Name: inducing and characterizing vesicular steatosis in differentiated heparg cells
Uploaded: 2019-07-18T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inducing and Characterizing Vesicular Steatosis in Differentiated HepaRG Cells at JoVE.com

Biz Prof Christian Trepo (ıNEKM U871, Lyon, Fransa), hangi nazik HepaRG hücreleri sağladı teşekkür ederiz. Biz idari yardım için Rita Appodia için minnettarız. Bu çalışma MıUR-Ministero Dell 'istruzione, Dell 'università e della ricerca (FIRB 2011 – 2016 RBAP10XKNC) ve Roma Sapienza Üniversitesi (Prot. C26A13T8PS; Prot. C26A142MCH; Prot. C26A15LSXL).

1. Kültür Medya ve Reaktiflerin hazırlanması
<ol><li>Proliferating Orta: GlutaMAX, 10% fetal sığır serumu (FBS), 1% penisilin/streptomisin, 5 μg/mL insülin ve 0,5 μM hidrokortizon hemisuccinat ile William 'ın E orta ek.</li>
	<li>Farklılaşma ortamı: glutamax, 10% FBS, 1% penisilin/streptomisin, 5 μg/ml insülin, 50 μM hidrokortizon hemisüksinat ve% 2 DMSO ile ek William 'ın E orta.</li>
	<li>Dondurma Orta:% 10 DMSO ile Proliferasyona orta takviyesi.</li>
	<li>Sodyum oleat: 100 mM konsantrasyonda% 99 m...

<ol>
	<li>Starley, B. Q., Calcagno, C. J., Harrison, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonalcoholic+fatty+liver+disease+and+hepatocellular+carcinoma:+a+weighty+connection.">Nonalcoholic fatty liver disease and hepatocellular carcinoma: a weighty connection.</a> Hepatology. 51 (5), 1820-1832 (2010).</li><li>Byrne, C. D., Targher, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NAFLD:+a+multisystem+disease.">NAFLD: a multisystem disease.</a> Journal of Hepatology. 62 (1), 47-64 (2015).</li><li>Marra, F., Gastaldelli, A., Svegliati Baroni, G., Tell, G., Tiribelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+and+mechanisms+of+progression+of+non-+alcoholic+steatohepatitis.">Molecular basis and mechanisms of progression of non- alcoholic steatohepatitis.</a> Trends in Molecular Medicine. 14, 72-81 (2008).</li><li>Chalasani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diagnosis+and+management+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease:+Practice+guidance+from+the+American+Association+for+the+Study+of+Liver+Diseases.">The diagnosis and management of nonalcoholic fatty liver disease: Practice guidance from the American Association for the Study of Liver Diseases.</a> Hepatology. 67 (1), 328-357 (2018).</li><li>Banini, B. A., Sanyal, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+future+pharmacologic+treatment+of+nonalcoholic+steatohepatitis.">Current and future pharmacologic treatment of nonalcoholic steatohepatitis.</a> Current Opinion in Gastroenterology. 33 (3), 134-141 (2017).</li><li>Takahashi, Y., Sugimoto, K., Inui, H., Fukusato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+pharmacological+therapies+for+nonalcoholic+fatty+liver+disease/nonalcoholic+steatohepatitis.">Current pharmacological therapies for nonalcoholic fatty liver disease/nonalcoholic steatohepatitis.</a> World Journal of Gastroenterology. 21 (13), 3777-3785 (2015).</li><li>Younossi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+burden+of+NAFLD+and+NASH:+trends,+predictions,+risk+factors+and+prevention.">Global burden of NAFLD and NASH: trends, predictions, risk factors and prevention.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 15 (1), 11-20 (2018).</li><li>Santhekadur, P. K., Kumar, D. P., Sanyal, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+models+of+non-alcoholic+fatty+liver+disease.">Preclinical models of non-alcoholic fatty liver disease.</a> Journal of Hepatology. 68 (2), 230-237 (2018).</li><li>Nagarajan, P., Mahesh Kumar, M. J., Venkatesan, R., Majundar, S. S., Juyal, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+modified+mouse+models+for+the+study+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease.">Genetically modified mouse models for the study of nonalcoholic fatty liver disease.</a> World Journal of. Gastroenterology. 18 (11), 1141-1153 (2012).</li><li>Oseini, A. M., Cole, B. K., Issa, D., Feaver, R. E., Sanyal, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+scientific+discovery:+the+need+for+preclinical+models+of+nonalcoholic+steatohepatitis.">Translating scientific discovery: the need for preclinical models of nonalcoholic steatohepatitis.</a> Hepatology International. 12 (1), 6-16 (2018).</li><li>Ramboer, E., Vanhaecke, T., Rogiers, V., Vinken, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalized+human+hepatic+cell+lines+for+in+vitro+testing+and+research+purposes.">Immortalized human hepatic cell lines for in vitro testing and research purposes.</a> Methods in Molecular Biology. 1250, 53-76 (2015).</li><li>G&#243;mez-Lech&#243;n, M. J., Donato, M. T., Castell, J. V., Jover, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hepatocytes+in+primary+culture:+the+choice+to+investigate+drug+metabolism+in+man.">Human hepatocytes in primary culture: the choice to investigate drug metabolism in man.</a> Current Drug Metabolism. 5 (5), 443-462 (2004).</li><li>Marion, M. J., Hantz, O., Durantel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HepaRG+cell+line:+biological+properties+and+relevance+as+a+tool+for+cell+biology,+drug+metabolism,+and+virology+studies.">The HepaRG cell line: biological properties and relevance as a tool for cell biology, drug metabolism, and virology studies.</a> Methods in Molecular Biology. 640, 261-272 (2010).</li><li>Gripon, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+a+human+hepatoma+cell+line+by+hepatitis+B+virus.">Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (24), 15655-15660 (2002).</li><li>Anth&#233;rieu, S., Rogue, A., Fromenty, B., Guillouzo, A., Robin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+vesicular+steatosis+by+amiodarone+and+tetracycline+is+associated+with+up-regulation+of+lipogenic+genes+in+HepaRG+cells.">Induction of vesicular steatosis by amiodarone and tetracycline is associated with up-regulation of lipogenic genes in HepaRG cells.</a> Hepatology. 53 (6), 1895-1905 (2011).</li><li>Rouge, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PPAR+agonists+reduce+steatosis+in+oleic+acid-overloaded+HepaRG+cells.">PPAR agonists reduce steatosis in oleic acid-overloaded HepaRG cells.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 276 (1), 73-81 (2014).</li><li>Belloni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+a+phospho-STAT3-miRNAs+pathway+improves+vesicular+hepatic+steatosis+in+an+in+vitro+and+in+vivo+model.">Targeting a phospho-STAT3-miRNAs pathway improves vesicular hepatic steatosis in an in vitro and in vivo model.</a> Scientific Reports. 8, 13638 (2018).</li><li>Nunn, A. D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histone+deacetylase+inhibiting+drug+Entinostat+induces+lipid+accumulation+in+differentiated+HepaRG+cells.">The histone deacetylase inhibiting drug Entinostat induces lipid accumulation in differentiated HepaRG cells.</a> Scientific Reports. 6, 28025 (2016).</li><li>Donato, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytometric+analysis+for+drug-induced+steatosis+in+HepG2+cells.">Cytometric analysis for drug-induced steatosis in HepG2 cells.</a> Chemico-Biological Interactions. 181 (3), 417-423 (2009).</li><li>Hellerer, T., Ax&#228;ng, C., Brackmann, C., Hillertz, P., Pilon, M., Enejder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+lipid+storage+in+Caenorhabditis+elegans+using+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+(CARS)+microscopy.">Monitoring of lipid storage in Caenorhabditis elegans using coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (37), 14658-14663 (2007).</li><li>Le, T. T., Ziemba, A., Urasaki, Y., Brotman, S., Pizzorno, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+evaluation+of+hepatic+microvesicular+steatosis+with+multimodal+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy.">Label-free evaluation of hepatic microvesicular steatosis with multimodal coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy.</a> PLoS One. 7 (11), 51092 (2012).</li><li>Guillouzo, A., Corlu, A., Aninat, C., Glaise, D., Morel, F., Guguen-Guillouzo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+hepatoma+HepaRG+cells:+a+highly+differentiated+model+for+studies+of+liver+metabolism+and+toxicity+of+xenobiotics.">The human hepatoma HepaRG cells: a highly differentiated model for studies of liver metabolism and toxicity of xenobiotics.</a> Chemico-Biological Interactions. 168 (1), 66-73 (2007).</li><li>Nelson, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hepatic+HepaRG+cells+maintain+an+organotypic+phenotype+with+high+intrinsic+CYP450+Activity/metabolism+and+significantly+outperform+standard+HepG2/C3A+cells+for+pharmaceutical+and+therapeutic+applications.">Human hepatic HepaRG cells maintain an organotypic phenotype with high intrinsic CYP450 Activity/metabolism and significantly outperform standard HepG2/C3A cells for pharmaceutical and therapeutic applications.</a> Basic &amp; Clinical Pharmacology &amp; Toxicology. 120 (1), 30-37 (2017).</li><li>Gerets, H. H. J., Tilmant, K., Gerin, B., Chanteux, H., Depelchin, B. O., Dhalluin, S., Atienzar, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+primary+human+hepatocytes,+HepG2+cells,+and+HepaRG+cells+at+the+mRNA+level+and+CYP+activity+in+response+to+inducers+and+their+predictivity+for+the+detection+of+human+hepatotoxins.">Characterization of primary human hepatocytes, HepG2 cells, and HepaRG cells at the mRNA level and CYP activity in response to inducers and their predictivity for the detection of human hepatotoxins.</a> Cell Biology and Toxicology. 28 (2), 69-87 (2012).</li><li>Pusl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+fatty+acids+sensitize+hepatocytes+to+bile+acid-induced+apoptosis.">Free fatty acids sensitize hepatocytes to bile acid-induced apoptosis.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 371 (3), 441-445 (2008).</li><li>Gentile, C. L., Pagliassotti, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+fatty+acids+in+the+development+and+progression+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease.">The role of fatty acids in the development and progression of nonalcoholic fatty liver disease.</a> The Journal of Nutritional Biochemistry. 19 (9), 567-576 (2008).</li><li>Mei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+roles+of+unsaturated+and+saturated+fatty+acids+on+autophagy+and+apoptosis+in+hepatocytes.">Differential roles of unsaturated and saturated fatty acids on autophagy and apoptosis in hepatocytes.</a> Journal of Pharmacological Experimental Therapy. 339, 487-498 (2011).</li><li>Malhi, H., Bronk, S. F., Werneburg, N. W., Gores, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+fatty+acids+induce+JNK-dependent+hepatocyte+lipoapoptosis.">Free fatty acids induce JNK-dependent hepatocyte lipoapoptosis.</a> Journal of Biological Chemistry. 281, 12093-12101 (2006).</li><li>Moravcov&#225;, A., &#268;ervinkov&#225;, Z., Ku&#269;era, O., Mezera, V., Rychtrmoc, D., Lotkov&#225;, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+oleic+and+palmitic+acid+on+induction+of+steatosis+and+cytotoxicity+on+rat+hepatocytes+in+primary+culture.">The effect of oleic and palmitic acid on induction of steatosis and cytotoxicity on rat hepatocytes in primary culture.</a> Physiological Research. 64, 627-636 (2015).</li><li>Ohsaki, Y., Shinohara, Y., Suzuki, M., Fujimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pitfall+in+using+BODIPY+dyes+to+label+lipid+droplets+for+fluorescence+microscopy.">A pitfall in using BODIPY dyes to label lipid droplets for fluorescence microscopy.</a> Histochemistry and Cell Biology. 133 (4), 477-480 (2010).</li><li>Rinia, H. A., Burger, K. N., Bonn, M., M&#252;ller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+label-free+imaging+of+lipid+composition+and+packing+of+individual+cellular+lipid+droplets+using+multiplex+CARS+microscopy.">Quantitative label-free imaging of lipid composition and packing of individual cellular lipid droplets using multiplex CARS microscopy.</a> Biophysical Journal. 95 (10), 4908-4914 (2008).</li><li>Waschatko, G., Billecke, N., Schwendy, S., Jaurich, H., Bonn, M., Vilgis, T. A., Parekh, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+in+situ+imaging+of+oil+body+dynamics+and+chemistry+in+germination.">Label-free in situ imaging of oil body dynamics and chemistry in germination.</a> Journal of The Royal Society Interface. 13 (123), (2016).</li><li>J&#252;ngst, C., Winterhalder, M. J., Zumbusch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+long+term+lipid+droplet+tracking+with+CARS+microscopy.">Fast and long term lipid droplet tracking with CARS microscopy.</a> Journal of Biophotonics. 4 (6), 435-441 (2011).</li><li>Welte, M. A., Gould, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplet+functions+beyond+energy+storage.">Lipid droplet functions beyond energy storage.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (10), 1260-1272 (2017).</li><li>Cohen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+as+organelles.">Lipid droplets as organelles.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 337, 83-110 (2018).</li><li>Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+finally+get+a+little+R-E-S-P-E-C-T.">Lipid droplets finally get a little R-E-S-P-E-C-T.</a> Cell. 139 (5), 855-860 (2009).</li></ol>

Bu protokol, heparg hücrelerinin nasıl ayırt edileceği ve sodyum oleat tedavisi ile veziküler yağlanma nasıl uyaracağını açıklar (Şekil 1A). Nitekim, diğer insan hepatosellüler Karsinomu (HCC) hücre hatları ile karşılaştırıldığında, heparg hücre hattı yetişkin insan hepatositlerin özellikleri sergiler, ex vivo yetiştirilmiş primer insan hepatositlere değerli bir alternatif temsil13,14 ...

Hepatik steatozis, trigliserid içeren lipid damlacıkları içinde, karaciğer ağırlığının en az% 5 ' inde intrahepatik yağ birikimi olarak tanımlanır. Uzun süreli hepatik lipid depolama potansiyel olarak geri dönüşümlü bir süreçtir, ancak, karaciğer metabolik disfonksiyon, inflamasyon ve alkol olmayan yağlı karaciğer hastalığı ileri formları yol açabilir (NAFLD), birçok yerinde kronik karaciğer hastalığının baskın nedeni Dünya1,2. NAFLD daha agresif olmayan alkollü steatohepatite (Nash), hangi sırayla siroz ve, hastaların küçük bir yüzdesi, hepatosellüler karsinoma (HCC)1,3için ilerleme olabilir evrimleşebilir multifokal bir hastalıktır. Hiçbir onaylı tedavi Şu anda NAFLD için belirli bir tedavi olarak kullanılabilir ve diyet ve yaşam tarzı modifikasyonları kombinasyonu NAFLD ve Nash yönetim sütun kalır4,5,6.
NAFLD patogenezinde hepatik steatozun gelişimine yol açan moleküler mekanizmalar hala7' ye kadar kalır. Bu bağlamda, fare modelleri insan yağlanma hastalığı ilerlemesini incelemek için geliştirilmiştir. Farklı modellerin sayısız var ve her biri, farklı yaklaşımlar birleştiren genetik, besin ve kimyasal kaynaklı modeller de dahil olmak üzere avantajları ve dezavantajları vardır. Genetiği değiştirilmiş (transgenik veya nakavt) fareler kendiliğinden karaciğer hastalığı gelişir. Ancak, bu mutasyonların insanlar ve silme veya tek bir geni (örn., ob/ob fare) üzerinde aşırı ifade çok nadir olduğu unutulmamalıdır molekül seviyesinde multifaktöriyel insan hastalığının etiyolojisi taklit olmayabilir8,9. Aynı şekilde, diyet veya farmakolojik manipülasyon sonrası fareler tarafından elde edilen hastalık, Erkek8' de NAFLD gelişimi ile ilişkili insan diyetleri etkilerini taklit edemez. Ancak hayvan modelleri NAFLD anlayışında gelişmeleri kolaylaştırmış ve bu yaklaşım şu anda laboratuar araştırmalarında en sık kullanılan stratejidir. Yine de, hayvan modellerinde elde edilen sonuçlar insanlarda çoğaltma sürekli başarısız oldu, klinik10içine kötü çeviri neden.
Bu nedenle, NAFLD 'nin in vitro modellerinde NAFLD ilerlemesinin moleküler mekanizmalarını genişleterek temel bir rol oynayabilir ve çok sayıda bileşiği ekrana getiren değerli bir aracı temsil ederler. Primer Hücre kültürleri, ölümsüzleştirilmiş hücre hatları ve karaciğer biyopsileri araştırma amaçlı olarak yaygın olarak kullanılmıştır11. Primer insan hepatositler insan klinik koşullarını yakından andıran, ancak sınırlı sayıda bağış vardır ve primer hücre kültürleri hücrelerin değişkenliği nedeniyle zayıf yeniden Üretilebilirlik gösterir. Bu gözlemler, etik ve lojistik konularla birlikte, insan primer hepatositlerin12' nin kullanımı ile sonuçlanmıştı. Böylece, hepatik hücre hatları uygun bir alternatif temsil, primer kültür üzerinde birkaç temel avantajları olan, hepatik hücre hatları sürekli büyümek gibi, neredeyse sınırsız yaşam süresi var, ve istikrarlı bir fenotipi var. Dahası, hücre hatları kolaylıkla erişilebilir ve hepatik hücre hatlarının kültür koşulları primer hepatositlerden daha basittir ve farklı laboratuvarlar arasında standarttır.
Burada, yağ asidi sodyum oleat ile tedavi edilen hepatik farklılaşmış HepaRG hücreleri tarafından temsil edilen, karaciğer veziküler steatozis bir in vitro hücre tabanlı modeli ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. HepaRG hücre hattı Hepatit C enfeksiyonu ve bir Edmondson sınıf ben iyi farklılaşmış karaciğer tümörü etkilenen bir kadın hasta kuruldu14. Heparg hücre hattı, iki farklı hücre phenotypes doğru 2% dimetil sulfoxid (DMSO) maruz kalma üzerine ayrım yeteneğine sahip bir insan bipotent progenitör hücre hattı: biliyer benzeri ve hepatosit benzeri hücreler. Farklılaşmış HepaRG hücreleri (dHepaRG) Yetişkin hepatositlerle bazı özellikleri ve özellikleri paylaşır ve albumin, AldolaseB, sitokrom P450 2E1 (CYP2E1) ve sitokrom P450 3A4 (CYP3A4) 13 gibi karaciğer spesifik genleri stabil bir şekilde ifade etme yeteneğine sahiptir (adım 3). Dheparg hücrelerinin yağ asidi tuz sodyum oleat (250 μM) ile tedavisi 5 gün boyunca sitoplazmik lipid damlacıkları üretmeye yol açar, yağ karaciğerinin etkilerini taklit eder14,15,17,18 ( Adım 4). Lipid damlacıkları birikimi yağ kırmızı O boyama ile kolayca tespit edilebilir (adım 5), nötr trigliseritler ve lipidler kırmızı-turuncu lekeleri bir lysochrome yağ çözünür boya. Yağ dHepaRG içinde lipidleri verimli bir şekilde ölçmek için, burada 4, 4-difluoro-1, 3, 5, 7-tetrametil-4-bora-3A, 4A-Diaza-s-indacene (Bodipy 505/515) (adım 6), lokalleştiren bir lipophilik floresan prob ile boyama sonrası sitofluorimetrik analiz göstermektedir hücre içi lipid organları ve lipid damlacıkları etiket için kullanılan19. Dahası, burada, dheparg hücrelerinde çeşitli metabolik genlerin niceliksel polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) (adım 7) gen ifadesi deregülasyon ile yağlanma nasıl değerlendirileceği gösterilir. Sodyum oleat tedavisinden sonra lipid damlacıkları birikimi daha fazla karakterize etmek ve ölçmek için, biz tutarlı Anti-Stokes Raman saçılma (CARS) mikroskopisi (adım 8), görselleştirme ve ölçülmesi sağlayan yenilikçi bir teknik yapıldı etiketleme olmaksızın lipid damlacıkları20,21.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:799px;" width="797">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Hyclone HyClone Fetal Clone II&#160;</td>
			<td style="width:240px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:143px;">SH30066</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">William&#8217;s E medium with GlutaMAX&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Thermofisher</td>
			<td>32551087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:240px;">SIGMA</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Insulin&#160;</td>
			<td style="width:240px;">SIGMA</td>
			<td>I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hydrocortisone hemisuccinate</td>
			<td style="width:240px;">SIGMA</td>
			<td>H2270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">DMSO, dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:240px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">D2438&#160;&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Sodium Oleate</td>
			<td style="width:240px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">O7501&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Methanol</td>
			<td style="width:240px;">SIGMA</td>
			<td>179337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:240px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">278475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BODIPY 505/515</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>D3921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">PBS</td>
			<td style="width:240px;">Thermofisher</td>
			<td>14190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formaldehyde solution</td>
			<td style="width:240px;">SIGMA</td>
			<td>252549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">RNAse free DNAseI</td>
			<td style="width:240px;">Promega</td>
			<td>M198A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass-bottomed dishes</td>
			<td style="width:240px;">Willco Wells</td>
			<td style="width:143px;">GWST-5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Oil Red solution</td>
			<td style="width:240px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">O625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">CellTiter 96 AQueous One Solution</td>
			<td style="width:240px;">Promega&#160;</td>
			<td style="width:143px;">G3582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">q-PCR oligo name</td>
			<td>Sequence</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ACACB FOR</td>
			<td>CAAGCCGATCACCAAGAGTAAA</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">ACACB REV</td>
			<td>CCCTGAGTTATCAGAGGCTGG</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:239px;">b-actin FOR</td>
			<td style="width:240px;">GCACTCTTCCAGCCTTCCT</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:239px;">b-actin REV</td>
			<td style="width:240px;">AGGTCTTTGCGGATGTCCAC</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ALBUMIN FOR</td>
			<td>TGCTTGAATGTGCTGATGACAGG</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ALBUMIN REV</td>
			<td>AAGGCAAGTCAGCAGGCATCTCATC</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ALDOB FOR</td>
			<td>GCATCTGTCAGCAGAATGGA&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ALDOB REV</td>
			<td>TAGACAGCAGCCAGGACCTT</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">APOB FOR</td>
			<td>CCTCCGTTTTGGTGGTAGAG</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">APOB REV</td>
			<td>&#160;CCTAAAAGCTGGGAAGCTGA</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">APOC3 FOR</td>
			<td>CTCAGCTTCATGCAGGGTTA</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">APOC3 REV</td>
			<td>GGTGCTCCAGTAGTCTTTCAG</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CPT1A FOR</td>
			<td>TCATCAAGAAATGTCGCACG</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CPT1A REV</td>
			<td>GCCTCGTATGTGAGGCAAAA</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CYP2E1 FOR</td>
			<td>TTGAAGCCTCTCGTTGACCC</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CYP2E1 REV</td>
			<td>CGTGGTGGGATACAGCCAA</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CYP3A4 FOR</td>
			<td>CTTCATCCAATGGACTGCATAAAT</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CYP3A4 REV</td>
			<td>TCCCAAGTATAACACTCTACACAGACAA</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GAPDH FOR</td>
			<td>TGACAACTTTGGTATCGTGGAAGG</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GAPDH REV</td>
			<td>AGGGATGATGTTCTGGAGAGCC</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GPAM FOR</td>
			<td>TCTTTGGGTTTGCGGAATGTT</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GPAM REV</td>
			<td>ATGCACATCTCGCTCTTGAATAA</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IL6 FOR</td>
			<td>CCTGAACCTTCCAAAGATGGC</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IL6 REV</td>
			<td>ACCTCAAACTCCAAAAGACCAGTG</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PDK4 FOR</td>
			<td>ACAGACAGGAAACCCAAGCCAC</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PDK4 REV</td>
			<td>TGGAGGTGAGAAGGAACATACACG</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PLIN2 FOR</td>
			<td>TTGCAGTTGCCAATACCTATGC</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PLIN2 REV</td>
			<td>CCAGTCACAGTAGTCGTCACA</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PLIN4 FOR</td>
			<td>AATGAGTTGGAGGGGCTGGGGGACATC</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PLIN4 REV</td>
			<td>GGTCACCTAAACGAACGAAGTAGC</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SCD FOR</td>
			<td>TCTAGCTCCTATACCACCACCA</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SCD REV</td>
			<td>TCGTCTCCAACTTATCTCCTCC</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SLC2A1 FOR</td>
			<td>TGCTCATCAACCGCAACGAG</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SLC2A1 REV</td>
			<td>CCGACTCTCTTCCTTCATCTCCTG</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">18S FOR</td>
			<td>CGCCGCTAGAGGTGAAATTC</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">18S REV</td>
			<td>TTGGCAAATGCTTTCGCTC</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducing and characterizing vesicular steatosis in differentiated heparg cells

Hepatik steatozis, hepatositlerde trigliserid içeren lipid damlacıkları birikiminden oluşan bir metabolik fonksiyon bozukluğu temsil eder. Aşırı yağ birikimi, alkollü olmayan yağlı karaciğer hastalığına (NAFLD) yol açar, bu da potansiyel olarak geri dönüşümlüdür ve alkol içermeyen steatohepatite (NASH) ve sonunda siroz ve hepatosellüler karsinoma (HCC) içine gelişebilir. Hepatositlerde lipid birikimini NASH 'e ilerlemesiyle bağlayan moleküler mekanizmalar, geri dönüşümsüz karaciğer hasarı, fibrozis, siroz ve hatta HCC hala belirsiz kalır. Bu amaçla, NAFLD 'ye neden olan patolojik süreçleri hafifletmek için birkaç in vitro ve in vivo model geliştirilmiştir. Bu çalışmada, biz yağ asidi tuz sodyum oleat ile tedavi DMSO-diferensiyel hepatik heparg hücrelerinden oluşan karaciğer veziküler yağlanma indüksiyonu için bir hücresel model açıklanmaktadır. Nitekim, sodyum oleat tedavi HepaRG hücreleri sitoplazmada lipid damlacıkları birikir ve steatosis tipik özelliklerini gösterir. Bu in vitro insan modeli, in vivo fareler modellerinin yanı sıra primer insan hepatositlerine değerli bir alternatif oluşturmaktadır. Ayrıca, HepaRG hücrelerinde yağ birikiminin ölçülmesi ve değerlendirilmesi için çeşitli yöntemlerin bir karşılaştırmasını sunuyoruz, yağlı kırmızı O boyama, sitoflorimetrik Bodipy ölçümü, qPCR tarafından metabolik gen ifade analizi ve tutarlı Anti-Stokes Raman saçılma (CARS) mikroskopisi. CARS görüntüleme, Raman spektroskopisinin kimyasal özgüllüğünü, malzeme bilimi uygulamalarında iyi bilinen bir kimyasal analiz tekniğinin, yüksek hızlı, yüksek çözünürlüklü doğrusal olmayan optik mikroskopların avantajlarını, hassas lipid birikimi ve lipid damlacık dinamiklerinin ölçülmesi. Veziküler steatozun indüksiyonu için verimli bir in vitro modelin kurulması, lipid birikiminin ölçülmesi ve karakterize edilmesi için doğru bir yöntemin yanı sıra, NAFLD 'nin erken aşama tanısının gelişimine yol açabilir Moleküler Belirteçlerin tanımlanması ve yeni tedavi stratejilerinin oluşturulması.

Bu protokol, DMSO-farklılaşmış HepaRG hücrelerinde veziküler steatozis 'i sodyum oleat tedavisinde (Şekil 1A) teşvik etmek ve karakterize etmek için etkili bir yöntem açıklanmaktadır.
HepaRG hücrelerinin farklılaşması. Farklılaşmaya etkili bir şekilde sebep olmak için proliferasyon hücreleri düşük yoğunlukta (2,5 x 104 hücreler/cm2) çoğalması ortamında tohumlama yapılmalıd?...

Watch this Scientific Journal Video about Inducing and Characterizing Vesicular Steatosis in Differentiated HepaRG Cells at JoVE.com

Inducing and Characterizing Vesicular Steatosis in Differentiated HepaRG Cells

Bu çalışmada, farklılaştırılmış HepaRG hücrelerinde yağ asidi tuz sodyum oleat ile karaciğer veziküler steatozis inducing için ayrıntılı bir protokol tarif ve tutarlı Anti-Stokes dahil lipid birikiminin tespiti ve ölçülmesi için yöntemler istihdam Raman saçılma (CARS) mikroskobu, sitofluorimetrik analiz, yağ kırmızı O boyama, ve qPCR.

Farklılaşmış HepaRG hücrelerinde veziküler steatozu indükleyen ve karakterize etme

Hepatic steatosis represents a metabolic dysfunction that results from an accumulation of triglyceride-containing lipid droplets in hepatocytes. Excessive ...

Bu protokol, diferansiye HepaRG hücrelerinde karaciğer veziküler steatozun nasıl indüklenir ve lipid birikiminin saptanması ve ölçülmesi için yöntemler açıklanmaktadır. Bu in vitro insan hücre modeli in vivo fare modelleri ve birincil insan hepatositler için değerli bir alternatif temsil eder. Bir azot cryopreserved düşük passage toplu HepaRG hücreleri 37 derece santigrat banyo içine batırarak çözülür buzları çözülene kadar.Hücreleri hızla 10 mililitre çoğalan ortam içeren 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Beş dakika santrifüj ettikten sonra, supernatant atın ve çoğalan orta beş mililitre hücreleri yeniden askıya. Hücreleri sayVe santimetre kare başına 250, 000 hücreleri plaka için seyreltin.Hücreleri 100 milimetrelik hücre kültürü tabaklarına plakalayın ve her iki veya üç günde bir ortamı yenileyin. Hücreler yaklaşık 24 saatlik bir süre ile çoğalır. HepaRG hücreleri %80 biraraya geldiklerinde, %0,05 tripsin çözeltisi ile üç ila beş dakikalık bir kuluçka dan ayırın.Hücreleri çoğalan orta ve santrifüjde daha önce olduğu gibi beş dakika toplayın. Supernatant atın ve çoğalan orta beş mililitre ile hücreleri yeniden askıya. Yine, hücreleri saymak ve plaka için seyreltmek 250, santimetre kare başına 000 hücreleri.Bu aşamada, deneyleri başlatmak için uygun sayıda hücreye ulaşmak için bu adımları yineleyerek hücreleri yükseltin. HepaRG hücrelerini kriyokorunmuş olarak, hücreleri %0,05 tripsin çözeltisi ile üç ila beş dakikalık bir kuluçka dan 24 saat sonra ayırın. Hücreleri çoğalan orta ve santrifüjde daha önce olduğu gibi beş dakika toplayın.Supernatant atın, dondurucu ortam toplu başına bir mililitre hücreleri resuspend, ve sıvı azot toplu dondurucu. Gün sıfır, tohum HepaRG hücreleri 250, 000 hücre kare santimetre başına kültür tedavi yemekleri içine proliferasyon ortamı uygun bir hacim ile. Her bir teşp için iki tabak, kontrol hücreleri için bir ve oleate ile tedavi edilen hücreler için bir tabak gerekir.İkinci gün ve dördüncü günde, ortamı uygun bir çoğalma hacmiyle değiştirin ve hücrelerin birleştiği zamana kadar büyümesine izin verin. Yedinci günde, hücreler %100 konfluent olmalıdır. Hücreleri 1X PBS ile bir kez yıkayın.Ardından, 1X PBS'yi çıkarın ve uygun bir farklılaştırma ortamı hacmi ekleyin. Sekiz, dokuz, 12, 15 ve 18 günlerinde, uygun bir farklılaşma ortamı hacmi eklemeden önce hücreleri bir kez 1X PBS ile yıkayın. 21. günde HepaRG hücrelerini mikroskop altında gözlemleyin ve hücrelerin eşzamanlı farklıkültürler olduğundan emin olun.Bir kontrol olarak, farklılaşma belirteç genlerinin gen ekspresyonu analizi gerçekleştirmek için bir kontrol çanak hasat. 21. günde, diferansiye HepaRG hücreleri sıvı nitrojende kriyoopreserved olabilir. 21. günde seyreltik sodyum, 250 mikromos'luk son konsantrasyona kadar uygun bir tam farklılaşma hacmi ile oleate.Araç kontrol tedavisi yapmak için farklılaşma ortamının başka bir aliquot içine bir ila 400 oranında% 99 metanol ekleyin. Hücreleri 1X PBS ile bir kez yıkayın ve araç veya sodyum oleat ortamı ekleyin. 23. gün ve 25.26. günde, optik mikroskopi ile hücreleri gözlemleyin. Lipid damlacıkları sodyum oleat tedavi hücrelerinde birikir ve kolayca sitoplazmada yarı saydam damlacıklar olarak görülebilir. Yağ Kırmızı O boyama gerçekleştirmek için, ilk 1X PBS ile hücreleri bir kez yıkayın ve tamamen 1X PBS kaldırın.Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca %4 paraformaldehit ve kuluçka ya ekleyin. Paraformaldehit çıkarın ve 1X PBS ile iki kez hücreleri yıkayın. PBS çıkardıktan sonra, oda sıcaklığında beş dakika boyunca% 60 izopropanol ile hücreleri kuluçka.Isopropanol çıkarın ve hücrelerin oda sıcaklığında tamamen kurumasına izin. Şimdi hücrelere Yağ Kırmızı O çalışma solüsyonu ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçka. Her örnek için gerekli çalışma çözümünün hacmi, hücreleri birliş için kullanılan ortam hacmine karşılık gelir.Yağ Kırmızı O çözeltisini çıkarın ve hemen çift distile su ekleyin. Hücreleri çift distile su ile dört kez yıkadıktan sonra, analiz için mikroskop altında görüntüleri elde. Yağ Kırmızı O boya yıkar, tüm su çıkarın ve kurumasını bekleyin.Sonra, oda sıcaklığında hafif sallayarak 10 dakika boyunca% 100 isopropanol ve kuluçka bir mililitre ekleyin. Pipet eluted Oil Red O boya ile isopropanol birkaç kez yukarı ve aşağı, tüm Petrol Red O çözüm olmasını sağlamak. Çözümü bir cuvette aktarın.Optik yoğunluğu 500 nanometre de spektrofotometri ile ölçün ve boş olarak%100 isopropanol kullanın. Hücreleri 1X PBS ile bir kez yıkayın. Sonra, 100 nanomolar Bodipy ile inkübül 37 santigrat derece 40 dakika karanlıkta 1X PBS seyreltilmiş.Akış sitometri ölçümlerine lekesiz bir kontrol eklenmelidir. Boyama çözeltisini çıkarın ve hücreleri 1X PBS ile bir kez yıkayın. Daha sonra hücreleri tekrar yıkayın ve PBS'yi tamamen çıkarın.Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca %4 paraformaldehit ve kuluçka ya ekleyin. Paraformaldehit çıkarın ve PBS beş dakika boyunca üç kez örnekleri yıkayın. Hücreler 1X PBS'de dört santigrat derecede tutulabilir veya hemen görüntülenebilir.Depolama için Parafilm ile sarın ve hücrelerin kurumasını önlemek için alüminyum folyo ile kaplayın. Steatozun etkin indüksiyonuna doğru lazim, oleate ile tedavi edilir ve HepaRG hücrelerini kontrol etmek Için Oil Red O boyası ile boyandı. Boyama sonra, lipid damlacıkları kolayca kırmızı damlacıklar olarak görülebilir.Boyama izopropanol ile eluted Oil R O boya spektrofotometrik ölçüm ile ölçülebilir. Hücrelerden eluted Oil Red O absorbeance doğrudan sitoplazmik lipid damlacık birikimi ile orantılıdır. Sodyum oleat konsantrasyonu ve maruz kalma süresi MTT kolorimetrik hücre canlılığı tayini ile belirlendi.Formosan ürün 490 nanometre de emiciliği ile ölçülür ve kültürde yaşayan hücrelerin sayısı ile doğru orantılıdır. Sodyum oleat tedavisi sodyum palmitat tedavisi ile karşılaştırıldı. Apoptotik ilaç doksorubisin bir kontrol olarak kullanılmıştır.Sodyum oleat tedavisi sonrası hücresel lipid içeriğinin artmasını ölçmek için, Bodipy boya ile boyama lipid damlacıkları etiketlemek için kullanılmıştır. Sitoflorometrik analiz kullanılarak, trigliserid içeriğinin kontrol hücrelerine göre oleatla tedavi edilen hücrelerde daha yüksek olan Bodipy ortalama floresan yoğunluğu ile ölçülmesi mümkündür. Bu oleate tedavi den sonra verimli yağ birikimi gösterir.Gerçekten de, Bodipy-lekeli hücrelerin görüntüleri kontrol hücrelerinde görünmez oleat tedavi hücrelerde parlak yeşil floresan lipid damlacıkları göstermektedir. Sodyum oleat tedavisi sonrası lipid damlacıklarının birikimini daha da karakterize etmek için, CARS mikroskopisi etiketleme den olmadan lipid damlacıklarının sayısallaştırılmasını sağlayan metin protokolünde açıklandığı şekilde yapılabilir. Bu hücre tabanlı model, onkotik olmayan yağlı karaciğer hastalığında rol oynayan moleküler mekanizmalar hakkındaki bilgileri artırabilir ve erken tanı ve yeni tedavi stratejileri için yeni belirteçlerin geliştirilmesine yol açabilir.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

İnsan Diş Pulp Kök Hücre İzolasyonu, Karakterizasyonu ve Karşılaştırmalı Farklılaşma İki Farklı Yöntemler Kullanılarak Daimi Dişler türetilen

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Inducing Myointimal Hyperplasia Versus Atherosclerosis in Mice: An Introduction of Two Valid Models

Farelerde Ateroskleroz Karşı miyointimal hiperplazide uyaran: İki Geçerli Modellerinin An Introduction

Various in vivo laboratory rodent models for the induction of artery stenosis have been established to mimic diseases that include arterial plaque ...

Minimal Invasive Surgical Procedure of Inducing Myocardial Infarction in Mice

Farelerde Miyokard İnfarktüsü Oluşturan Minimal İnvaziv Cerrahi Prosedür

Myocardial infarction still remains the main cause of death in western countries, despite considerable progress in the stent development area in the last ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pankreas Kanseri Yeni Tedavi Stratejileri Geliştirme Hücre Özellikleri Kök incelenmesi

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glokom uyaran bir de Prosedürü<em&gt; İn Vivo</em&gt; Rat Modeli ve Tüm montaj Retina Hazırlık

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

Inducing Ischemia-reperfusion Injury in the Mouse Ear Skin for Intravital Multiphoton Imaging of Immune Responses

Bağışıklık Yanıtları intravital multiphoton Görüntüleme Fare Kulak Skin uyaran İskemi-reperfüzyon yaralanması

Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin kaynaklı bağırsak Organoids şişme: Bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Deney Kistik Fibrozis Hastalarında İlaç Tepki değerlendirilmesi için

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Optimize Analizi<em&gt; İn Vivo</em&gt; ve<em&gt; İn Vitro</em&gt; Karaciğer Steatoz

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic ...

Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation

Doğrudan Intratracheal Lipopolysaccharide Instilasyon ile farelerde akut akciğer hasarının İndükleme

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. ...

A Revised Method for Inducing Secondary Lymphedema in the Hindlimb of Mice

Farelerin Hindlimb Sekonder Lenfödem Indükleme için Gözden Geçirilmiş Bir Yöntem

Animal models are of paramount importance in the research of lymphedema in order to understand the pathophysiology of the disease but also to explore ...