Name: short-term free-floating slice cultures from the adult human brain
Uploaded: 2019-11-05T13:30:00
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这项工作得到FAPESP（25681-3/2017年授予AS）、CAPES（博士后研究金PNPD/INCT-HSM到A.F.和博士前奖学金到N.D.M.）和FAEPA的支持。G.M.A. 持有 FAPESP （MS 2018/06614-4） 的硕士奖学金。N.G.C. 持有 CNPq 研究奖学金。我们感谢患者及其家属为这项研究捐赠被切除的纸巾。我们要感谢圣保罗大学里贝里奥普雷托医学院临床医院的居民、护士、技术人员和CIREP团队的支持，他们帮助参与了这一进程的各个阶段。

活成人脑组织是从接受切除神经外科治疗药理性叶癫痫的患者身上获得的（图1A）。所有程序都由里贝里诺普雷托医学院诊所医院（17578/2015）的伦理委员会批准，患者（或其法律责任人员）同意并签署了知情同意条款。组织采集工作由巴西圣保罗大学里贝里奥普雷托医学院的神经外科小组进行。
1. 材料灭菌
注：所有材料...

此协议用于生产自由浮动的短期切片培养法是培养成年人类新皮质切片的替代方法。这种切片培养方案可用于研究（但不限于）光遗传学1，44，45，电生理学2，3，4，5，短期可塑性46，47，</s...

在研究中使用人类样本无疑是研究人类大脑病理学的绝佳选择，现代技术为使用患者衍生组织进行稳健和合乎道德的实验开辟了新途径。从成人人脑制备的有机体/切片培养物等方法已越来越多地用于光遗传学1、电生理学2、3、4、5、可塑性等范式中。6，7，8，9，神经毒性/神经保护10，11，12，13，细胞治疗14，药物筛选15，16，17， 遗传学和基因编辑12，18，19，20，等等， 作为一个策略，以更好的了解成年后的神经疾病。
理解人类大脑病变背后的机制取决于需要大量的实验策略。相反，在切片培养的情况下，虽然获取人类样本仍然很困难，但从单个皮质样本中生成多达 50 个切片的可能性部分地规避了通过增加每个收集的组织复制和进行测定的数量21。
几个方案的大脑器官/切片培养已经描述，从经典的oculo拔模22，23到辊管24，25，26，半渗透膜接口27，28，29，30和自由浮动切片31，32。根据实验设计的特殊性，每种技术都有其优点和缺点。从成人大脑短期的，自由浮动的切片培养在某些情况下比Stoppini等人使用的方法27有利，如果考虑到事实，虽然长期细胞在体外生存通常是一个主要的关注，在评估一种文化方法，在许多实验中只需要很短的时间在文化需要12，31，32，33，34，35。在这些条件下，使用自由浮动培养物的优点是更简单、更具成本效益，并且比在培养中保存的切片在 2-3 周内更精确地类似于原始人体组织状况。
尽管切片培养对神经科学有潜力，但利用成人神经组织来制备这种培养物的研究仍然很少，尤其是来自人类的研究。本文介绍了一种协议，使用从活体人类捐赠者那里收集的脑组织提交到切除脑外科，准备自由浮动切片培养物。使用这些培养物维护和执行生化和细胞生物学测定的程序是详细的。该协议已被证明对分析与成年期相关的神经病变机制的生存能力和神经元功能有价值。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1571px;" width="1570">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">2-Propanol</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td style="width:344px;">1096341000</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Acrylamide/Bis-Acrylamide, 30% solution</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">A3449&#160;</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Ammonium persulfate</td>
			<td style="width:200px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">A3678-25G</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Amphotericin B</td>
			<td style="width:200px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">15290-018</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Antibody anti-ERK 2 (rabbit)</td>
			<td>Santa Cruz Biotecnology</td>
			<td>sc-154</td>
			<td>Dilution 1:1,000 in BSA 2.5%</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Antibody anti-pERK (mouse)</td>
			<td>Santa Cruz Biotecnology</td>
			<td>sc-7383</td>
			<td>Dilution 1:1,000 in BSA 2.5%</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BDNF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SRP3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">A7906</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Bradford 1x Dye Reagent</td>
			<td style="width:200px;">BioRad</td>
			<td style="width:344px;">500-0205</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">EDTA</td>
			<td style="width:200px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">T3924</td>
			<td style="width:505px;">Used in RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hank&#39;s Balanced Salts</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H1387-10X1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hepes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td style="width:344px;">1003171000</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Hydrogen Peroxide (H2O2)</td>
			<td style="width:200px;">Vetec</td>
			<td align="right" style="width:344px;">194</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (anti-mouse)</td>
			<td style="width:200px;">GE</td>
			<td style="width:344px;">NA931-1ML</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">NaCl</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td align="right" style="width:344px;">1064041000</td>
			<td style="width:505px;">Used in RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Neurobasal A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10888-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Non-fat dry milk (Molico)</td>
			<td style="width:200px;">Nestl&#233;</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">Used for membrane blocking</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">PBS Buffer pH 7,2</td>
			<td>Laborclin</td>
			<td align="right">590338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicilin/Streptomicin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:521px;">Potassium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td align="right">1049361000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:521px;">Prime Western Blotting Detection Reagent</td>
			<td style="width:200px;">GE</td>
			<td style="width:344px;">RPN2232</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit)</td>
			<td>GE</td>
			<td>NA934-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:521px;">SDS</td>
			<td style="width:200px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">L5750</td>
			<td style="width:505px;">Used in RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:521px;">TEMED</td>
			<td style="width:200px;">GE</td>
			<td style="width:344px;">17-1312-01</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Tris</td>
			<td style="width:200px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">T-1378</td>
			<td style="width:505px;">Used in RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:521px;">Triton x-100</td>
			<td style="width:200px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">X100</td>
			<td style="width:505px;">Used in RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:521px;">Ultrapure Water</td>
			<td style="width:200px;">Millipore</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">Sterile water, derived from MiliQ water purification system</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:521px;">Equipment and Material</td>
			<td style="width:200px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:50px;">24-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CL S3526</td>
			<td>Flat Bottom with Lid</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;">Amersham Potran Premium (nitrocellulose membrane)&#160;</td>
			<td>GE</td>
			<td>29047575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:521px;">Carbogen Mixture</td>
			<td style="width:200px;">White Martins</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">95% O2, 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:46px;width:521px;">CO2 incubator</td>
			<td style="width:200px;">New Brunswick Scientific</td>
			<td style="width:344px;">CO-24</td>
			<td style="width:505px;">Incubation of slices 5% CO2, 36&#186;C</td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;width:521px;">Microplate Reader</td>
			<td style="width:200px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:521px;">Microtubes</td>
			<td style="width:200px;">Greiner</td>
			<td style="width:344px;">001608</td>
			<td style="width:505px;">1,5mL microtube</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:521px;">Motorized pestle</td>
			<td style="width:200px;">Kimble Chase</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:521px;">Plastic spoon</td>
			<td style="width:200px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">Size of a dessert spoon</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:521px;">Razor Blade</td>
			<td style="width:200px;">Bic</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">Chrome Platinum, used in slicing with vibratome</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:37px;width:521px;">Scalpel Blade</td>
			<td style="width:200px;">Becton Dickinson (BD)</td>
			<td style="width:344px;">Number 24</td>
			<td style="width:505px;">Used for slicing of tissue; recommended same size or smaller</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:34px;width:521px;">Superglue (Loctite Super Bonder)</td>
			<td style="width:200px;">Henkel</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">Composition: Etilcianoacrilato; 2-Propenoic acid; 6,6&#39;-di-terc-butil-2,2&#39;-metilenodi-p-cresol; homopolymer</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;">Vibratome&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14047235612 - VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:37px;width:521px;">Name of Material/ Equipment for Immunohistochemistry</td>
			<td style="width:200px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:41px;">Antibody anti-NeuN (mouse)</td>
			<td>Millipore&#160;</td>
			<td>MAB377</td>
			<td>Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:521px;">Antibody anti-GFAP (mouse)</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td style="width:344px;">MAB360</td>
			<td>Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Antibody anti-Iba1 (rabbit)</td>
			<td style="width:200px;">Abcam</td>
			<td style="width:344px;">EPR16588 - ab178846</td>
			<td>Dilution 1:2,000 in Phosphate Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Biotinylated anti-mouse IgG Antibody (H+L)</td>
			<td style="width:200px;">Vector</td>
			<td style="width:344px;">BA-9200</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">DAB</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">D-9015</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Entellan</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td align="right" style="width:344px;">107960</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Ethanol</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td style="width:344px;">1.00983.1000</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Gelatin</td>
			<td style="width:200px;">Synth</td>
			<td style="width:344px;">00G1002.02.AE</td>
			<td style="width:505px;">Used for coating slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SM2010R</td>
			<td>Equipped with Freezing Stage (BFS-10MP, Physiotemp), set to -40&#186;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal Donkey Serum</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">158127</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit)</td>
			<td>GE</td>
			<td>NA934-1ML</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Slides (Star Frost)</td>
			<td>Knittel Glaser</td>
			<td></td>
			<td>Gelatin coated slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td style="width:200px;">Vetec</td>
			<td>60REAVET017050</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Vectastain ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard)</td>
			<td style="width:200px;">Vector</td>
			<td style="width:344px;">PK-4000, Kit Standard</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Xylene</td>
			<td style="width:200px;">Synth</td>
			<td style="width:344px;">01X1001.01.BJ</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

short-term free-floating slice cultures from the adult human brain

组织，或切片培养，已被广泛用于模拟中枢神经系统在体外功能的各个方面。尽管在神经科学中切片培养物的潜力，使用成人神经组织来制备这种培养物的研究仍然很少，尤其是那些来自人类受试者的研究。使用成人人体组织来制备切片培养物对增进人类神经病变的理解特别有吸引力，因为它们具有独特的特性，这些特性是典型的成熟人类大脑，缺乏由啮齿动物（通常是新生儿）生产的切片。神经组织。该协议描述了如何使用从活体人类捐赠者那里收集的脑组织提交到切除脑外科，以准备短期的，自由浮动的切片培养物。还介绍了使用这些培养物维护和执行生化和细胞生物学测定的程序。代表性结果表明，典型的人体皮质层压在体外4天（DIV4）后保存在切片中，预期存在主要神经细胞类型。此外，DIV4的切片在受到毒性刺激（H2O2）的挑战时会经历强细胞死亡，这表明该模型有可能成为细胞死亡检测的平台。该方法是使用膜插入物广泛使用的协议的更简单、经济有效的替代方法，主要推荐用于运行短期检测，旨在解开与年龄相关的脑疾病背后的神经退化机制。最后，虽然该协议专门用于使用从患者那里收集的皮质组织，这些患者接受药物治疗，但认为从其他大脑区域/条件收集的组织也应被视为生成类似自由浮动切片区域性的源。

评估培养切片的质量和健康的一个关键方面是预期神经细胞类型、神经元和胶质细胞的存在和典型形态。在DIV4的切片中观察到人类皮质层压的典型结构，通过神经元免疫标记（图2D）显示。此外，还观察到了微胶质和星体的预期存在（图2B，C）。这些结果表明，组织结构没有受到外科手术/样品处理或体外短期期的显著影响。?...

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Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain

提出了一种从成人大脑中制备自由浮动切片培养物的协议。该协议是使用膜插入物广泛使用的切片培养方法的变体。它简单，经济高效，建议进行短期检测，旨在解开与年龄相关的脑疾病背后的神经退化机制。

来自成人大脑的短期自由浮动切片培养

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of ...

我们提出了一个方案，准备从活的人类捐赠者那里收集的脑组织中自由浮动的切片培养物，用于恢复脑手术。这种培养可进行生化和细胞生物学测定或免疫组织化学。它有望有助于阐明相关脑部疾病中神经退化的机理。该技术的主要优点是，它是使用膜插入的经典切片培养协议更简单、更具成本效益的替代方案。虽然整体协议并不复杂，但一些步骤，如去除脑膜，将组织粘合到振动组标本盘，以及免疫组织化学的切除，在视觉上演示时，最好了解。帮助演示这个程序的将是尼勒·门德斯和格劳西亚·阿尔梅迪亚是研究生，另一位研究生乔凡娜·诺盖拉。要开始此过程，请向一桶冰中添加盐。将切片溶液转移到此铲斗中，让它在碳化物混合物下休息至少 20 分钟，然后使用。接下来，准备一块3%的加糖，大约两厘米，两厘米，两厘米。将阿加罗斯块超级粘附到振动组试样盘上，以便在切片过程中为组织样品创建额外的机械支撑。在振动器上，将截面厚度设置为 200 微米，将振动频率设置为 100 赫兹，并选择 0.5 至 1.0 毫米/秒的切片速度。然后将振动器缓冲盘锁定到振动组底部，并添加冰，在接收切片溶液和样品之前以及在整个切片过程中将其冷藏。首先，设置一个运输装置，由一个便携式气瓶组成，其中包含一个碳化物混合物，该气瓶与压力通量阀相连，控制连接到硅胶管的气体输出，该油管将气体输出连接到运输容器和运输容器，该容器包含运输溶液和运输过程中用于样品冷却的冰。收集和运输标本和运输，如文本协议中所述。将试样转移到含有切片溶液的培养皿中。使用精细的手术工具，小心地去除尽可能多的剩余毛细。选择具有实验设计特殊特性的切片的最佳试样方向，并使用编号 24 手术刀刀片修剪平坦表面，作为将粘附在试样盘上的底座。使用处置塑料勺子和精致的画笔，从培养皿中收集碎片，然后用滤纸擦干多余的溶液。接下来，使用超级胶水将组织附着在振动器试盘上，直到它牢牢地粘在培养皿上，并接触阿加罗斯块。将振动器试样盘放入振动器缓冲盘中。用剃刀刀片牢固地固定，将刀架锁定到位。添加切片溶液，并确保它覆盖试样和刀片。然后开始将试样切成200微米切片。将切片从缓冲盘转移到含有切片溶液的培养皿中，并修剪任何松散的边缘和多余的白物质，以大约 70%皮层和 30% 白物质的比例。在层流柜中，在24井板的每个井中加入600微升培养基，并在36摄氏度下孵育，在电镀切片前至少20分钟用5%的二氧化碳孵育。在此之后，使用画笔在每个井中镀一片。如果盘子里有任何未使用的水井，请用400微升无菌水填充。在36摄氏度下孵育，二氧化碳含量为5%。补充10毫升先前准备的培养基与大脑衍生的神经营养因子，浓度为每毫升50毫微克。8 至 16 小时后，从每井中去除 333 微升的调节介质，并添加 133 微升新鲜 BDNF 补充介质。每24小时用新鲜的BDNF补充介质更换三分之一的调节介质。首先，将切片从含有培养介质的井转移到新的含有PBS的24孔板。从每一个井中去除PBS，代之以1毫升4%的甲醛。在摄氏四度下孵育过夜。第二天，小心地从井中去除甲状甲醛，代之以一毫升30%蔗糖溶液。在4摄氏度下孵育48小时。48小时后，将冷冻微原子设置为负40摄氏度。在应放置切片的微原子阶段准备蔗糖基座。完全冷冻后，切开一些冷冻蔗糖，以产生一个平面，将切片放置在该表面。接下来，将每片片放在拉伸的塑料薄膜上，用画笔将组织压平。在一次移动中，将拉伸切片转移到冷冻蔗糖基座。切片休息5至10分钟后，正确冷冻，将切片切成30微米部分。将 30 微米部分转移到含有 PBS 的培养皿中，然后执行足以进行实验设计的组织学方案。在确定培养切片的质量和运行状况时，要评估的一个关键方面是预期神经细胞类型、神经元和胶质细胞的存在和典型形态。人体皮质层压的典型结构在体外四天通过神经元免疫标记揭示的切片中观察到。此外，还观察到微胶质和天文胶质的预期存在。这些结果表明，组织结构不受外科手术、样品处理或体外短期时间的影响。对氯化钾引起的去极化的神经元反应也通过遵循ERK磷酸化在培养片中量化。有趣的是，ERK磷酸化明显增加，在体外四天的氯化钾处理切片中。最后，用已知的氧化应激诱导剂过氧化氢评估了天体外四片对毒性挑战的反应。将切片暴露在 300 毫摩尔过氧化氢 24 小时，导致 MTT 减少的显著减少。综合起来，在过氧化氢挑战后，在体外五片中观察到的日体中大量细胞死亡和氯化钾引起的去极化结果表明，在体外四天的切片保持了总体健康，这些切片对氧化应激等毒性刺激有反应。该协议主要致力于基于持续一周多的测定的研究，如研究候选药物的神经毒性和神经保护的分子机制。虽然该协议致力于使用从患者中收集的皮质组织，用于微抗性叶癫痫的手术治疗，但很可能从其他脑区或条件收集的组织也可以成为产生自由浮动切片培养物的来源。成人人脑的切片培养可能是促进我们了解人类神经病理学的关键，因为他们独特的细胞电路和分子机械缺乏由啮齿动物大脑产生的切片。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

器官型海马切片培养

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

科研

神经科学

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

浦肯野细胞树突形态的器官切片培养分析

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

谱系重编程的成人大脑的周细胞源性细胞诱导成神经细胞

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

神经血管重塑的分析Entorhino，海马脑切片培养

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Slice It Hot: Acute Adult Brain Slicing in Physiological Temperature

切片热门：成人急性脑切片在生理温度

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

第一次混合胶质细胞培养的成年小鼠脊髓组织准备

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors

从尸检人脑软脑膜捐助外植体培养的推导

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

人类成人皮肤成纤维细胞诱导神经元高产培养的简单生成

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures

髓鞘有机小脑片培养的制备及免疫染色

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical ...

Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay

通过自由浮动免疫荧光测定,在皮外神经纤维中定位阿尔法核糖核酸聚合体

To date, for most neurodegenerative diseases only a post-mortem histopathological definitive diagnosis is available. For Parkinson&#39;s disease (PD), the ...