Name: inducing and characterizing vesicular steatosis in differentiated heparg cells
Uploaded: 2019-07-18T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inducing and Characterizing Vesicular Steatosis in Differentiated HepaRG Cells at JoVE.com

Ringraziamo il prof. Siamo grati a Rita Appodia per l'assistenza amministrativa. Questo lavoro è stato sostenuto da MIUR- Profession del' dell'università e della ricerca (FIRB 2011–2016 RBAP10XKNC) e Sapienza University of Rome (prot. C26A13T8PS; Prot. C26A142MCH; Prot. C26A15LSXL).

1. Preparazione dei mezzi di coltura e dei reagenti
<ol><li>Mezzo proliferante: supplemento E medio di William con GlutaMAX, 10% siero bovino fetale (FBS), 1% penicillina / streptomicina, 5 g / mL di insulina e 0,5M di idrocortisone emisuccinato.</li>
	<li>Mezzi di differenziazione: supplemento E medio di William con GlutaMAX, 10% FBS, 1% penicillina / streptomicina, 5 g / mL di insulina, 50 emisuccinato idrocortisone M e 2% DMSO.</li>
	<li>Mezzo di congelamento: integrare il mezzo proliferante con 10% DMSO.</li>
	<li>...

<ol>
	<li>Starley, B. Q., Calcagno, C. J., Harrison, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonalcoholic+fatty+liver+disease+and+hepatocellular+carcinoma:+a+weighty+connection.">Nonalcoholic fatty liver disease and hepatocellular carcinoma: a weighty connection.</a> Hepatology. 51 (5), 1820-1832 (2010).</li><li>Byrne, C. D., Targher, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NAFLD:+a+multisystem+disease.">NAFLD: a multisystem disease.</a> Journal of Hepatology. 62 (1), 47-64 (2015).</li><li>Marra, F., Gastaldelli, A., Svegliati Baroni, G., Tell, G., Tiribelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+and+mechanisms+of+progression+of+non-+alcoholic+steatohepatitis.">Molecular basis and mechanisms of progression of non- alcoholic steatohepatitis.</a> Trends in Molecular Medicine. 14, 72-81 (2008).</li><li>Chalasani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diagnosis+and+management+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease:+Practice+guidance+from+the+American+Association+for+the+Study+of+Liver+Diseases.">The diagnosis and management of nonalcoholic fatty liver disease: Practice guidance from the American Association for the Study of Liver Diseases.</a> Hepatology. 67 (1), 328-357 (2018).</li><li>Banini, B. A., Sanyal, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+future+pharmacologic+treatment+of+nonalcoholic+steatohepatitis.">Current and future pharmacologic treatment of nonalcoholic steatohepatitis.</a> Current Opinion in Gastroenterology. 33 (3), 134-141 (2017).</li><li>Takahashi, Y., Sugimoto, K., Inui, H., Fukusato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+pharmacological+therapies+for+nonalcoholic+fatty+liver+disease/nonalcoholic+steatohepatitis.">Current pharmacological therapies for nonalcoholic fatty liver disease/nonalcoholic steatohepatitis.</a> World Journal of Gastroenterology. 21 (13), 3777-3785 (2015).</li><li>Younossi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+burden+of+NAFLD+and+NASH:+trends,+predictions,+risk+factors+and+prevention.">Global burden of NAFLD and NASH: trends, predictions, risk factors and prevention.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 15 (1), 11-20 (2018).</li><li>Santhekadur, P. K., Kumar, D. P., Sanyal, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+models+of+non-alcoholic+fatty+liver+disease.">Preclinical models of non-alcoholic fatty liver disease.</a> Journal of Hepatology. 68 (2), 230-237 (2018).</li><li>Nagarajan, P., Mahesh Kumar, M. J., Venkatesan, R., Majundar, S. S., Juyal, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+modified+mouse+models+for+the+study+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease.">Genetically modified mouse models for the study of nonalcoholic fatty liver disease.</a> World Journal of. Gastroenterology. 18 (11), 1141-1153 (2012).</li><li>Oseini, A. M., Cole, B. K., Issa, D., Feaver, R. E., Sanyal, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+scientific+discovery:+the+need+for+preclinical+models+of+nonalcoholic+steatohepatitis.">Translating scientific discovery: the need for preclinical models of nonalcoholic steatohepatitis.</a> Hepatology International. 12 (1), 6-16 (2018).</li><li>Ramboer, E., Vanhaecke, T., Rogiers, V., Vinken, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalized+human+hepatic+cell+lines+for+in+vitro+testing+and+research+purposes.">Immortalized human hepatic cell lines for in vitro testing and research purposes.</a> Methods in Molecular Biology. 1250, 53-76 (2015).</li><li>G&#243;mez-Lech&#243;n, M. J., Donato, M. T., Castell, J. V., Jover, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hepatocytes+in+primary+culture:+the+choice+to+investigate+drug+metabolism+in+man.">Human hepatocytes in primary culture: the choice to investigate drug metabolism in man.</a> Current Drug Metabolism. 5 (5), 443-462 (2004).</li><li>Marion, M. J., Hantz, O., Durantel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HepaRG+cell+line:+biological+properties+and+relevance+as+a+tool+for+cell+biology,+drug+metabolism,+and+virology+studies.">The HepaRG cell line: biological properties and relevance as a tool for cell biology, drug metabolism, and virology studies.</a> Methods in Molecular Biology. 640, 261-272 (2010).</li><li>Gripon, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+a+human+hepatoma+cell+line+by+hepatitis+B+virus.">Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (24), 15655-15660 (2002).</li><li>Anth&#233;rieu, S., Rogue, A., Fromenty, B., Guillouzo, A., Robin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+vesicular+steatosis+by+amiodarone+and+tetracycline+is+associated+with+up-regulation+of+lipogenic+genes+in+HepaRG+cells.">Induction of vesicular steatosis by amiodarone and tetracycline is associated with up-regulation of lipogenic genes in HepaRG cells.</a> Hepatology. 53 (6), 1895-1905 (2011).</li><li>Rouge, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PPAR+agonists+reduce+steatosis+in+oleic+acid-overloaded+HepaRG+cells.">PPAR agonists reduce steatosis in oleic acid-overloaded HepaRG cells.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 276 (1), 73-81 (2014).</li><li>Belloni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+a+phospho-STAT3-miRNAs+pathway+improves+vesicular+hepatic+steatosis+in+an+in+vitro+and+in+vivo+model.">Targeting a phospho-STAT3-miRNAs pathway improves vesicular hepatic steatosis in an in vitro and in vivo model.</a> Scientific Reports. 8, 13638 (2018).</li><li>Nunn, A. D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histone+deacetylase+inhibiting+drug+Entinostat+induces+lipid+accumulation+in+differentiated+HepaRG+cells.">The histone deacetylase inhibiting drug Entinostat induces lipid accumulation in differentiated HepaRG cells.</a> Scientific Reports. 6, 28025 (2016).</li><li>Donato, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytometric+analysis+for+drug-induced+steatosis+in+HepG2+cells.">Cytometric analysis for drug-induced steatosis in HepG2 cells.</a> Chemico-Biological Interactions. 181 (3), 417-423 (2009).</li><li>Hellerer, T., Ax&#228;ng, C., Brackmann, C., Hillertz, P., Pilon, M., Enejder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+lipid+storage+in+Caenorhabditis+elegans+using+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+(CARS)+microscopy.">Monitoring of lipid storage in Caenorhabditis elegans using coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (37), 14658-14663 (2007).</li><li>Le, T. T., Ziemba, A., Urasaki, Y., Brotman, S., Pizzorno, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+evaluation+of+hepatic+microvesicular+steatosis+with+multimodal+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy.">Label-free evaluation of hepatic microvesicular steatosis with multimodal coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy.</a> PLoS One. 7 (11), 51092 (2012).</li><li>Guillouzo, A., Corlu, A., Aninat, C., Glaise, D., Morel, F., Guguen-Guillouzo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+hepatoma+HepaRG+cells:+a+highly+differentiated+model+for+studies+of+liver+metabolism+and+toxicity+of+xenobiotics.">The human hepatoma HepaRG cells: a highly differentiated model for studies of liver metabolism and toxicity of xenobiotics.</a> Chemico-Biological Interactions. 168 (1), 66-73 (2007).</li><li>Nelson, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hepatic+HepaRG+cells+maintain+an+organotypic+phenotype+with+high+intrinsic+CYP450+Activity/metabolism+and+significantly+outperform+standard+HepG2/C3A+cells+for+pharmaceutical+and+therapeutic+applications.">Human hepatic HepaRG cells maintain an organotypic phenotype with high intrinsic CYP450 Activity/metabolism and significantly outperform standard HepG2/C3A cells for pharmaceutical and therapeutic applications.</a> Basic &amp; Clinical Pharmacology &amp; Toxicology. 120 (1), 30-37 (2017).</li><li>Gerets, H. H. J., Tilmant, K., Gerin, B., Chanteux, H., Depelchin, B. O., Dhalluin, S., Atienzar, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+primary+human+hepatocytes,+HepG2+cells,+and+HepaRG+cells+at+the+mRNA+level+and+CYP+activity+in+response+to+inducers+and+their+predictivity+for+the+detection+of+human+hepatotoxins.">Characterization of primary human hepatocytes, HepG2 cells, and HepaRG cells at the mRNA level and CYP activity in response to inducers and their predictivity for the detection of human hepatotoxins.</a> Cell Biology and Toxicology. 28 (2), 69-87 (2012).</li><li>Pusl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+fatty+acids+sensitize+hepatocytes+to+bile+acid-induced+apoptosis.">Free fatty acids sensitize hepatocytes to bile acid-induced apoptosis.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 371 (3), 441-445 (2008).</li><li>Gentile, C. L., Pagliassotti, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+fatty+acids+in+the+development+and+progression+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease.">The role of fatty acids in the development and progression of nonalcoholic fatty liver disease.</a> The Journal of Nutritional Biochemistry. 19 (9), 567-576 (2008).</li><li>Mei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+roles+of+unsaturated+and+saturated+fatty+acids+on+autophagy+and+apoptosis+in+hepatocytes.">Differential roles of unsaturated and saturated fatty acids on autophagy and apoptosis in hepatocytes.</a> Journal of Pharmacological Experimental Therapy. 339, 487-498 (2011).</li><li>Malhi, H., Bronk, S. F., Werneburg, N. W., Gores, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+fatty+acids+induce+JNK-dependent+hepatocyte+lipoapoptosis.">Free fatty acids induce JNK-dependent hepatocyte lipoapoptosis.</a> Journal of Biological Chemistry. 281, 12093-12101 (2006).</li><li>Moravcov&#225;, A., &#268;ervinkov&#225;, Z., Ku&#269;era, O., Mezera, V., Rychtrmoc, D., Lotkov&#225;, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+oleic+and+palmitic+acid+on+induction+of+steatosis+and+cytotoxicity+on+rat+hepatocytes+in+primary+culture.">The effect of oleic and palmitic acid on induction of steatosis and cytotoxicity on rat hepatocytes in primary culture.</a> Physiological Research. 64, 627-636 (2015).</li><li>Ohsaki, Y., Shinohara, Y., Suzuki, M., Fujimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pitfall+in+using+BODIPY+dyes+to+label+lipid+droplets+for+fluorescence+microscopy.">A pitfall in using BODIPY dyes to label lipid droplets for fluorescence microscopy.</a> Histochemistry and Cell Biology. 133 (4), 477-480 (2010).</li><li>Rinia, H. A., Burger, K. N., Bonn, M., M&#252;ller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+label-free+imaging+of+lipid+composition+and+packing+of+individual+cellular+lipid+droplets+using+multiplex+CARS+microscopy.">Quantitative label-free imaging of lipid composition and packing of individual cellular lipid droplets using multiplex CARS microscopy.</a> Biophysical Journal. 95 (10), 4908-4914 (2008).</li><li>Waschatko, G., Billecke, N., Schwendy, S., Jaurich, H., Bonn, M., Vilgis, T. A., Parekh, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+in+situ+imaging+of+oil+body+dynamics+and+chemistry+in+germination.">Label-free in situ imaging of oil body dynamics and chemistry in germination.</a> Journal of The Royal Society Interface. 13 (123), (2016).</li><li>J&#252;ngst, C., Winterhalder, M. J., Zumbusch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+long+term+lipid+droplet+tracking+with+CARS+microscopy.">Fast and long term lipid droplet tracking with CARS microscopy.</a> Journal of Biophotonics. 4 (6), 435-441 (2011).</li><li>Welte, M. A., Gould, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplet+functions+beyond+energy+storage.">Lipid droplet functions beyond energy storage.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (10), 1260-1272 (2017).</li><li>Cohen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+as+organelles.">Lipid droplets as organelles.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 337, 83-110 (2018).</li><li>Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+finally+get+a+little+R-E-S-P-E-C-T.">Lipid droplets finally get a little R-E-S-P-E-C-T.</a> Cell. 139 (5), 855-860 (2009).</li></ol>

Questo protocollo descrive come differenziare le cellule HepaRG e come indurre la steatosi vescicolare mediante trattamento con oleate di sodio (Figura 1A). Infatti, rispetto ad altre linee cellulari umane del carcinoma epatocellulare (HCC), la linea cellulare HepaRG presenta caratteristiche di epatociti umani adulti, che rappresentano una valida alternativa agli epaticiti umani primari coltivati espansioni13,14 <su...

La steatosi epatica è definita come accumulo di grasso intraepatico, all'interno di goccioline di lipidi contenenti trigliceridi, di almeno il 5% del peso del fegato. L'immagazzinamento prolungato di lipidi epatici è un processo potenzialmente reversibile, tuttavia, può portare a disfunzione metabolica del fegato epatico, infiammazione e forme avanzate di malattia epatica grassa non alcolica (NAFLD), la causa predominante della malattia cronica del fegato in molte parti il mondo1,2. NAFLD è una malattia multifattoriale che può evolvere verso la steatoepatite non alcolica più aggressiva (NASH), che a sua volta può progredire in cirrosi e, in una piccola percentuale di pazienti, al carcinoma epatocellulare (HCC)1,3. Nessuna terapia approvata è attualmente disponibile come trattamento specifico per NAFLD e la combinazione di modifiche di dieta e stile di vita rimane il pilastro della gestione NAFLD e NASH4,5,6.
I meccanismi molecolari che portano allo sviluppo della steatosi epatica nella patogenesi del NAFLD rimangono ancora da chiarire7. In questo contesto, sono stati sviluppati modelli murini per studiare la progressione della malattia da steatosi umana. Esiste una miriade di modelli diversi, ognuno dei quali ha i suoi vantaggi e svantaggi, compresi i modelli genetici, nutrizionali e indotti chimicamente che combinano approcci diversi. I topi geneticamente modificati (transgenici o knockout) sviluppano spontaneamente malattie epatiche. Tuttavia, va notato che queste mutazioni sono molto rare nell'uomo e la delezione o sovraespressione di un singolo gene (ad esempio, topo ob/ob) non può imitare l'eziologia della malattia umana multifattoriale al livello molecolare8,9. Allo stesso modo, la malattia acquisita dai topi dopo la manipolazione dietetica o farmacologica non può imitare gli effetti delle diete umane associate allo sviluppo di NAFLD nell'uomo8. I modelli animali, tuttavia, hanno facilitato gli sviluppi nella comprensione del NAFLD e questo approccio è attualmente la strategia attualmente più utilizzata nella ricerca di laboratorio. Tuttavia, la replicazione negli esseri umani dei risultati ottenuti in modelli animali ha ripetutamente fallito, causando una cattiva traduzione nella clinica10.
Pertanto, i modelli in vitro di NAFLD possono svolgere un ruolo fondamentale nel chiarire i meccanismi molecolari della progressione NAFLD e rappresentano uno strumento prezioso per vagliare un gran numero di composti. Colture cellulari primarie, linee cellulari immortalate e biopsie epatiche sono state ampiamente utilizzate per scopi di ricerca11. Gli epatociti umani primari assomigliano molto alle condizioni cliniche umane, ma c'è un numero limitato di donatori, e le colture cellulari primarie mostrano scarsa riproducibilità a causa della variabilità delle cellule. Queste osservazioni, insieme a questioni etiche e logistiche, hanno portato all'uso di equali primari umani limitati12. Così, le linee cellulari epatiche rappresentano una comoda alternativa, avendo diversi vantaggi essenziali rispetto alla cultura primaria, poiché le linee cellulari epatiche crescono costantemente, hanno una durata di vita quasi illimitata e hanno un fenotipo stabile. Inoltre, le linee cellulari sono facilmente accessibili e le condizioni di coltura delle linee cellulari epatiche sono più semplici di quelle degli epediti primari e sono standardizzate tra diversi laboratori.
Qui, descriviamo in dettaglio un modello in vitro basato sulle cellule di steatosi epatica, rappresentato da cellule HepaRG differenziate epatiche trattate con l'oleato di sodio acido grasso. La linea cellulare HepaRG è stata stabilita da una paziente donna affetto da infezione da epatite C e da un tumore al fegato di Edmondson di grado I ben differenziato14. La linea cellulare HepaRG è una linea cellulare del progenitore biformicello umana in grado di differenziare l'esposizione al 2% di solforo dimetilo (DMSO) verso due diversi fenotipi cellulari: cellule biliari ed epatocitiche. Le cellule HepaRG differenziate (dHepaRG) condividono alcune caratteristiche e proprietà con gli epatociti adulti e possiedono la capacità di esprimere stabilmente geni specifici del fegato come Albumin, AldolaseB, Cytochrome P450 2E1 (CYP2E1) e Cytochrome P450 3A4 (CYP3A4)13 (passaggio 3). Il trattamento delle cellule dHepaRG con l'acido grasso sale sodio oleate (250 m) per 5 giorni porta alla generazione di goccioline lipidici citoplasmiche, imitando gli effetti del fegato grasso14,15,17,18 ( al punto 4). L'accumulo di goccioline lipidiche può essere facilmente rilevato dalla colorazione Oil Red O (fase 5), un colorante liposocroso solubile che macchia trigliceridi neutri e lipidi rosso-arancione. Per quantificare in modo efficiente i lipidi nel dHepaRG grasso, qui illustriamo l'analisi citofluorimetrica dopo la colorazione con 4,4-difluoro-1,3,7-tetramethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene (Bodipy 505/515) (passaggio 6), un lipofilificante locale ai corpi lipidici intracellulari ed è stato utilizzato per etichettare le goccioline di lipidi19. Inoltre, qui mostriamo come valutare la steatosi mediante reazione quantitativa della catena di polimerasi (qPCR) (passaggio 7) la deregolazione dell'espressione genica di diversi geni metabolici nelle cellule dHepaRG. Per caratterizzare ulteriormente e quantificare l'accumulo di goccioline di lipidi dopo il trattamento dell'oleate di sodio, abbiamo eseguito una microscopia coerente anti-Stokes Raman scattering (CARS) (fase 8), una tecnica innovativa che consente la visualizzazione e la quantificazione goccioline lipidiche senza etichettare20,21.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:799px;" width="797">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Hyclone HyClone Fetal Clone II&#160;</td>
			<td style="width:240px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:143px;">SH30066</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">William&#8217;s E medium with GlutaMAX&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Thermofisher</td>
			<td>32551087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:240px;">SIGMA</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Insulin&#160;</td>
			<td style="width:240px;">SIGMA</td>
			<td>I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hydrocortisone hemisuccinate</td>
			<td style="width:240px;">SIGMA</td>
			<td>H2270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">DMSO, dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:240px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">D2438&#160;&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Sodium Oleate</td>
			<td style="width:240px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">O7501&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Methanol</td>
			<td style="width:240px;">SIGMA</td>
			<td>179337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:240px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">278475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BODIPY 505/515</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>D3921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">PBS</td>
			<td style="width:240px;">Thermofisher</td>
			<td>14190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formaldehyde solution</td>
			<td style="width:240px;">SIGMA</td>
			<td>252549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">RNAse free DNAseI</td>
			<td style="width:240px;">Promega</td>
			<td>M198A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass-bottomed dishes</td>
			<td style="width:240px;">Willco Wells</td>
			<td style="width:143px;">GWST-5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Oil Red solution</td>
			<td style="width:240px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">O625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">CellTiter 96 AQueous One Solution</td>
			<td style="width:240px;">Promega&#160;</td>
			<td style="width:143px;">G3582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">q-PCR oligo name</td>
			<td>Sequence</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ACACB FOR</td>
			<td>CAAGCCGATCACCAAGAGTAAA</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">ACACB REV</td>
			<td>CCCTGAGTTATCAGAGGCTGG</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:239px;">b-actin FOR</td>
			<td style="width:240px;">GCACTCTTCCAGCCTTCCT</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:239px;">b-actin REV</td>
			<td style="width:240px;">AGGTCTTTGCGGATGTCCAC</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ALBUMIN FOR</td>
			<td>TGCTTGAATGTGCTGATGACAGG</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ALBUMIN REV</td>
			<td>AAGGCAAGTCAGCAGGCATCTCATC</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ALDOB FOR</td>
			<td>GCATCTGTCAGCAGAATGGA&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ALDOB REV</td>
			<td>TAGACAGCAGCCAGGACCTT</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">APOB FOR</td>
			<td>CCTCCGTTTTGGTGGTAGAG</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">APOB REV</td>
			<td>&#160;CCTAAAAGCTGGGAAGCTGA</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">APOC3 FOR</td>
			<td>CTCAGCTTCATGCAGGGTTA</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">APOC3 REV</td>
			<td>GGTGCTCCAGTAGTCTTTCAG</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CPT1A FOR</td>
			<td>TCATCAAGAAATGTCGCACG</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CPT1A REV</td>
			<td>GCCTCGTATGTGAGGCAAAA</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CYP2E1 FOR</td>
			<td>TTGAAGCCTCTCGTTGACCC</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CYP2E1 REV</td>
			<td>CGTGGTGGGATACAGCCAA</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CYP3A4 FOR</td>
			<td>CTTCATCCAATGGACTGCATAAAT</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CYP3A4 REV</td>
			<td>TCCCAAGTATAACACTCTACACAGACAA</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GAPDH FOR</td>
			<td>TGACAACTTTGGTATCGTGGAAGG</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GAPDH REV</td>
			<td>AGGGATGATGTTCTGGAGAGCC</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GPAM FOR</td>
			<td>TCTTTGGGTTTGCGGAATGTT</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GPAM REV</td>
			<td>ATGCACATCTCGCTCTTGAATAA</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IL6 FOR</td>
			<td>CCTGAACCTTCCAAAGATGGC</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IL6 REV</td>
			<td>ACCTCAAACTCCAAAAGACCAGTG</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PDK4 FOR</td>
			<td>ACAGACAGGAAACCCAAGCCAC</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PDK4 REV</td>
			<td>TGGAGGTGAGAAGGAACATACACG</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PLIN2 FOR</td>
			<td>TTGCAGTTGCCAATACCTATGC</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PLIN2 REV</td>
			<td>CCAGTCACAGTAGTCGTCACA</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PLIN4 FOR</td>
			<td>AATGAGTTGGAGGGGCTGGGGGACATC</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PLIN4 REV</td>
			<td>GGTCACCTAAACGAACGAAGTAGC</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SCD FOR</td>
			<td>TCTAGCTCCTATACCACCACCA</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SCD REV</td>
			<td>TCGTCTCCAACTTATCTCCTCC</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SLC2A1 FOR</td>
			<td>TGCTCATCAACCGCAACGAG</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SLC2A1 REV</td>
			<td>CCGACTCTCTTCCTTCATCTCCTG</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">18S FOR</td>
			<td>CGCCGCTAGAGGTGAAATTC</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">18S REV</td>
			<td>TTGGCAAATGCTTTCGCTC</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducing and characterizing vesicular steatosis in differentiated heparg cells

La steatosi epatica rappresenta una disfunzione metabolica che deriva da un accumulo di goccioline di lipidi trigliceridi contenenti epatociti. L'eccessivo accumulo di grasso porta alla malattia del fegato grasso non alcolico (NAFLD), che è potenzialmente reversibile e può evolvere in steatoepatite analcolica (NASH) e infine cirrosi e carcinoma epatocellulare (HCC). I meccanismi molecolari che collegano l'accumulo di lipidi negli epatociti con la progressione alla NASH, danni epatici irreversibili, fibrosi, cirrosi, e anche HCC rimane ancora poco chiaro. A tal fine, sono stati sviluppati diversi modelli in vitro e in vivo per chiarire i processi patologici che causano NAFLD. Nel presente studio, descriviamo un modello cellulare per l'induzione della steatosi vescicolare del fegato che consiste di cellule Epatiche Epatiche Epatiche EpaRG epatiche differenziate d'AmSO trattate con l'acido grasso sale oleume di sodio. Infatti, le cellule HepaRG trattate con oleato di sodio accumulano goccioline lipidiche nel citoplasma e mostrano caratteristiche tipiche della steatosi. Questo modello umano in vitro rappresenta una valida alternativa ai modelli di topi in vivo e ai primari epediti umani. Presentiamo anche un confronto di diversi metodi per la quantificazione e la valutazione dell'accumulo di grasso nelle cellule HepaRG, tra cui la colorazione ORossa dell'olio, la misurazione citofluorimetrica del Bodipy, l'analisi metabolica dell'espressione genica da parte di qPCR e anti-Stokes coerenti microscopia a dispersione Raman (CARS). L'imaging CARS combina la specificità chimica della spettroscopia Raman, una tecnica di analisi chimica nota nelle applicazioni scientifiche dei materiali, con i vantaggi delle microscopie ottiche non lineari ad alta velocità e ad alta risoluzione per consentire quantificazione dell'accumulo di lipidi e della dinamica delle goccioline lipidiche. L'istituzione di un efficiente modello in vitro per l'induzione della steatosi vescicolare, insieme a un metodo accurato per la quantificazione e la caratterizzazione dell'accumulo di lipidi, potrebbe portare allo sviluppo di una diagnosi in fase iniziale di NAFLD tramite il l'identificazione dei marcatori molecolari e la generazione di nuove strategie di trattamento.

Questo protocollo descrive un metodo efficace per indurre e caratterizzare la steatosi vescicolare nelle cellule HepaRG differenziate DMSO mediante trattamento di oleate di sodio (Figura 1A).
Differenziazione delle cellule HepaRG. Per indurre in modo efficiente la differenziazione, le cellule proliferanti devono essere semitate ad una bassa densità (2,5 x 104 cellule/cm2) nel mezzo di proliferazione. Quan...

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Inducing and Characterizing Vesicular Steatosis in Differentiated HepaRG Cells

In questo studio, descriviamo un protocollo dettagliato per indurre la steatosi vescicolare del fegato in cellule HepaRG differenziate con l'oleate di sodio acido grasso e impieghiamo metodi per il rilevamento e la quantificazione dell'accumulo di lipidi, compresi gli anti-Stokes coerenti Microscopia a dispersione Raman (CARS), analisi citofluorimetrica, colorazione Oo rosso olio e qPCR.

Indurre e caratterizzare la vesapica steatosi nelle celle HepaRG differenziate

Hepatic steatosis represents a metabolic dysfunction that results from an accumulation of triglyceride-containing lipid droplets in hepatocytes. Excessive ...

Questo protocollo descrive come indurre la steatosi vescicolare epatica in cellule EpaRG differenziate e metodi per il rilevamento e la quantificazione dell'accumulo lipidico. Questo modello di cellule umane in vitro rappresenta una valida alternativa ai modelli di topi in vivo e agli epatociti umani primari. Scongelare un lotto a basso passaggio crioconservato di azoto di cellule HepaRG immergendole in un bagno di 37 gradi Celsius fino a quando non viene scongelato.Trasferire rapidamente le cellule in un tubo da 15 millilitri contenente 10 millilitri di mezzo proliferano. Dopo aver centrifugato per cinque minuti, scartare il supernatante e rimescolare le cellule in cinque millilitri di mezzo proliferano. Contare le cellule e diluire per placcare 250.000 cellule per centimetro quadrato.Placcare le cellule su piatti di coltura cellulare da 100 millimetri e rinnovare il mezzo ogni due o tre giorni. Le cellule proliferano con un tempo di raddoppio di circa 24 ore. Una volta che le cellule HepaRG raggiungono l'80% di confluenza, staccarle attraverso un'incubazione da tre a cinque minuti con una soluzione di tripside allo 0,05%.Raccogliere le cellule in mezzo proliferano e centrifugare per cinque minuti come prima. Scartare il supernatante e rimescolare le cellule con cinque millilitri di mezzo proliferano. Ancora una volta, contare le cellule e diluire per placcare 250.000 celle per centimetro quadrato.In questa fase, amplificare le cellule ripetendo questi passaggi per raggiungere un numero appropriato di celle per avviare esperimenti. Per crioconservare le cellule HepaRG, staccare le cellule 24 ore dopo la placcatura attraverso un'incubazione da tre a cinque minuti con una soluzione di tripside allo 0,05%. Raccogliere le cellule in mezzo proliferano e centrifugare per cinque minuti come prima.Scartare il supernatante, rimescolare le cellule in un millilitro per lotto di mezzo di congelamento e crioconservare i lotti in azoto liquido. Il giorno zero, seminare cellule HepaRG a 250.000 cellule per centimetro quadrato in piatti trattati con coltura con un volume appropriato di mezzo di proliferazione. Due piatti devono essere placcati per ogni saggio, uno per le celle di controllo e uno per le cellule trattate con oleati.Il secondo e il quarto giorno, cambiare il mezzo con un volume appropriato di mezzo di proliferazione e lasciare che le cellule crescano fino a raggiungere la confluenza. Il settimo giorno, le celle devono essere confluenti al 100%. Lavare le celle una volta con 1X PBS.Quindi, rimuovere il PBS 1X e aggiungere un volume appropriato di mezzo di differenziazione. Nei giorni otto, nove, 12, 15 e 18, lavare le cellule una volta con 1X PBS prima di aggiungere un volume appropriato di mezzo di differenziazione. Il giorno 21, osservare le cellule HepaRG al microscopio e assicurarsi che le cellule siano colture differenziate confluenti.Come controllo, raccogli una piastra di controllo per eseguire l'analisi dell'espressione genica dei geni marcatori di differenziazione. Al giorno 21, le cellule EpaRG differenziate possono essere crioconservate in azoto liquido. Il giorno 21, diluire l'oleato di sodio con un volume appropriato di mezzo di differenziazione completo fino a una concentrazione finale di 250 micromolare.Aggiungere il 99% di metanolo con un rapporto da uno a 400 in un'altra aliquota di mezzo di differenziazione per effettuare il trattamento di controllo del veicolo. Lavare le cellule una volta con 1X PBS e aggiungere veicolo o mezzo oleato di sodio. Il giorno 23 e il giorno 25, cambiare il mezzo con il volume appropriato di mezzo appena preparato.Il giorno 26, osservare le cellule per microscopia ottica. Le goccioline lipidiche si accumulano nelle cellule trattate con oleato di sodio e sono facilmente visibili come goccioline traslucide nel citoplasma. Per eseguire la colorazione Oil Red O, lavare prima le celle una volta con 1X PBS e rimuovere completamente il PBS 1X.Aggiungere il 4% di paraformaldeide e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere la paraformaldeide e lavare le cellule due volte con 1X PBS. Dopo aver rimosso il PBS, incubare le cellule con il 60% di isopropanolo per cinque minuti a temperatura ambiente.Rimuovere l'isopropanolo e lasciare asciugare completamente le cellule a temperatura ambiente. Ora aggiungi la soluzione di lavoro Oil Red O alle cellule e incuba a temperatura ambiente per 30 minuti. Il volume di soluzione di lavoro richiesto per ciascun campione corrisponde al volume di supporti utilizzati per coltivare le cellule.Rimuovere la soluzione Oil Red O e aggiungere immediatamente acqua a doppia distillazione. Dopo aver lavato le cellule quattro volte con acqua doppia distillata, acquisire immagini al microscopio per l'analisi. Per elusare il colorante Oil Red O, rimuovere tutta l'acqua e lasciare asciugare.Quindi, aggiungere un millilitro di isopropanolo al 100% e incubare per 10 minuti con scuotimenti delicati a temperatura ambiente. Pipettare l'isopropanolo con olio diluito Red O colorante su e giù più volte, assicurando che tutto l'Olio Rosso O sia nella soluzione. Trasferire la soluzione in una cuvetta.Misurare la densità ottica a 500 nanometri mediante spettrofotometria e utilizzare l'isopropanolo al 100% come vuoto. Lavare le celle una volta con 1X PBS. Quindi, incubare con 100 nanomolari di Bodipy diluito in 1X PBS al buio per 40 minuti a 37 gradi Celsius.Nelle misurazioni della citometria del flusso deve essere incluso un controllo non macchiato. Rimuovere la soluzione di colorazione e lavare le celle una volta con 1X PBS. Quindi, lavare di nuovo le celle e rimuovere completamente il PBS.Aggiungere il 4% di paraformaldeide e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere la paraformaldeide e lavare i campioni tre volte per cinque minuti in PBS. Le celle possono essere conservate in 1X PBS a quattro gradi Celsius o immediatamente immagini.Per lo stoccaggio, avvolgere con Parafilm e coprire con un foglio di alluminio per evitare che le cellule si asciughino. Per verificare l'induzione efficiente della steatosi, le cellule HepaRG trattate con oleato e di controllo sono state macchiate con colorante Oil Red O. Dopo la colorazione, le goccioline lipidiche sono facilmente visibili come goccioline rosse.La colorazione può essere quantificata mediante misurazione spettrofotometrica del colorante Oil R O eluito con isopropanolo. L'assorbanza dell'olio diluito Red O dalle cellule è direttamente proporzionale all'accumulo di goccioline lipidiche citoplasmatiche. La concentrazione di oleato di sodio e il tempo di esposizione sono stati determinati dal saggio di vitalità delle cellule colorimetriche MTT.Il prodotto formosano è quantificato dalla sua assorbanza a 490 nanometri ed è direttamente proporzionale al numero di cellule viventi in coltura. Il trattamento con oleato di sodio è stato confrontato con il trattamento con palmitato di sodio. Il farmaco apoptotico doxorubicina è stato usato come controllo.Per quantificare l'aumento del contenuto lipidico cellulare dopo il trattamento con oleato di sodio, la colorazione con colorante Bodipy è stata utilizzata per etichettare le goccioline lipidiche. Utilizzando l'analisi citofluorometrica, è possibile quantificare il contenuto di trigliceridi per intensità fluorescente media di Bodipy, che è più alta nelle cellule trattate con oleati rispetto alle cellule di controllo. Ciò indica un efficiente accumulo di grasso dopo il trattamento con oleato.In effetti, le immagini delle cellule macchiate di Bodipy mostrano goccioline lipidiche fluorescenti verde brillante in cellule trattate con oleati che non sono visibili nelle cellule di controllo. Per caratterizzare ulteriormente l'accumulo di goccioline lipidiche dopo il trattamento con oleato di sodio, la microscopia CARS può essere eseguita come descritto nel protocollo di testo che consente la quantificazione delle goccioline lipidiche senza etichettatura. Questo modello basato su cellule può aumentare la conoscenza dei meccanismi molecolari coinvolti nella malattia epatica grassa non oncotica e potrebbe portare allo sviluppo di nuovi marcatori per la diagnosi precoce e nuove strategie di trattamento.

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