Name: short-term free-floating slice cultures from the adult human brain
Uploaded: 2019-11-05T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain at JoVE.com

ويدعم هذا العمل من قبل FAPESP (منحه 25681-3/2017 إلى AS), الرؤوس (زمالة ما بعد الدكتوراه PNPD/INCT-A.F. وزمالة ما قبل الدكتوراه إلى N.D.M.) و FAEPA. G.M.A. حاصل علي زمالة الماجستير من FAPESP (MS 2018/06614-4). N.G.C. يحمل زمالة أبحاث CNPq. نشكر المرضي وعائلاتهم علي التبرع بالانسجه المقطوعة لهذه الدراسة. ونود ان نعترف بدعم المقيمين والممرضين والفنيين وفريق CIREP ، من المستشفى السريري في كليه الطب في ريبيراو بريتو ، جامعه ساو باولو ، الذي ساعد في مختلف مراحل العملية.

وقدتم الحصول علي انسجه دماغ الكبار الحية من المرضي الذين يخضعون لجراحه الأعصاب المعدية لعلاج الصرع الفص الصدغي الدوائي (الشكل 1ا). وقد وافقت لجنه الأخلاقيات علي جميع الإجراءات من مستشفي العيادات في مدرسه ريبيراو بريتو الطبية (17578/2015) ، ووافق المرضي (أو الأشخاص المس...

هذا البروتوكول لإنتاج العائمة الحرة ، والثقافات شريحة قصيرة الأجل هو وسيله بديله لزراعه شرائح الإنسان البالغين الاستعمار الكبير. مثل هذا البروتوكول لشرائح الثقافات قد تكون قابله للدراسة علي (ولكن ليس علي سبيل الحصر) optogenetics1,44,45, الكهربائ...

استخدام عينات الإنسان في البحوث هو بشكل لا لبس فيه خيارا كبيرا لدراسة امراض المخ البشرية ، والتقنيات الحديثة فتحت طرقا جديده لتجريب قويه واخلاقيه باستخدام الانسجه المستمدة من المريض. وقد استخدمت أساليب مثل الثقافات العضوية/شريحة أعدت من الدماغ البشري الكبار بشكل متزايد في نماذج مثل optogenetics1، الكهربية2،3،4،5، اللدونة 6،7،8،9، السمية العصبية/نيوروبروتكايشن10،11،12،13، العلاج الخلوي14، فحص المخدرات15،16،17، علم الوراثة وتحرير الجينات12،18،19،20، من بين أمور أخرى ، كاستراتيجية لتحسين فهم الامراض العصبية خلال مرحله البلوغ.
يعتمد فهم أليات الكامنة وراء امراض المخ البشرية علي الاستراتيجيات التجريبية التي تتطلب عددا كبيرا من المواضيع. وعلي النقيض من ذلك ، في حاله الثقافات الشريحة ، علي الرغم من ان الوصول إلى عينات الإنسان لا يزال صعبا ، فان امكانيه توليد ما يصل إلى 50 شرائح من عينه قشريه واحده تلتف جزئيا علي شرط تجنيد متطوعين متعددين عن طريق زيادة عدد من النسخ المتماثلة وأداء المقايسات لكل الانسجه التي تم جمعها21.
وقد وصفت العديد من البروتوكولات للثقافات الدماغ العضوية/شريحة الثقافات ، بدءا من الكلاسيكية كوة المسودات22،23 إلى الاسطوانه أنبوب24،25،26، شبه نفاذيه الاغشيه واجهه27،28،29،30، والحرة العائمة شرائح31،32. اعتمادا علي خصوصيات التصميم التجريبي ، كل تقنيه لها مزاياها الخاصة وعيوبها. قصيرة الأجل, العائمة الحرة شرائح الثقافات من العقول البشرية الكبار في بعض الحالات مفيده علي الطريقة التي يستخدمها Stoppini et al.27, إذا النظر في حقيقة انه علي الرغم من بقاء الخلية علي المدى الطويل في المختبر عاده ما يكون مصدر قلق كبير عند تقييم ثقافة أسلوب, في كثير تجارب فقط [شورت فتر] من وقت في ثقافة لازمه12,31,32,33,34,35. وفي ظل هذه الظروف ، فان استخدام الثقافات العائمة الحرة يقدم ميزه كونها ابسط وأكثر فعاليه من حيث التكلفة ، فضلا عن انها تشبه بشكل أدق حاله الانسجه البشرية الاصليه من الشرائح المحتفظ بها في الثقافة علي مدي 2-3 أسبوعا.
علي الرغم من إمكانات شريحة الثقافات لعلوم الأعصاب ، والدراسات التي تستخدم الانسجه العصبية الكبار لاعداد مثل هذه الثقافات لا تزال نادره ، وخاصه من البشر. توضح هذه المقالة بروتوكول لاستخدام انسجه المخ التي تم جمعها من المتبرعين البشريين الاحياء المقدمة لجراحه الدماغ المعدية لاعداد الثقافات شريحة العائمة الحرة. وترد تفاصيل إجراءات الحفاظ علي اختبارات البيولوجيا الحيوية والخلوية وأداءها باستخدام هذه الثقافات. وقد ثبت هذا البروتوكول قيمه لتحليل القدرة علي البقاء ووظيفة الخلايا العصبية في التحقيقات علي أليات الامراض العصبية المرتبطة بمرحله البلوغ.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1571px;" width="1570">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">2-Propanol</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td style="width:344px;">1096341000</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Acrylamide/Bis-Acrylamide, 30% solution</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">A3449&#160;</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Ammonium persulfate</td>
			<td style="width:200px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">A3678-25G</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Amphotericin B</td>
			<td style="width:200px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">15290-018</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Antibody anti-ERK 2 (rabbit)</td>
			<td>Santa Cruz Biotecnology</td>
			<td>sc-154</td>
			<td>Dilution 1:1,000 in BSA 2.5%</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Antibody anti-pERK (mouse)</td>
			<td>Santa Cruz Biotecnology</td>
			<td>sc-7383</td>
			<td>Dilution 1:1,000 in BSA 2.5%</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BDNF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SRP3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">A7906</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Bradford 1x Dye Reagent</td>
			<td style="width:200px;">BioRad</td>
			<td style="width:344px;">500-0205</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">EDTA</td>
			<td style="width:200px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">T3924</td>
			<td style="width:505px;">Used in RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hank&#39;s Balanced Salts</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H1387-10X1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hepes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td style="width:344px;">1003171000</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Hydrogen Peroxide (H2O2)</td>
			<td style="width:200px;">Vetec</td>
			<td align="right" style="width:344px;">194</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (anti-mouse)</td>
			<td style="width:200px;">GE</td>
			<td style="width:344px;">NA931-1ML</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">NaCl</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td align="right" style="width:344px;">1064041000</td>
			<td style="width:505px;">Used in RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Neurobasal A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10888-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Non-fat dry milk (Molico)</td>
			<td style="width:200px;">Nestl&#233;</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">Used for membrane blocking</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">PBS Buffer pH 7,2</td>
			<td>Laborclin</td>
			<td align="right">590338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicilin/Streptomicin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:521px;">Potassium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td align="right">1049361000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:521px;">Prime Western Blotting Detection Reagent</td>
			<td style="width:200px;">GE</td>
			<td style="width:344px;">RPN2232</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit)</td>
			<td>GE</td>
			<td>NA934-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:521px;">SDS</td>
			<td style="width:200px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">L5750</td>
			<td style="width:505px;">Used in RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:521px;">TEMED</td>
			<td style="width:200px;">GE</td>
			<td style="width:344px;">17-1312-01</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Tris</td>
			<td style="width:200px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">T-1378</td>
			<td style="width:505px;">Used in RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:521px;">Triton x-100</td>
			<td style="width:200px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">X100</td>
			<td style="width:505px;">Used in RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:521px;">Ultrapure Water</td>
			<td style="width:200px;">Millipore</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">Sterile water, derived from MiliQ water purification system</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:521px;">Equipment and Material</td>
			<td style="width:200px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:50px;">24-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CL S3526</td>
			<td>Flat Bottom with Lid</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;">Amersham Potran Premium (nitrocellulose membrane)&#160;</td>
			<td>GE</td>
			<td>29047575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:521px;">Carbogen Mixture</td>
			<td style="width:200px;">White Martins</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">95% O2, 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:46px;width:521px;">CO2 incubator</td>
			<td style="width:200px;">New Brunswick Scientific</td>
			<td style="width:344px;">CO-24</td>
			<td style="width:505px;">Incubation of slices 5% CO2, 36&#186;C</td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;width:521px;">Microplate Reader</td>
			<td style="width:200px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:521px;">Microtubes</td>
			<td style="width:200px;">Greiner</td>
			<td style="width:344px;">001608</td>
			<td style="width:505px;">1,5mL microtube</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:521px;">Motorized pestle</td>
			<td style="width:200px;">Kimble Chase</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:521px;">Plastic spoon</td>
			<td style="width:200px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">Size of a dessert spoon</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:521px;">Razor Blade</td>
			<td style="width:200px;">Bic</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">Chrome Platinum, used in slicing with vibratome</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:37px;width:521px;">Scalpel Blade</td>
			<td style="width:200px;">Becton Dickinson (BD)</td>
			<td style="width:344px;">Number 24</td>
			<td style="width:505px;">Used for slicing of tissue; recommended same size or smaller</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:34px;width:521px;">Superglue (Loctite Super Bonder)</td>
			<td style="width:200px;">Henkel</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">Composition: Etilcianoacrilato; 2-Propenoic acid; 6,6&#39;-di-terc-butil-2,2&#39;-metilenodi-p-cresol; homopolymer</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;">Vibratome&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14047235612 - VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:37px;width:521px;">Name of Material/ Equipment for Immunohistochemistry</td>
			<td style="width:200px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:41px;">Antibody anti-NeuN (mouse)</td>
			<td>Millipore&#160;</td>
			<td>MAB377</td>
			<td>Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:521px;">Antibody anti-GFAP (mouse)</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td style="width:344px;">MAB360</td>
			<td>Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Antibody anti-Iba1 (rabbit)</td>
			<td style="width:200px;">Abcam</td>
			<td style="width:344px;">EPR16588 - ab178846</td>
			<td>Dilution 1:2,000 in Phosphate Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Biotinylated anti-mouse IgG Antibody (H+L)</td>
			<td style="width:200px;">Vector</td>
			<td style="width:344px;">BA-9200</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">DAB</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">D-9015</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Entellan</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td align="right" style="width:344px;">107960</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Ethanol</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td style="width:344px;">1.00983.1000</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Gelatin</td>
			<td style="width:200px;">Synth</td>
			<td style="width:344px;">00G1002.02.AE</td>
			<td style="width:505px;">Used for coating slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SM2010R</td>
			<td>Equipped with Freezing Stage (BFS-10MP, Physiotemp), set to -40&#186;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal Donkey Serum</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">158127</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit)</td>
			<td>GE</td>
			<td>NA934-1ML</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Slides (Star Frost)</td>
			<td>Knittel Glaser</td>
			<td></td>
			<td>Gelatin coated slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td style="width:200px;">Vetec</td>
			<td>60REAVET017050</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Vectastain ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard)</td>
			<td style="width:200px;">Vector</td>
			<td style="width:344px;">PK-4000, Kit Standard</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Xylene</td>
			<td style="width:200px;">Synth</td>
			<td style="width:344px;">01X1001.01.BJ</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

short-term free-floating slice cultures from the adult human brain

التنميط العضوي ، أو الثقافات الشريحة ، وقد استخدمت علي نطاق واسع لنماذج الجوانب من الجهاز العصبي المركزي يعمل في المختبر. علي الرغم من إمكانات شريحة الثقافات في علوم الأعصاب ، والدراسات التي تستخدم الانسجه العصبية الكبار لاعداد مثل هذه الثقافات لا تزال نادره ، وخاصه تلك التي من البشر. استخدام الانسجه البشرية الكبار لاعداد شريحة الثقافات جذابة بشكل خاص لتعزيز فهم الامراض العصبية البشرية ، كما انها تحمل خصائص فريدة من نوعها من الدماغ البشري الناضجة التي تفتقر إلى الشرائح المنتجة من القوارض (عاده حديثي الولادة) النسيج العصبي. يصف هذا البروتوكول كيفيه استخدام انسجه المخ التي تم جمعها من المتبرعين الاحياء الذين قدموا إلى جراحه المخ المعدية لاعداد الثقافات القصيرة الأجل والعائمة الحرة. وتقدم أيضا إجراءات لصيانة واجراء اختبارات البيولوجيا الحيوية والخلايا البيولوجية باستخدام هذه الثقافات. تظهر النتائج التمثيلية ان التصفيح القشري البشري النموذجي يتم الاحتفاظ به في شرائح بعد 4 أيام في المختبر (DIV4) ، مع وجود متوقع لأنواع الخلايا العصبية الرئيسية. وعلاوة علي ذلك ، الشرائح في DIV4 الخضوع للموت خليه قويه عند الطعن مع التحفيز السامة (H2O2) ، مما يدل علي امكانيه هذا النموذج لتكون بمثابه منصة في اختبارات موت الخلايا. هذا الأسلوب ، وهو بديل ابسط وفعاله من حيث التكلفة للبروتوكول المستخدمة علي نطاق واسع باستخدام ادراج غشاء ، ويوصي بشكل رئيسي لتشغيل المقايسات علي المدى القصير تهدف إلى كشف أليات الضمور العصبي وراء امراض الدماغ المرتبطة بالسن. وأخيرا ، علي الرغم من ان البروتوكول مكرس لاستخدام الانسجه القشرية التي تم جمعها من المرضي الذين قدموا إلى العلاج الجراحي لصرع الفص الصدغي المقاوم للادويه ، الا انه يقال ان الانسجه التي يتم جمعها من مناطق/ظروف الدماغ الأخرى يجب ان تكون أيضا تعتبر مصادر لإنتاج الثقافات شريحة العائمة الحرة مماثله.

ومن الجوانب الهامه لتقييم نوعيه وصحة الشرائح المستزرعة وجود وشكل نموذجي لأنواع الخلايا العصبية المتوقعة ، والخلايا العصبية ، والكريات الدليج. ولوحظ الهندسة المعمارية النموذجية لتصفيح القشرية البشرية في شريحة في DIV4 ، التي كشفت عنها المناعية العصبية (الشكل 2د). ال...

Watch this Scientific Journal Video about Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain at JoVE.com

Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain

يتم تقديم بروتوكول لاعداد الثقافات شريحة العائمة الحرة من الدماغ البشري الكبار. البروتوكول هو اختلاف أسلوب الثقافة شريحة تستخدم علي نطاق واسع باستخدام ادراج غشاء. انها بسيطه ، وفعاله من حيث التكلفة ، وأوصيت لتشغيل اختبارات قصيرة الأجل تهدف إلى كشف أليات الضمور العصبي وراء امراض الدماغ المرتبطة بالعمر.

قصيرة الأجل الحرة العائمة شريحة الثقافات من الدماغ البشري الكبار

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of ...

نقدم بروتوكولًا لإعداد ثقافات شريحة عائمة مجانية من أنسجة الدماغ التي تم جمعها من المتبرعين البشريين الأحياء المقدمة لجراحة الدماغ التي يعاد تجديدها. هذه الثقافة هي قابلة لإجراء البيوكيميائية والخلايا البيولوجيا المقايسة أو الكيمياء المناعية. ومن المتوقع أن يسهم في توضيح الآلية الكامنة في التنكس العصبي في أمراض الدماغ المرتبطة بها.الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أنه بديل أبسط وفعالة من حيث التكلفة لاتفاقية ثقافة الشريحة الكلاسيكية باستخدام إدراج الأغشية. على الرغم من أن البروتوكول العام ليس معقدًا ، إلا أن بعض الخطوات مثل إزالة السحايا ، وإلتصاق الأنسجة على قرص العينة الاهتزازية ، والاستئصال للكيمياء المناعية هي أفضل مفهومة عند إظهارها بصريًا. المساعدة في إثبات الإجراء ستكون نيلي مينديز وغلاوشيا الوسائطيا الذين هم طلاب غراد، وجيوفانا نوغيرا، طالبة غراد أخرى.لبدء هذا الإجراء، إضافة الملح إلى دلو من الثلج. نقل الحل تشريح لهذا دلو والسماح لها بقية تحت خليط كاربوجين محتدما لمدة 20 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام. بعد ذلك، إعداد كتلة من 3٪ agarose التي هي حوالي سنتيمترين في سنتيمترين في سنتيمترين.سوبر الغراء كتلة agarose إلى قرص عينة اهتزازي من أجل خلق دعم ميكانيكي إضافي لعينة الأنسجة أثناء التقطيع. على هزاز، تعيين سمك القسم إلى 200 ميكرومتر، وتردد الاهتزاز إلى 100 هرتز، واختيار سرعة تقطيع بين 0.5 و 1.0 ملليمتر في الثانية الواحدة. ثم قفل علبة العازلة هزاز إلى قاعدة هزاز وإضافة الجليد للحفاظ على المبردة قبل تلقي الحل تشريح والعينة وطوال الإجراء تشريح.أولاً، إنشاء جهاز نقل يتكون من أسطوانة غاز محمولة تحتوي على خليط كاربوجين متصل بصمام تدفق الضغط الذي يتحكم في إنتاج الغاز المتصل بمواد السيليكون التي تربط ذلك الناتج من الغاز بسفينة النقل وسفينة النقل التي تحتوي على محلول النقل والجليد لعينة التبريد أثناء النقل. جمع ونقل العينة والنقل على النحو المبين في بروتوكول النص. نقل العينة إلى طبق بيتري التي تحتوي على حل تقطيع.باستخدام أدوات جراحية دقيقة، وإزالة بعناية أكبر قدر من السحانيات المتبقية ممكن. اختيار أفضل اتجاه عينة لإنتاج شرائح مع خصائص معينة من تصميم تجريبي واستخدام عدد 24 شفرة مشرط لتقليم سطح مستو لتكون القاعدة التي سيتم لصقها على القرص العينة. باستخدام ملعقة بلاستيكية التخلص وفرش الطلاء الحساسة، وجمع جزء من طبق بيتري وتجفيف حل الزائدة مع ورقة مرشح.بعد ذلك ، استخدم الغراء الفائق لإرفاق الأنسجة بطبق العينة الهزاز حتى يتم الالتزام به بقوة مع الطبق وعلى اتصال مع كتلة agarose. ضع قرص العينة الاهتزازية في علبة العازلة الاهتزازية. قفل حامل السكين في مكان مع شفرة الحلاقة ثابتة بحزم.إضافة حل تشريح والتأكد من أنه يغطي كلا من العينة ونصلة. ثم تبدأ تشريح العينة إلى شرائح 200 ميكرومتر. نقل شرائح من علبة العازلة إلى طبق بيتري التي تحتوي على حل تشريح وتقليم أي حواف فضفاضة و الزائدة المادة البيضاء إلى نسبة من قشرة تقريبا 70٪ و 30٪ المادة البيضاء.في مجلس الوزراء تدفق لارينار، إضافة 600 ميكرولترات من الثقافة المتوسطة لكل بئر من لوحة 24-جيدا واحتضان في 36 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 20 دقيقة على الأقل قبل طلاء الشرائح. بعد هذا، استخدم فرشاة لطلاء شريحة واحدة في كل بئر. إذا كان هناك أي آبار غير مستخدمة في لوحة، تعبئة لهم مع 400 ميكرولترات من الماء المعقم.احتضان في 36 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. تكملة 10 ملليلتر من المتوسط ثقافة أعدت سابقا مع الدماغ مشتقة عامل التغذية العصبية بتركيز 50 نانوغرام لكل ملليلتر. بعد ثماني إلى 16 ساعة، وإزالة 333 ميكرولترات من المتوسطة مكيفة من كل بئر وإضافة 133 ميكرولترات من BDNF جديدة تكمل المتوسطة.استبدل ثلث الوسط المُكيف بـ BDNF الطازجة المُكملة كل 24 ساعة. أولاً، نقل الشرائح من الآبار التي تحتوي على الاستزراع المتوسط إلى لوحة جديدة تحتوي على 24 بئراً تحتوي على برنامج تلفزيوني. إزالة برنامج تلفزيوني من كل بئر واستبداله بميليلتر واحد من 4٪ شبهformaldehyde.احتضان بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. في اليوم التالي، وإزالة بعناية شبهformaldehyde من الآبار واستبدالها مع ملليلتر واحد من محلول السكروز 30٪. احتضان في أربع درجات مئوية لمدة 48 ساعة.بعد 48 ساعة، تعيين microtome تجميد إلى درجة مئوية سلبية 40. إعداد قاعدة السكروز على مرحلة microtome حيث ينبغي وضع شرائح. بعد تجميدها تماما، وقطع بعض السكروز المجمدة لإنتاج سطح مستو الذي سيتم وضع شريحة.بعد ذلك، ضع كل شريحة على فيلم بلاستيكي ممتد واستخدم فرشاة طلاء لتسطيح الأنسجة. في خطوة واحدة، نقل شريحة امتدت إلى قاعدة السكروز المجمدة. بعد أن يستريح شريحة لمدة خمس إلى 10 دقائق لتجميد بشكل صحيح، وقطع شريحة إلى 30 أقسام ميكرومتر.نقل أقسام ميكرومتر 30 إلى طبق بيتري التي تحتوي على برنامج تلفزيوني والمضي قدما في بروتوكول الأنسجة كافية للتصميم التجريبي. عند تحديد نوعية وصحة الشرائح المستزرعة ، وهو جانب حاسم لتقييم وجود ومورفولوجيا نموذجية من أنواع الخلايا العصبية المتوقعة ، والخلايا العصبية والخلايا الدبقية. ويلاحظ أن العمارة النموذجية لل التصفيح القشري البشري في شريحة في اليوم في المختبر أربعة كشفت عن طريق المناعة العصبية.بالإضافة إلى ذلك ، لوحظ أيضا الوجود المتوقع من microglia و astroglia. هذه النتائج تثبت أن الأنسجة لا تتأثر بشكل كبير لا من قبل العملية الجراحية، وتجهيز العينة، أو الفترة القصيرة الأجل في المختبر. كما تم تحديد كمية استجابة الخلايا العصبية لتكبيد كلوريد البوتاسيوم الناجم عن ذلك في الشرائح المستزرعة باتباع فوسفوريل ERK.ومن المثير للاهتمام، وينظر إلى زيادة واضحة في الفوسفور ERK في شرائح كلوريد البوتاسيوم المعالجة في اليوم في المختبر أربعة. وأخيرا، يتم تقييم استجابة شرائح في اليوم في المختبر أربعة إلى التحدي السامة مع المعروف الإجهاد التأكسي بيروكسيد الهيدروجين. وأدى تعريض الشرائح إلى بيروكسيد الهيدروجين 300 ملليمولر لمدة 24 ساعة إلى انخفاض قوي في الحد من MTT.معا، وفاة الخلايا الضخمة لوحظت في اليوم في المختبر خمس شرائح بعد تحدي بيروكسيد الهيدروجين ونتائج إزالة القطب الناجمة عن كلوريد البوتاسيوم تشير إلى الحفاظ على الصحة العامة لشرائح في اليوم في المختبر أربعة التي تستجيب للمحفزات السامة مثل الإجهاد التأكسي. ويخصص هذا البروتوكول أساسا لدراسات تستند إلى مقايسات تستمر أكثر من أسبوع واحد مثل التحقيق في الآليات الجزيئية لإكسيالية الأعصاب والاعصاب من قبل الأدوية المرشحة. على الرغم من أن هذا البروتوكول مخصص لاستخدام الأنسجة القشرية التي تم جمعها من المرضى الذين تم تقديمهم للعلاج الجراحي من صرع الفص الصدغي المقاوم للصغرى ، فمن المرجح أن الأنسجة التي تم جمعها من مناطق الدماغ الأخرى أو الظروف يمكن أن تكون أيضًا مصادر لإنتاج ثقافات شريحة عائمة حرة.قد تكون الثقافات شريحة من الدماغ البشري الكبار المفتاح في تعزيز فهمنا للأمراض العصبية البشرية بسبب الدوائر الخلوية الفريدة والآلات الجزيئية التي تفتقر إلى شرائح تنتج من أدمغة القوارض.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

عضوي النمط الثقافات شريحة الحصين

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

على تحليل من الخليوي بركينيي علم الصرف شجيرى في الثقافات شريحة عضوي النمط

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

النسب-إعادة برمجة الخلايا المشتقة من خلية حوطية الدماغ البشري الكبار في الخلايا العصبية المستحثة

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

وتحليل وعائية عصبية إعادة عرض في Entorhino-الحصين الثقافات شريحة عضوي النمط

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Slice It Hot: Acute Adult Brain Slicing in Physiological Temperature

شريحة ساخنة: الكبار الدماغ الحاد في درجة الحرارة الفسيولوجية التقطيع

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

إعداد الثقافات الدبقية المختلطة الابتدائية من الكبار ماوس النخاع الشوكي الأنسجة

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors

الاشتقاق الثقافات السحايا الرقيقة يزدرع من تشريح الجهات المانحة الدماغ البشري

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

جيل بسيطة من ثقافة عالية الغلة المستحث الخلايا العصبية من الخلايا الليفية الجلد الكبار البشرية

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures

إعداد و Immunostaining أورجانوتيبيك ميليناتينج شريحة الدماغ الثقافات

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical ...

Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay

استهداف المجاميع ألفا سينوكلين في ألياف الأعصاب الطرفية الجلدية عن طريق اختبار المناعة العائمة الحرة

To date, for most neurodegenerative diseases only a post-mortem histopathological definitive diagnosis is available. For Parkinson&#39;s disease (PD), the ...