Name: inducing and characterizing vesicular steatosis in differentiated heparg cells
Uploaded: 2019-07-18T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inducing and Characterizing Vesicular Steatosis in Differentiated HepaRG Cells at JoVE.com

Agradecemos ao Prof. Christian trepo (INSERM U871, Lyon, França), que gentilmente forneceu células HepaRG. Agradecemos a Rita Appodia pela ajuda administrativa. Este trabalho foi apoiado por MIUR-Ministero dell' istruzione, dell' Università e della ricerca (FIRB 2011 – 2016 RBAP10XKNC) e Universidade Sapienza de Roma (Prot. C26A13T8PS; Prot. C26A142MCH; Prot. C26A15LSXL).

1. preparação de meios de cultura e reagentes
<ol><li>Meio proliferating: suplemento de William E médio com GlutaMAX, 10% soro fetal bovino (FBS), 1% penicilina/estreptomicina, 5 μg/mL de insulina e 0,5 μM hidrocortisona hemisuccinato.</li>
	<li>Meio de diferenciação: suplemento de William E meio com GlutaMAX, 10% FBS, 1% penicilina/estreptomicina, 5 μg/mL de insulina, 50 μM de hidrocortisona hemisuccinato e 2% DMSO.</li>
	<li>Meio de congelação: suplemento proliferating médio com 10% DMSO.</li>
	<li>Oleato...

<ol>
	<li>Starley, B. Q., Calcagno, C. J., Harrison, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonalcoholic+fatty+liver+disease+and+hepatocellular+carcinoma:+a+weighty+connection.">Nonalcoholic fatty liver disease and hepatocellular carcinoma: a weighty connection.</a> Hepatology. 51 (5), 1820-1832 (2010).</li><li>Byrne, C. D., Targher, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NAFLD:+a+multisystem+disease.">NAFLD: a multisystem disease.</a> Journal of Hepatology. 62 (1), 47-64 (2015).</li><li>Marra, F., Gastaldelli, A., Svegliati Baroni, G., Tell, G., Tiribelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+and+mechanisms+of+progression+of+non-+alcoholic+steatohepatitis.">Molecular basis and mechanisms of progression of non- alcoholic steatohepatitis.</a> Trends in Molecular Medicine. 14, 72-81 (2008).</li><li>Chalasani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diagnosis+and+management+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease:+Practice+guidance+from+the+American+Association+for+the+Study+of+Liver+Diseases.">The diagnosis and management of nonalcoholic fatty liver disease: Practice guidance from the American Association for the Study of Liver Diseases.</a> Hepatology. 67 (1), 328-357 (2018).</li><li>Banini, B. A., Sanyal, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+future+pharmacologic+treatment+of+nonalcoholic+steatohepatitis.">Current and future pharmacologic treatment of nonalcoholic steatohepatitis.</a> Current Opinion in Gastroenterology. 33 (3), 134-141 (2017).</li><li>Takahashi, Y., Sugimoto, K., Inui, H., Fukusato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+pharmacological+therapies+for+nonalcoholic+fatty+liver+disease/nonalcoholic+steatohepatitis.">Current pharmacological therapies for nonalcoholic fatty liver disease/nonalcoholic steatohepatitis.</a> World Journal of Gastroenterology. 21 (13), 3777-3785 (2015).</li><li>Younossi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+burden+of+NAFLD+and+NASH:+trends,+predictions,+risk+factors+and+prevention.">Global burden of NAFLD and NASH: trends, predictions, risk factors and prevention.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 15 (1), 11-20 (2018).</li><li>Santhekadur, P. K., Kumar, D. P., Sanyal, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+models+of+non-alcoholic+fatty+liver+disease.">Preclinical models of non-alcoholic fatty liver disease.</a> Journal of Hepatology. 68 (2), 230-237 (2018).</li><li>Nagarajan, P., Mahesh Kumar, M. J., Venkatesan, R., Majundar, S. S., Juyal, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+modified+mouse+models+for+the+study+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease.">Genetically modified mouse models for the study of nonalcoholic fatty liver disease.</a> World Journal of. Gastroenterology. 18 (11), 1141-1153 (2012).</li><li>Oseini, A. M., Cole, B. K., Issa, D., Feaver, R. E., Sanyal, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+scientific+discovery:+the+need+for+preclinical+models+of+nonalcoholic+steatohepatitis.">Translating scientific discovery: the need for preclinical models of nonalcoholic steatohepatitis.</a> Hepatology International. 12 (1), 6-16 (2018).</li><li>Ramboer, E., Vanhaecke, T., Rogiers, V., Vinken, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalized+human+hepatic+cell+lines+for+in+vitro+testing+and+research+purposes.">Immortalized human hepatic cell lines for in vitro testing and research purposes.</a> Methods in Molecular Biology. 1250, 53-76 (2015).</li><li>G&#243;mez-Lech&#243;n, M. J., Donato, M. T., Castell, J. V., Jover, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hepatocytes+in+primary+culture:+the+choice+to+investigate+drug+metabolism+in+man.">Human hepatocytes in primary culture: the choice to investigate drug metabolism in man.</a> Current Drug Metabolism. 5 (5), 443-462 (2004).</li><li>Marion, M. J., Hantz, O., Durantel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HepaRG+cell+line:+biological+properties+and+relevance+as+a+tool+for+cell+biology,+drug+metabolism,+and+virology+studies.">The HepaRG cell line: biological properties and relevance as a tool for cell biology, drug metabolism, and virology studies.</a> Methods in Molecular Biology. 640, 261-272 (2010).</li><li>Gripon, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+a+human+hepatoma+cell+line+by+hepatitis+B+virus.">Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (24), 15655-15660 (2002).</li><li>Anth&#233;rieu, S., Rogue, A., Fromenty, B., Guillouzo, A., Robin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+vesicular+steatosis+by+amiodarone+and+tetracycline+is+associated+with+up-regulation+of+lipogenic+genes+in+HepaRG+cells.">Induction of vesicular steatosis by amiodarone and tetracycline is associated with up-regulation of lipogenic genes in HepaRG cells.</a> Hepatology. 53 (6), 1895-1905 (2011).</li><li>Rouge, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PPAR+agonists+reduce+steatosis+in+oleic+acid-overloaded+HepaRG+cells.">PPAR agonists reduce steatosis in oleic acid-overloaded HepaRG cells.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 276 (1), 73-81 (2014).</li><li>Belloni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+a+phospho-STAT3-miRNAs+pathway+improves+vesicular+hepatic+steatosis+in+an+in+vitro+and+in+vivo+model.">Targeting a phospho-STAT3-miRNAs pathway improves vesicular hepatic steatosis in an in vitro and in vivo model.</a> Scientific Reports. 8, 13638 (2018).</li><li>Nunn, A. D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histone+deacetylase+inhibiting+drug+Entinostat+induces+lipid+accumulation+in+differentiated+HepaRG+cells.">The histone deacetylase inhibiting drug Entinostat induces lipid accumulation in differentiated HepaRG cells.</a> Scientific Reports. 6, 28025 (2016).</li><li>Donato, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytometric+analysis+for+drug-induced+steatosis+in+HepG2+cells.">Cytometric analysis for drug-induced steatosis in HepG2 cells.</a> Chemico-Biological Interactions. 181 (3), 417-423 (2009).</li><li>Hellerer, T., Ax&#228;ng, C., Brackmann, C., Hillertz, P., Pilon, M., Enejder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+lipid+storage+in+Caenorhabditis+elegans+using+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+(CARS)+microscopy.">Monitoring of lipid storage in Caenorhabditis elegans using coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (37), 14658-14663 (2007).</li><li>Le, T. T., Ziemba, A., Urasaki, Y., Brotman, S., Pizzorno, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+evaluation+of+hepatic+microvesicular+steatosis+with+multimodal+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy.">Label-free evaluation of hepatic microvesicular steatosis with multimodal coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy.</a> PLoS One. 7 (11), 51092 (2012).</li><li>Guillouzo, A., Corlu, A., Aninat, C., Glaise, D., Morel, F., Guguen-Guillouzo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+hepatoma+HepaRG+cells:+a+highly+differentiated+model+for+studies+of+liver+metabolism+and+toxicity+of+xenobiotics.">The human hepatoma HepaRG cells: a highly differentiated model for studies of liver metabolism and toxicity of xenobiotics.</a> Chemico-Biological Interactions. 168 (1), 66-73 (2007).</li><li>Nelson, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hepatic+HepaRG+cells+maintain+an+organotypic+phenotype+with+high+intrinsic+CYP450+Activity/metabolism+and+significantly+outperform+standard+HepG2/C3A+cells+for+pharmaceutical+and+therapeutic+applications.">Human hepatic HepaRG cells maintain an organotypic phenotype with high intrinsic CYP450 Activity/metabolism and significantly outperform standard HepG2/C3A cells for pharmaceutical and therapeutic applications.</a> Basic &amp; Clinical Pharmacology &amp; Toxicology. 120 (1), 30-37 (2017).</li><li>Gerets, H. H. J., Tilmant, K., Gerin, B., Chanteux, H., Depelchin, B. O., Dhalluin, S., Atienzar, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+primary+human+hepatocytes,+HepG2+cells,+and+HepaRG+cells+at+the+mRNA+level+and+CYP+activity+in+response+to+inducers+and+their+predictivity+for+the+detection+of+human+hepatotoxins.">Characterization of primary human hepatocytes, HepG2 cells, and HepaRG cells at the mRNA level and CYP activity in response to inducers and their predictivity for the detection of human hepatotoxins.</a> Cell Biology and Toxicology. 28 (2), 69-87 (2012).</li><li>Pusl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+fatty+acids+sensitize+hepatocytes+to+bile+acid-induced+apoptosis.">Free fatty acids sensitize hepatocytes to bile acid-induced apoptosis.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 371 (3), 441-445 (2008).</li><li>Gentile, C. L., Pagliassotti, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+fatty+acids+in+the+development+and+progression+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease.">The role of fatty acids in the development and progression of nonalcoholic fatty liver disease.</a> The Journal of Nutritional Biochemistry. 19 (9), 567-576 (2008).</li><li>Mei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+roles+of+unsaturated+and+saturated+fatty+acids+on+autophagy+and+apoptosis+in+hepatocytes.">Differential roles of unsaturated and saturated fatty acids on autophagy and apoptosis in hepatocytes.</a> Journal of Pharmacological Experimental Therapy. 339, 487-498 (2011).</li><li>Malhi, H., Bronk, S. F., Werneburg, N. W., Gores, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+fatty+acids+induce+JNK-dependent+hepatocyte+lipoapoptosis.">Free fatty acids induce JNK-dependent hepatocyte lipoapoptosis.</a> Journal of Biological Chemistry. 281, 12093-12101 (2006).</li><li>Moravcov&#225;, A., &#268;ervinkov&#225;, Z., Ku&#269;era, O., Mezera, V., Rychtrmoc, D., Lotkov&#225;, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+oleic+and+palmitic+acid+on+induction+of+steatosis+and+cytotoxicity+on+rat+hepatocytes+in+primary+culture.">The effect of oleic and palmitic acid on induction of steatosis and cytotoxicity on rat hepatocytes in primary culture.</a> Physiological Research. 64, 627-636 (2015).</li><li>Ohsaki, Y., Shinohara, Y., Suzuki, M., Fujimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pitfall+in+using+BODIPY+dyes+to+label+lipid+droplets+for+fluorescence+microscopy.">A pitfall in using BODIPY dyes to label lipid droplets for fluorescence microscopy.</a> Histochemistry and Cell Biology. 133 (4), 477-480 (2010).</li><li>Rinia, H. A., Burger, K. N., Bonn, M., M&#252;ller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+label-free+imaging+of+lipid+composition+and+packing+of+individual+cellular+lipid+droplets+using+multiplex+CARS+microscopy.">Quantitative label-free imaging of lipid composition and packing of individual cellular lipid droplets using multiplex CARS microscopy.</a> Biophysical Journal. 95 (10), 4908-4914 (2008).</li><li>Waschatko, G., Billecke, N., Schwendy, S., Jaurich, H., Bonn, M., Vilgis, T. A., Parekh, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+in+situ+imaging+of+oil+body+dynamics+and+chemistry+in+germination.">Label-free in situ imaging of oil body dynamics and chemistry in germination.</a> Journal of The Royal Society Interface. 13 (123), (2016).</li><li>J&#252;ngst, C., Winterhalder, M. J., Zumbusch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+long+term+lipid+droplet+tracking+with+CARS+microscopy.">Fast and long term lipid droplet tracking with CARS microscopy.</a> Journal of Biophotonics. 4 (6), 435-441 (2011).</li><li>Welte, M. A., Gould, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplet+functions+beyond+energy+storage.">Lipid droplet functions beyond energy storage.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (10), 1260-1272 (2017).</li><li>Cohen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+as+organelles.">Lipid droplets as organelles.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 337, 83-110 (2018).</li><li>Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+finally+get+a+little+R-E-S-P-E-C-T.">Lipid droplets finally get a little R-E-S-P-E-C-T.</a> Cell. 139 (5), 855-860 (2009).</li></ol>

Este protocolo descreve como diferenciar as células HepaRG e como induzir a esteatose vesicular pelo tratamento oleato de sódio (Figura 1A). Com efeito, em comparação com outras linhagens celulares de carcinoma hepatocelular humano (HCC), a linha celular heparg apresenta características de hepatócitos humanos adultos, representando uma valiosa alternativa aos hepatócitos humanos primários cultivados ex vivo13,14 </...

A esteatose hepática é definida como acúmulo de gordura intrahepática, dentro de gotas lipídicas contendo triglicerídeos, de pelo menos 5% do peso do fígado. O armazenamento hepático prolongado de lipídios é um processo potencialmente reversível, no entanto, pode levar a disfunção metabólica hepática, inflamação e formas avançadas de doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA), a causa predominante de doença hepática crônica em muitas partes do o mundo1,2. A NAFLD é uma doença multifatorial que pode evoluir para a esteatohepatite não alcoólica mais agressiva (Nash), que por sua vez pode progredir para cirrose e, em pequena porcentagem de pacientes, para carcinoma hepatocelular (HCC)1,3. Nenhuma terapia aprovada está atualmente disponível como um tratamento específico para a NAFLD e a combinação de modificações de dieta e estilo de vida continua sendo o pilar da NAFLD e da gerência de Nash4,5,6.
Os mecanismos moleculars que conduzem ao desenvolvimento da esteatose hepatic na patogénese de NAFLD permanecem ainda para ser elucidados7. Neste contexto, modelos de camundongo foram desenvolvidos para estudar a progressão da doença da esteatose humana. Existe uma infinidade de modelos diferentes, e cada um tem suas vantagens e desvantagens, incluindo modelos genéticos, nutricionais e quimicamente induzidos combinando diferentes abordagens. Os ratos geneticamente modificados (transgênicos ou Knockout) desenvolvem espontaneamente a doença hepática. Entretanto, deve-se notar que estas mutações são muito raras nos seres humanos e o apagamento ou a excesso-expressão de um único gene (por exemplo, rato de OB/OB) não podem imitar a etiologia da doença humana multifatorial a nível molecular8,9. Da mesma forma, a doença adquirida por camundongos após manipulação dietética ou farmacológica pode não imitar os efeitos das dietas humanas associadas ao desenvolvimento da DHGNA no homem8. Os modelos animais têm, no entanto, facilitado a evolução na compreensão da DHGNA e essa abordagem é atualmente a estratégia mais freqüentemente utilizada na pesquisa laboratorial. No entanto, a replicação em humanos dos resultados obtidos em modelos animais tem falhado repetidamente, causando má tradução para a clínica10.
Portanto, os modelos in vitro da DHGNA podem desempenhar um papel fundamental na elucidação dos mecanismos moleculares da progressão da NAFLD, e representam uma ferramenta valiosa para a tela de um grande número de compostos. Culturas de células primárias, linhas celulares imortalizadas e biópsias hepáticas têm sido amplamente utilizadas para fins de pesquisa11. Os hepatócitos humanos preliminares assemelham-se pròxima às circunstâncias clínicas humanas, mas há um número limitado de doadores, e as culturas de pilha preliminares mostram a reprodutibilidade pobre devido à variabilidade das pilhas. Essas observações, juntamente com questões éticas e logísticas, resultaram no uso de hepatócitos primários humanos sendo limitados12. Assim, as linhas de célula hepatic representam uma alternativa conveniente, tendo diversas vantagens essenciais sobre a cultura preliminar, porque as linhas de pilha hepatic crescem firmemente, têm uma vida-extensão quase ilimitada, e têm um phenotype estável. Além disso, as linhas celulares são facilmente acessíveis e as condições de cultura das linhagens celulares hepáticas são mais simples do que as dos hepatócitos primários e são padronizadas entre os diferentes laboratórios.
Aqui, nós descrevemos em detalhe um modelo Cell-Based in vitro da esteatose vesicular do fígado, representada por pilhas diferenciadas hepatic do HepaRG tratadas com o oleate do sódio do ácido gordo. A linha celular de HepaRG foi estabelecida de um paciente fêmea afetado pela infecção da hepatite C e por um tumor bem diferenciado do fígado da classe de Edmondson mim14. A linha celular HepaRG é uma linhagem de células progenitoras bipotentes humanas capaz de diferenciar a exposição a 2% de sulfóxido de dimetil (DMSO) em direção a dois fenótipos de células diferentes: células semelhantes às das vias biliares e hepatócitos. As células de HepaRG diferenciadas (dHepaRG) compartilham algumas características e propriedades com hepatócitos adultos e possuem a capacidade de expressar de forma estável genes específicos do fígado, como albumina, AldolaseB, citocromo P450 2E1 (CYP2E1) e citocromo P450 3A4 (CYP3A4)13 (passo 3). O tratamento de células de dheparg com o oleato de sódio de sal de ácidos graxos (250 μm) por 5 dias levam à geração de gotas lipídicas citoplasmáticas, imitando os efeitos do fígado gordo14,15,17,18 ( Passo 4). A acumulação de gotas lipídicas pode ser facilmente detectada pela coloração de óleo vermelho O (passo 5), um corante lisocromo solúvel em gordura que mancha triglicérides neutros e lipídios vermelho-laranja. Para quantificar eficientemente os lipídios no dheparg gordo, aqui nós ilustramos a análise cytofluorimetric após a mancha com 4, 4-difluoro-1, 3, 5, 7-tetramethyl-4-Bora-3A, 4a-diaza-s-indacene (bodipy 505/515) (etapa 6), uma sonda fluorescente lipofílico a corpos lipídicos intracelulares e tem sido usado para rotular gotas lipídicas19. Além disso, aqui nós mostramos como avaliar a esteatose pela reacção em cadeia quantitativa do polymerase (qPCR) (etapa 7) desregulação da expressão de gene de diversos genes metabólicos em pilhas de dHepaRG. Para caracterizar e quantificar ainda mais o acúmulo de gotas lipídicas após o tratamento com oleato de sódio, realizou-se a microscopia de espalhamento Raman (CARS) coerente de anti-Stokes (etapa 8), uma técnica inovadora que possibilita a visualização e quantificação de gotas lipídicas sem rotulagem20,21.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:799px;" width="797">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Hyclone HyClone Fetal Clone II&#160;</td>
			<td style="width:240px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:143px;">SH30066</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">William&#8217;s E medium with GlutaMAX&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Thermofisher</td>
			<td>32551087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:240px;">SIGMA</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Insulin&#160;</td>
			<td style="width:240px;">SIGMA</td>
			<td>I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hydrocortisone hemisuccinate</td>
			<td style="width:240px;">SIGMA</td>
			<td>H2270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">DMSO, dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:240px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">D2438&#160;&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Sodium Oleate</td>
			<td style="width:240px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">O7501&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Methanol</td>
			<td style="width:240px;">SIGMA</td>
			<td>179337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:240px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">278475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BODIPY 505/515</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>D3921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">PBS</td>
			<td style="width:240px;">Thermofisher</td>
			<td>14190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formaldehyde solution</td>
			<td style="width:240px;">SIGMA</td>
			<td>252549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">RNAse free DNAseI</td>
			<td style="width:240px;">Promega</td>
			<td>M198A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass-bottomed dishes</td>
			<td style="width:240px;">Willco Wells</td>
			<td style="width:143px;">GWST-5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Oil Red solution</td>
			<td style="width:240px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">O625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">CellTiter 96 AQueous One Solution</td>
			<td style="width:240px;">Promega&#160;</td>
			<td style="width:143px;">G3582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">q-PCR oligo name</td>
			<td>Sequence</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ACACB FOR</td>
			<td>CAAGCCGATCACCAAGAGTAAA</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">ACACB REV</td>
			<td>CCCTGAGTTATCAGAGGCTGG</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:239px;">b-actin FOR</td>
			<td style="width:240px;">GCACTCTTCCAGCCTTCCT</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:239px;">b-actin REV</td>
			<td style="width:240px;">AGGTCTTTGCGGATGTCCAC</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ALBUMIN FOR</td>
			<td>TGCTTGAATGTGCTGATGACAGG</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ALBUMIN REV</td>
			<td>AAGGCAAGTCAGCAGGCATCTCATC</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ALDOB FOR</td>
			<td>GCATCTGTCAGCAGAATGGA&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ALDOB REV</td>
			<td>TAGACAGCAGCCAGGACCTT</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">APOB FOR</td>
			<td>CCTCCGTTTTGGTGGTAGAG</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">APOB REV</td>
			<td>&#160;CCTAAAAGCTGGGAAGCTGA</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">APOC3 FOR</td>
			<td>CTCAGCTTCATGCAGGGTTA</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">APOC3 REV</td>
			<td>GGTGCTCCAGTAGTCTTTCAG</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CPT1A FOR</td>
			<td>TCATCAAGAAATGTCGCACG</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CPT1A REV</td>
			<td>GCCTCGTATGTGAGGCAAAA</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CYP2E1 FOR</td>
			<td>TTGAAGCCTCTCGTTGACCC</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CYP2E1 REV</td>
			<td>CGTGGTGGGATACAGCCAA</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CYP3A4 FOR</td>
			<td>CTTCATCCAATGGACTGCATAAAT</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CYP3A4 REV</td>
			<td>TCCCAAGTATAACACTCTACACAGACAA</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GAPDH FOR</td>
			<td>TGACAACTTTGGTATCGTGGAAGG</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GAPDH REV</td>
			<td>AGGGATGATGTTCTGGAGAGCC</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GPAM FOR</td>
			<td>TCTTTGGGTTTGCGGAATGTT</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GPAM REV</td>
			<td>ATGCACATCTCGCTCTTGAATAA</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IL6 FOR</td>
			<td>CCTGAACCTTCCAAAGATGGC</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IL6 REV</td>
			<td>ACCTCAAACTCCAAAAGACCAGTG</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PDK4 FOR</td>
			<td>ACAGACAGGAAACCCAAGCCAC</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PDK4 REV</td>
			<td>TGGAGGTGAGAAGGAACATACACG</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PLIN2 FOR</td>
			<td>TTGCAGTTGCCAATACCTATGC</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PLIN2 REV</td>
			<td>CCAGTCACAGTAGTCGTCACA</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PLIN4 FOR</td>
			<td>AATGAGTTGGAGGGGCTGGGGGACATC</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PLIN4 REV</td>
			<td>GGTCACCTAAACGAACGAAGTAGC</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SCD FOR</td>
			<td>TCTAGCTCCTATACCACCACCA</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SCD REV</td>
			<td>TCGTCTCCAACTTATCTCCTCC</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SLC2A1 FOR</td>
			<td>TGCTCATCAACCGCAACGAG</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SLC2A1 REV</td>
			<td>CCGACTCTCTTCCTTCATCTCCTG</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">18S FOR</td>
			<td>CGCCGCTAGAGGTGAAATTC</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">18S REV</td>
			<td>TTGGCAAATGCTTTCGCTC</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducing and characterizing vesicular steatosis in differentiated heparg cells

A esteatose hepática representa uma disfunção metabólica que resulta de um acúmulo de gotas lipídicas contendo triglicerídeos em hepatócitos. O acúmulo excessivo de gordura leva à doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA), que é potencialmente reversível e pode evoluir para esteatohepatite não alcoólica (NASH) e, eventualmente, cirrose e carcinoma hepatocelular (HCC). Os mecanismos moleculares que ligam a acumulação lipídica em hepatócitos com a progressão para NASH, dano hepático irreversível, fibrose, cirrose e até mesmo HCC ainda permanecem obscuros. Para isso, vários modelos in vitro e in vivo foram desenvolvidos para elucidar os processos patológicos que causam a DHGNA. No presente estudo, descrevemos um modelo celular para a indução de esteatose vesicular hepática que consiste em células de HepaRG hepáticas humanas diferenciadas por DMSO tratadas com o oleato de sódio de sal de ácidos graxos. De fato, as células HepaRG tratadas com oleato de sódio acumulam gotas lipídicas no citoplasma e apresentam características típicas de esteatose. Este modelo in vitro humano representa uma alternativa valiosa aos modelos in vivo dos ratos assim como aos hepatocytes humanos preliminares. Também apresentamos uma comparação de vários métodos para a quantificação e avaliação do acúmulo de gordura em células de HepaRG, incluindo coloração de óleo vermelho O, medida de Bodipy citofluimétrica, análise metabólica da expressão gênica por qPCR e anti-Stokes coerente Microscopia de espalhamento Raman (CARS). A imagem latente dos carros combina a especificidade química da espectroscopia de Raman, uma técnica da análise química conhecida em aplicações da ciência dos materiais, com os benefícios das microscopias óticas de alta velocidade, de alta resolução não-lineares para permitir a precisão quantificação da acumulação lipídica e da dinâmica das gotas lipídicas. O estabelecimento de um modelo in vitro eficiente para a indução da esteatose vesicular, ao lado de um método exato para a quantificação e caracterização do acúmulo lipídico, poderia levar ao desenvolvimento do diagnóstico de fase precoce da DHGNA através da identificação de marcadores moleculares, e à geração de novas estratégias de tratamento.

Este protocolo descreve um método eficiente para induzir e caracterizar o esteatose vesicular em pilhas DMSO-diferenciadas de heparg pelo tratamento do oleato do sódio (Figura 1a).
Diferenciação de células HepaRG. Para induzir de forma eficiente a diferenciação, as células proliferantes devem ser semeadas em baixa densidade (2,5 x 104 células/cm2) no meio de proliferação. Quando semeadas em baix...

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Inducing and Characterizing Vesicular Steatosis in Differentiated HepaRG Cells

Neste estudo, nós descrevemos um protocolo detalhado para induzir o esteatose vesicular do fígado em pilhas diferenciadas de HepaRG com o oleato do sódio do sal do ácido gordo e empregamos métodos para a deteção e a quantificação da acumulação do lipido, incluindo anti-Stokes coerente Microscopia do espalhamento de Raman (carros), análise cytofluorimetric, mancha vermelha O do óleo, e qPCR.

Induzir e caracterizar a esteatose vesicular em células HepaRG diferenciadas

Hepatic steatosis represents a metabolic dysfunction that results from an accumulation of triglyceride-containing lipid droplets in hepatocytes. Excessive ...

Este protocolo descreve como induzir esteatose vesicular hepática em células e métodos hepaRG diferenciados para detecção e quantificação do acúmulo lipídico. Este modelo de célula humana in vitro representa uma alternativa valiosa para modelos in vivo ratos e para hepatócitos humanos primários. Descongele um lote criopreservado de baixa passagem de células HepaRG, imergindo-as em um banho Celsius de 37 graus até descongelar.Transfira rapidamente as células para um tubo de 15 mililitros contendo 10 mililitros de meio proliferante. Após centrifugação por cinco minutos, descarte o supernasce e resuspenque as células em cinco mililitros de meio proliferador. Conte as células e dilua para a placa 250.000 células por centímetro quadrado.Coloque as células em pratos de cultura celular de 100 milímetros e renove o meio a cada dois ou três dias. As células proliferam com um tempo de duplicação de cerca de 24 horas. Uma vez que as células HepaRG atinjam 80% de confluência, desvincule-as através de uma incubação de três a cinco minutos com solução de trippsina de 0,05%.Colete as células em meio proliferador e centrífuga por cinco minutos como antes. Descarte o supernasce e resuspenque as células com cinco mililitros de meio proliferador. Novamente, conte as células e dilua para a placa 250.000 células por centímetro quadrado.Nesta fase, amplifique as células repetindo esses passos para alcançar um número adequado de células para iniciar experimentos. Para criopreservar células HepaRG, desprendem as células 24 horas após a incubação de três a cinco minutos com solução de trippsina de 0,05%. Colete as células em meio proliferador e centrífuga por cinco minutos como antes.Descarte o supernatante, resuspenque as células em um mililitro por lote de meio de congelamento, e criopreserve os lotes em nitrogênio líquido. No dia zero, as células HepaRG de sementes a 250.000 células por centímetro quadrado em pratos tratados com cultura com um volume adequado de meio de proliferação. Dois pratos precisam ser banhados para cada ensaio, um para células de controle e um para células tratadas com oleato.No segundo dia e no quarto dia, mude o meio com um volume adequado de meio de proliferação e deixe as células crescerem até atingirem a confluência. No sétimo dia, as células devem ser 100% confluentes. Lave as células uma vez com 1X PBS.Em seguida, remova o PBS 1X e adicione um volume apropriado de meio de diferenciação. Nos dias oito, nove, 12, 15 e 18, lave as células uma vez com 1X PBS antes de adicionar um volume adequado de meio de diferenciação. No dia 21, observe as células HepaRG sob um microscópio e garanta que as células sejam culturas diferenciadas confluentes.Como controle, colher um prato de controle para realizar a análise de expressão genética de genes marcadores de diferenciação. No dia 21, células HepaRG diferenciadas podem ser criopreservadas em nitrogênio líquido. No dia 21, diluir o oleato de sódio com um volume apropriado de meio de diferenciação completa para uma concentração final de 250 micromolar.Adicione 99% de metanol a uma proporção de um a 400 em outra alíquota de meio de diferenciação para fazer o tratamento de controle do veículo. Lave as células uma vez com 1X PBS e adicione veículo ou meio de oleato de sódio. Nos dias 23 e dia 25, troque o meio com o volume adequado do meio recém-preparado.No dia 26, observe as células por microscopia óptica. Gotículas lipídicas se acumulam nas células tratadas com oleato de sódio e são facilmente visíveis como gotículas translúcidas no citoplasma. Para realizar a coloração de Oleo Vermelho, primeiro lave as células uma vez com 1X PBS e remova completamente o PBS 1X.Adicione 4% de paraformaldeído e incubar por 15 minutos em temperatura ambiente. Remova o paraformaldeído e lave as células duas vezes com 1X PBS. Depois de remover o PBS, incubar as células com isopropanol de 60% por cinco minutos em temperatura ambiente.Remova a isopropanol e deixe as células secarem completamente à temperatura ambiente. Agora adicione a solução de trabalho Oil Red O às células e incubar à temperatura ambiente por 30 minutos. O volume de solução de trabalho necessário para cada amostra corresponde ao volume de mídia utilizado para a cultura das células.Remova a solução Oil Red O e adicione imediatamente água duplamente destilada. Depois de lavar as células quatro vezes com água duplamente destilada, adquira imagens sob o microscópio para análise. Para elutar o corante Óleo Vermelho O, remova toda a água e deixe secar.Em seguida, adicione um mililitro de isopropanol de 100% e incubar por 10 minutos com agitação suave à temperatura ambiente. Pipeta o isopropanol com óleo elucido Corante Vermelho O para cima e para baixo várias vezes, garantindo que todo o Óleo Vermelho O está na solução. Transfira a solução para um cuvette.Meça a densidade óptica em 500 nanômetros por espectrofotometria e use 100% isopropanol como o branco. Lave as células uma vez com 1X PBS. Em seguida, incubar com 100 nanomolar de Bodipy diluído em 1X PBS no escuro por 40 minutos a 37 graus Celsius.Um controle não manchado deve ser incluído nas medidas de citometria de fluxo. Remova a solução de coloração e lave as células uma vez com 1X PBS. Em seguida, lave as células novamente e remova completamente o PBS.Adicione 4% de paraformaldeído e incubar por 15 minutos em temperatura ambiente. Remova o paraformaldeído e lave as amostras três vezes durante cinco minutos em PBS. As células podem ser mantidas em 1X PBS a quatro graus Celsius ou imagens imediatamente.Para armazenamento, enrole com Parafilm e cubra com papel alumínio para evitar que as células sequem. Para verificar a indução eficiente da esteatose, as células hepaRG tratadas com oleato foram manchadas com corante O Vermelho-Óleo. Após a coloração, gotículas lipídicas são facilmente visíveis como gotículas vermelhas.A coloração pode ser quantificada pela medição espectrofotométrica do corante óleo R O eludido com isopropanol. A absorção de Óleo Vermelho O das células é diretamente proporcional ao acúmulo de gotícula lipídica citoplasmática. A concentração de oleato de sódio e o tempo de exposição foram determinados pelo ensaio de viabilidade celular colorimétrica MTT.O produto Formosan é quantificado por sua absorção em 490 nanômetros e é diretamente proporcional ao número de células vivas na cultura. O tratamento de oleato de sódio foi comparado ao tratamento de palmitato de sódio. A droga apoptóica doxorubicina foi usada como controle.Para quantificar o aumento do teor lipídico celular após o tratamento de oleato de sódio, a coloração com corante Bodipy foi usada para rotular gotículas lipídicas. Usando a análise citofluormétrica, é possível quantificar o teor de triglicerídeos pela intensidade fluorescente média de Bodipy, que é maior em células tratadas com oleato em comparação com as células de controle. Isso indica um acúmulo eficiente de gordura após o tratamento de oleate.De fato, imagens de células manchadas de Bodipy mostram gotículas lipídicas fluorescentes verdes brilhantes em células tratadas com oleato que não são visíveis nas células de controle. Para caracterizar ainda mais o acúmulo de gotículas lipídicas após o tratamento de oleato de sódio, a microscopia CARS pode ser realizada conforme descrito no protocolo de texto que permite quantificação de gotículas lipídicas sem rotulagem. Esse modelo baseado em células pode aumentar o conhecimento dos mecanismos moleculares envolvidos na doença hepática gordurosa não oncótica e pode levar ao desenvolvimento de novos marcadores para o diagnóstico precoce e novas estratégias de tratamento.

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