width:240px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">O7501&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Methanol</td>
			<td style="width:240px;">SIGMA</td>
			<td>179337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:240px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">278475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BODIPY 505/515</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>D3921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">PBS</td>
			<td style="width:240px;">Thermofisher</td>
			<td>14190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formaldehyde solution</td>
			<td style="width:240px;">SIGMA</td>
			<td>252549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">RNAse free DNAseI</td>
			<td style="width:240px;">Promega</td>
			<td>M198A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass-bottomed dishes</td>
			<td style="width:240px;">Willco Wells</td>
			<td style="width:143px;">GWST-5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Oil Red solution</td>
			<td style="width:240px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">O625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">CellTiter 96 AQueous One Solution</td>
			<td style="width:240px;">Promega&#160;</td>
			<td style="width:143px;">G3582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">q-PCR oligo name</td>
			<td>Sequence</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ACACB FOR</td>
			<td>CAAGCCGATCACCAAGAGTAAA</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">ACACB REV</td>
			<td>CCCTGAGTTATCAGAGGCTGG</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:239px;">b-actin FOR</td>
			<td style="width:240px;">GCACTCTTCCAGCCTTCCT</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:239px;">b-actin REV</td>
			<td style="width:240px;">AGGTCTTTGCGGATGTCCAC</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ALBUMIN FOR</td>
			<td>TGCTTGAATGTGCTGATGACAGG</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ALBUMIN REV</td>
			<td>AAGGCAAGTCAGCAGGCATCTCATC</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ALDOB FOR</td>
			<td>GCATCTGTCAGCAGAATGGA&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ALDOB REV</td>
			<td>TAGACAGCAGCCAGGACCTT</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">APOB FOR</td>
			<td>CCTCCGTTTTGGTGGTAGAG</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">APOB REV</td>
			<td>&#160;CCTAAAAGCTGGGAAGCTGA</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">APOC3 FOR</td>
			<td>CTCAGCTTCATGCAGGGTTA</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">APOC3 REV</td>
			<td>GGTGCTCCAGTAGTCTTTCAG</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CPT1A FOR</td>
			<td>TCATCAAGAAATGTCGCACG</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CPT1A REV</td>
			<td>GCCTCGTATGTGAGGCAAAA</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CYP2E1 FOR</td>
			<td>TTGAAGCCTCTCGTTGACCC</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CYP2E1 REV</td>
			<td>CGTGGTGGGATACAGCCAA</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CYP3A4 FOR</td>
			<td>CTTCATCCAATGGACTGCATAAAT</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CYP3A4 REV</td>
			<td>TCCCAAGTATAACACTCTACACAGACAA</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GAPDH FOR</td>
			<td>TGACAACTTTGGTATCGTGGAAGG</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GAPDH REV</td>
			<td>AGGGATGATGTTCTGGAGAGCC</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GPAM FOR</td>
			<td>TCTTTGGGTTTGCGGAATGTT</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GPAM REV</td>
			<td>ATGCACATCTCGCTCTTGAATAA</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IL6 FOR</td>
			<td>CCTGAACCTTCCAAAGATGGC</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IL6 REV</td>
			<td>ACCTCAAACTCCAAAAGACCAGTG</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PDK4 FOR</td>
			<td>ACAGACAGGAAACCCAAGCCAC</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PDK4 REV</td>
			<td>TGGAGGTGAGAAGGAACATACACG</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PLIN2 FOR</td>
			<td>TTGCAGTTGCCAATACCTATGC</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PLIN2 REV</td>
			<td>CCAGTCACAGTAGTCGTCACA</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PLIN4 FOR</td>
			<td>AATGAGTTGGAGGGGCTGGGGGACATC</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PLIN4 REV</td>
			<td>GGTCACCTAAACGAACGAAGTAGC</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SCD FOR</td>
			<td>TCTAGCTCCTATACCACCACCA</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SCD REV</td>
			<td>TCGTCTCCAACTTATCTCCTCC</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SLC2A1 FOR</td>
			<td>TGCTCATCAACCGCAACGAG</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SLC2A1 REV</td>
			<td>CCGACTCTCTTCCTTCATCTCCTG</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">18S FOR</td>
			<td>CGCCGCTAGAGGTGAAATTC</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">18S REV</td>
			<td>TTGGCAAATGCTTTCGCTC</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducing and characterizing vesicular steatosis in differentiated heparg cells

Hepatische Steatose stellt eine metabolische Dysfunktion dar, die aus einer Anhäufung von Triglycerid-haltigen Lipidtröpfchen in Hepatozyten resultiert. Übermäßige Fettansammlung führt zu einer nicht-alkoholischen Fettlebererkrankung (NAFLD), die potenziell reversibel ist und sich zu alkoholfreier Steatohepatitis (NASH) und schließlich zu Zirrhose und hepatozellulärem Karzinom (HCC) entwickeln kann. Die molekularen Mechanismen, die die Fettakkumulation in Hepatozyten mit dem Fortschreiten zu NASH, irreversibleleber Leberschäden, Fibrose, Zirrhose und sogar HCC verbinden, sind noch unklar. Zu diesem Zweck wurden mehrere In-vitro- und In-vivo-Modelle entwickelt, um die pathologischen Prozesse aufzuklären, die NAFLD verursachen. In der vorliegenden Studie beschreiben wir ein zelluläres Modell für die Induktion der vesikulären Steatose der Leber, das aus DMSO-differenzierten menschlichen Hepatic-HepaRG-Zellen besteht, die mit dem Fettsäuresalz Natriumoleat behandelt werden. Tatsächlich akkumulieren Natriumoleat-behandelte HepaRG-Zellen Lipidtröpfchen im Zytoplasma und zeigen typische Merkmale der Steatose. Dieses in vitro humane Modell stellt eine wertvolle Alternative zu in vivo-Mäusemodellen sowie zu den primären menschlichen Hepatozyten dar. Wir präsentieren auch einen Vergleich mehrerer Methoden zur Quantifizierung und Bewertung der Fettansammlung in HepaRG-Zellen, einschließlich Oil Red O Färbung, zytofluorimetrische Rbodipy-Messung, metabolische Genexpressionsanalyse durch qPCR und kohärente Anti-Stokes Raman-Streumikroskopie (CARS). CARS Imaging kombiniert die chemische Spezifität der Raman-Spektroskopie, einer in materialwissenschaftlichen Anwendungen bekannten chemischen Analysetechnik, mit den Vorteilen von hochschnellen, hochauflösenden nichtlinearen optischen Mikrokopien, um präzise Quantifizierung der Lipidakkumulation und Lipidtröpfchendynamik. Die Erstellung eines effizienten In-vitro-Modells für die Induktion der vesikulären Steatose, zusammen mit einer genauen Methode zur Quantifizierung und Charakterisierung der Lipidakkumulation, könnte zur Entwicklung einer Frühstadiumdiagnose von NAFLD über die Identifizierung molekularer Marker und die Generierung neuer Behandlungsstrategien.

Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente Methode zur Induzieren und Charakterisierung der vesikulären Steatose in DMSO-differenzierten HepaRG-Zellen durch Natriumoleatbehandlung (Abbildung 1A).
Differenzierung von HepaRG-Zellen. Um eine Differenzierung effizient zu induzieren, müssen vermehrende Zellen mit einer geringen Dichte (2,5 x 104 Zellen/cm2) im Proliferationsmedium ausgesät werden. Bei gerin...

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Inducing and Characterizing Vesicular Steatosis in Differentiated HepaRG Cells

In dieser Studie beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Induktion von Lebervesikulärsteatose in differenzierten HepaRG-Zellen mit dem Fettsäuresalz Natriumoleat und verwenden Methoden zum Nachweis und zur Quantifizierung der Lipidakkumulation, einschließlich kohärenter Anti-Stokes Raman-Streuung (CARS) Mikroskopie, zytofluorimetrische Analyse, Ölrot O-Färbung und qPCR.

Induzieren und Charakterisieren der vesikulären Steatose in differenzierten HepaRG-Zellen

Hepatic steatosis represents a metabolic dysfunction that results from an accumulation of triglyceride-containing lipid droplets in hepatocytes. Excessive ...

Dieses Protokoll beschreibt, wie Leber vesikuläre Steatose in differenzierten HepaRG-Zellen und Methoden zum Nachweis und Quantifizierung der Lipidakkumulation induzieren. Dieses in vitro menschliche Zellmodell stellt eine wertvolle Alternative zu In-vivo-Mäusemodellen und zu primären menschlichen Hepatozyten dar. Tauen Sie eine Stickstoff kryokonserviert Low-Passage-Charge von HepaRG-Zellen, indem Sie sie in ein 37 Grad Celsius Bad, bis aufgetaut.Übertragen Sie die Zellen schnell in eine 15-Milliliter-Röhre mit 10 Millilitern proliferierendem Medium. Nach fünf Minuten Zentrifugieren den Überstand entsorgen und die Zellen in fünf Millilitern proliferierendem Medium wieder aussetzen. Zählen Sie die Zellen und verdünnen Sie, um 250.000 Zellen pro Quadratzentimeter zu versiebenen.Die Zellen auf 100-Millimeter-Zellkulturschalen auftun und das Medium alle zwei bis drei Tage erneuern. Zellen vermehren sich mit einer Verdoppelungszeit von etwa 24 Stunden. Sobald die HepaRG-Zellen 80% Konfluenz erreichen, lösen Sie sie durch eine drei- bis fünfminütige Inkubation mit 0,05%Trypsin-Lösung.Sammeln Sie die Zellen in proliferierenden Medium und Zentrifuge für fünf Minuten wie zuvor. Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen mit fünf Millilitern proliferierendem Medium. Wiederum die Zellen zählen und verdünnen, um 250.000 Zellen pro Quadratzentimeter zu versiebenen.Verstärken Sie in diesem Stadium die Zellen, indem Sie diese Schritte wiederholen, um eine angemessene Anzahl von Zellen zu erreichen, um Experimente zu starten. Um HepaRG-Zellen kryokonservieren zu können, lösen Sie die Zellen 24 Stunden nach der Beschichtung durch eine drei- bis fünfminütige Inkubation mit 0,05%Trypsin-Lösung. Sammeln Sie die Zellen in proliferierenden Medium und Zentrifuge für fünf Minuten wie zuvor.Entsorgen Sie den Überstand, setzen Sie die Zellen in einem Milliliter pro Charge Gefriermedium wieder auf und kryoservieren Sie die Chargen in flüssigem Stickstoff. Am Tag Null, Samen HepaRG Zellen bei 250.000 Zellen pro Quadratzentimeter in kulturbehandelte Gerichte mit einem entsprechenden Volumen der Proliferation Medium. Für jeden Assay müssen zwei Gerichte plattiert werden, eines für Kontrollzellen und eines für oleatbehandelte Zellen.Ändern Sie am zweiten und vierten Tag das Medium mit einem geeigneten Proliferationsmedium und lassen Sie die Zellen wachsen, bis sie den Zusammenfluss erreichen. Am siebten Tag müssen die Zellen zu 100% konfluent sein. Waschen Sie die Zellen einmal mit 1X PBS.Entfernen Sie dann die 1X-PBS, und fügen Sie ein entsprechendes Volumen des Differenzierungsmediums hinzu. An den Tagen acht, neun, zwölf, 15 und 18 waschen Sie die Zellen einmal mit 1X PBS, bevor Sie ein entsprechendes Volumen des Differenzierungsmediums hinzufügen. Beobachten Sie am 21. Tag HepaRG-Zellen unter dem Mikroskop und stellen Sie sicher, dass die Zellen konfluente differenzierte Kulturen sind.Als Kontrolle, Ernten Sie eine Kontrollschale, um Genexpressionsanalyse von Differenzierungmarkergenen durchzuführen. Am 21. Tag können differenzierte HepaRG-Zellen in flüssigem Stickstoff kryokonserviert werden. Am 21. Tag Natriumoleat mit einem entsprechenden Volumen vollständiger Differenzierungsmediumaufe auf eine Endkonzentration von 250 Mikromolaren verdünnen.Fügen Sie 99% Methanol im Verhältnis eins zu 400 in ein anderes Aliquot von Differenzierungsmedium, um die Fahrzeugsteuerung zu machen. Waschen Sie die Zellen einmal mit 1X PBS und fügen Sie Fahrzeug oder Natriumoleat Medium. Wechseln Sie am 23. und 25. Tag das Medium mit dem entsprechenden Volumen des frisch zubereiteten Mediums.Beobachten Sie die Zellen am 26. Tag durch optische Mikroskopie. Lipidtröpfchen sammeln sich in den natriumoleat behandelten Zellen an und sind als transluzente Tröpfchen im Zytoplasma gut sichtbar. Um Oil Red O Färbung durchzuführen, waschen Sie zuerst die Zellen einmal mit 1X PBS und entfernen Sie die 1X PBS vollständig.4% Paraformaldehyd hinzufügen und 15 Minuten bei Raumtemperatur brüten. Entfernen Sie das Paraformaldehyd und waschen Sie die Zellen zweimal mit 1X PBS. Nach dem Entfernen der PBS, inkubieren Sie die Zellen mit 60%Isopropanol für fünf Minuten bei Raumtemperatur.Entfernen Sie das Isopropanol und lassen Sie die Zellen bei Raumtemperatur vollständig trocknen. Fügen Sie nun Oil Red O Arbeitslösung zu den Zellen und inkubieren bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Das für jede Probe erforderliche Arbeitsvolumen entspricht dem Medienvolumen, das für die Zellkultivierung verwendet wird.Entfernen Sie die Oil Red O-Lösung und fügen Sie sofort doppelt destilliertes Wasser hinzu. Nachdem Sie die Zellen viermal mit doppelt destilliertem Wasser gewaschen haben, erfassen Sie Bilder unter dem Mikroskop zur Analyse. Um den Öl-Rot-O-Farbstoff zu lösen, entfernen Sie das gesamte Wasser und lassen Sie es trocknen.Dann einen Milliliter 100%Isopropanol hinzufügen und 10 Minuten mit sanftem Schütteln bei Raumtemperatur inkubieren. Pipette das Isopropanol mit eluierten Öl Red O Farbstoff auf und ab mehrmals, um sicherzustellen, dass das gesamte Öl Rot O in der Lösung ist. Übertragen Sie die Lösung auf eine Küvette.Messen Sie die optische Dichte bei 500 Nanometern durch Spektrophotometrie und verwenden Sie 100%isopropanol als Rohling. Waschen Sie die Zellen einmal mit 1X PBS. Dann mit 100 Nanomolar von Bodipy in 1X PBS in der Dunkelheit für 40 Minuten bei 37 Grad Celsius verdünnt.Eine unbefleckte Steuerung sollte in die Durchflusszytometriemessungen einbezogen werden. Entfernen Sie die Färbelösung und waschen Sie die Zellen einmal mit 1X PBS. Dann waschen Sie die Zellen erneut und entfernen Sie die PBS vollständig.4% Paraformaldehyd hinzufügen und 15 Minuten bei Raumtemperatur brüten. Entfernen Sie das Paraformaldehyd und waschen Sie die Proben dreimal für fünf Minuten in PBS. Zellen können in 1X PBS bei vier Grad Celsius gehalten oder sofort abgebildet werden.Zur Lagerung mit Parafilm umwickeln und mit Aluminiumfolie abdecken, um das Trocknen der Zellen zu verhindern. Zur Überprüfung der effizienten Induktion von Steatose wurden oleatbehandelte und kontrollierte HepaRG-Zellen mit Ölrot-O-Farbstoff gefärbt. Nach der Färbung sind Lipidtröpfchen als rote Tröpfchen gut sichtbar.Die Färbung kann durch spektrophotometrische Messung des mit Isopropanol eluierten Öl-R-O-Farbstoffs quantifiziert werden. Die Absorption von eluiertem Öl Rot O aus den Zellen ist direkt proportional zur zytoplasmatischen Lipidtröpfchenakkumulation. Die Natriumoleatkonzentration und die Expositionszeit wurden durch MTT colorimetric cell viability assay bestimmt.Das Formosan-Produkt wird durch seine Absorption von 490 Nanometern quantifiziert und ist direkt proportional zur Anzahl der lebenden Zellen in der Kultur. Die Natriumoleatbehandlung wurde mit der Natriumpalmitatbehandlung verglichen. Das apoptotische Medikament Doxorubicin wurde als Kontrolle verwendet.Um den Anstieg des zellulären Lipidgehalts nach der Natriumoleatbehandlung zu quantifizieren, wurde die Färbung mit Bodipy-Farbstoff verwendet, um Lipidtröpfchen zu kennzeichnen. Mittels zytofluorometrischer Analyse ist es möglich, den Triglyceridgehalt durch Bodipy-Mittelfluoreszenzintensität zu quantifizieren, die in oleatbehandelten Zellen höher ist als in Kontrollzellen. Dies deutet auf eine effiziente Fettansammlung nach der Oleatbehandlung hin.Tatsächlich zeigen Bilder von Bodipy-gefärbten Zellen hellgrüne fluoreszierende Lipidtröpfchen in oleatbehandelten Zellen, die in den Kontrollzellen nicht sichtbar sind. Um die Ansammlung von Lipidtröpfchen nach der Natriumoleatbehandlung weiter zu charakterisieren, kann die CARS-Mikroskopie wie im Textprotokoll beschrieben durchgeführt werden, das eine Quantifizierung von Lipidtröpfchen ohne Etikettierung ermöglicht. Dieses zellbasierte Modell kann das Wissen über die molekularen Mechanismen, die an nicht-onkotischen Fettlebererkrankungen beteiligt sind, erweitern und zur Entwicklung neuer Marker für die Frühdiagnose und neue Behandlungsstrategien führen.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Isolation, Charakterisierung und vergleichende Differenzierung humaner Dental Pulp Stammzellen aus bleibenden Zähne mit zwei verschiedenen Methoden abgeleitet

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Forschung

Medizin

Inducing Myointimal Hyperplasia Versus Atherosclerosis in Mice: An Introduction of Two Valid Models

Induktion Myointimale Hyperplasie Versus Atherosklerose in Mäuse: Eine Einführung von zwei gültigen Modelle

Various in vivo laboratory rodent models for the induction of artery stenosis have been established to mimic diseases that include arterial plaque ...

Minimal Invasive Surgical Procedure of Inducing Myocardial Infarction in Mice

Minimal-invasive chirurgische Verfahren zur Induktion Myokardinfarkt in Mice

Myocardial infarction still remains the main cause of death in western countries, despite considerable progress in the stent development area in the last ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Studieren Bauchspeicheldrüsenkrebs Stammzelleigenschaften für die Entwicklung neuer Behandlungsstrategien

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma auslösende Verfahren in ein<em&gt; In Vivo</em&gt; Rat Modell und Whole-mount Retina Vorbereitung

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

Inducing Ischemia-reperfusion Injury in the Mouse Ear Skin for Intravital Multiphoton Imaging of Immune Responses

Induzierende Ischemia-Reperfusionsschaden in der Maus-Ohr-Haut für intravital Multiphotonenionisation Imaging von Immunantworten

Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induzierte Quellung in Intestinale Organoide: Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Assay für Fibrosis Patienten in Cystic Drug Response-Beurteilung

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Optimierte Analyse von<em&gt; In Vivo</em&gt; und<em&gt; In Vitro</em&gt; Hepatosteatose

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic ...

Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation

Induzieren akute Lungenschädigung bei Mäusen durch direkte intratracheale Lipopolysaccharid-Instillation

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. ...

A Revised Method for Inducing Secondary Lymphedema in the Hindlimb of Mice

Eine überarbeitete Methode zur Induktion von Sekundärlymphödemen im Hinterglied von Mäusen

Animal models are of paramount importance in the research of lymphedema in order to understand the pathophysiology of the disease but also to explore ...