Name: short-term free-floating slice cultures from the adult human brain
Uploaded: 2019-11-05T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain at JoVE.com

Dette arbejde understøttes af FAPESP (Grant 25681-3/2017 to AS), CAPES (post-doktor Fellowship PNPD/INCT-HSM til A.F. og præ-doktor stipendiat til N.D.M.) og FAEPA. G.M.A. har en Master's Fellowship fra FAPESP (MS 2018/06614-4). N.G.C. besidder et CNPq Research Fellowship. Vi takker patienterne og deres familier for at donere det viderekomne væv til denne undersøgelse. Vi vil gerne anerkende støtte fra beboere, sygeplejersker, teknikere og CIREP team, fra det kliniske Hospital på Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, der hjalp i forskellige stadier af processen.

Levende voksne hjernevæv blev opnået fra patienter, der gennemgik reektiv Neurokirurgi til behandling af farmakoresistant temporale lobe epilepsi (figur 1A). Alle procedurer blev godkendt af den etiske komité fra klinikker Hospital på Ribeirão Preto Medical School (17578/2015), og patienter (eller deres juridiske ansvarlige person) aftalt og underskrevet informeret samtykke vilkår. Indsamlingen af vævet blev udført af neuro kirurgi team på epilepsi kirurgi Center (C...

Denne protokol til produktion af fritflydende, kortvarige skive kulturer er en alternativ metode til dyrkning af voksne menneskelige neortikale skiver. En sådan protokol for skive kulturer kan være modtagelig for undersøgelser af (men ikke begrænset til) optogenetik1,44,45, Elektrofysiologi2,3,4,5 ...

Brugen af humane prøver i forskning er utvetydigt en stor mulighed for at studere menneskelige hjerne patologier, og moderne teknikker har åbnet nye måder for robuste og etiske eksperimenter ved hjælp af patient-afledte væv. Metoder som organotypic/skive kulturer fremstillet af voksne menneskelige hjerne er blevet mere og mere anvendt i paradigmer såsom optogenetik1, Elektrofysiologi2,3,4,5, plasticitet 6,7,8,9, neurotoksicitet/neuroprotection10,11,12,13, celleterapi14, Drug screening15,16,17, genetik og genredigering12,18,19,20, blandt andre, som en strategi for bedre at forstå neurologiske sygdomme i voksenalderen.
Forståelsen af mekanismer underliggende menneskelige hjerne patologier afhænger af eksperimentelle strategier, der kræver et stort antal emner. Omvendt, i tilfælde af skive kulturer, selv om adgang til humane prøver stadig er vanskelig, muligheden for at generere op til 50 skiver fra en enkelt kortikal prøve delvist omgår kravet om rekruttering af flere frivillige ved at øge antal replikater og udførte assays pr. indsamlet væv21.
Flere protokoller for hjernen organotypic/skive kulturer er blevet beskrevet, spænder fra den klassiske oculo udkast22,23 til rullerør24,25,26, semi-permeable membraner grænseflade27,28,29,30og fritflydende udsnit31,32. Afhængigt af de særlige forhold i et eksperimentelt design, hver teknik har sine egne fordele og ulemper. Kortvarige, fritflydende skiver kulturer fra voksne menneskelige hjerner er i nogle tilfælde fordelagtige over den metode, der anvendes af Stoppini et al.27, hvis man tager i betragtning, at selv om langvarig celle overlevelse in vitro normalt er et stort problem, når man evaluerer en kultur metode, i mange eksperimenter kun korte perioder af tid i kulturen er nødvendige12,31,32,33,34,35. Under disse betingelser, brugen af fritflydende kulturer præsenterer fordelen ved at være enklere og mere omkostningseffektiv, samt mere præcist ligner den oprindelige menneskelige væv tilstand end skiver holdes i kulturen over 2-3 uger.
På trods af potentialet i Skive kulturer til neurovidenskab, er undersøgelser ved hjælp af voksne nervevæv til at forberede sådanne kulturer stadig knappe, især fra menneskelige. Denne artikel beskriver en protokol til at bruge indsamlede hjernevæv fra levende menneskelige donorer indsendt til resective hjernekirurgi til at forberede fritflydende skive kulturer. Procedurer til at vedligeholde og udføre biokemiske og cellebiologi assays ved hjælp af disse kulturer er detaljerede. Denne protokol er blevet bevist værdifuld for at analysere levedygtighed og neuronal funktion i undersøgelser af mekanismerne i neuropatiologier knyttet til voksenalderen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1571px;" width="1570">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">2-Propanol</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td style="width:344px;">1096341000</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Acrylamide/Bis-Acrylamide, 30% solution</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">A3449&#160;</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Ammonium persulfate</td>
			<td style="width:200px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">A3678-25G</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Amphotericin B</td>
			<td style="width:200px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">15290-018</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Antibody anti-ERK 2 (rabbit)</td>
			<td>Santa Cruz Biotecnology</td>
			<td>sc-154</td>
			<td>Dilution 1:1,000 in BSA 2.5%</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Antibody anti-pERK (mouse)</td>
			<td>Santa Cruz Biotecnology</td>
			<td>sc-7383</td>
			<td>Dilution 1:1,000 in BSA 2.5%</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BDNF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SRP3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">A7906</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Bradford 1x Dye Reagent</td>
			<td style="width:200px;">BioRad</td>
			<td style="width:344px;">500-0205</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">EDTA</td>
			<td style="width:200px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">T3924</td>
			<td style="width:505px;">Used in RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hank&#39;s Balanced Salts</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H1387-10X1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hepes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td style="width:344px;">1003171000</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Hydrogen Peroxide (H2O2)</td>
			<td style="width:200px;">Vetec</td>
			<td align="right" style="width:344px;">194</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (anti-mouse)</td>
			<td style="width:200px;">GE</td>
			<td style="width:344px;">NA931-1ML</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">NaCl</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td align="right" style="width:344px;">1064041000</td>
			<td style="width:505px;">Used in RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Neurobasal A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10888-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Non-fat dry milk (Molico)</td>
			<td style="width:200px;">Nestl&#233;</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">Used for membrane blocking</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">PBS Buffer pH 7,2</td>
			<td>Laborclin</td>
			<td align="right">590338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicilin/Streptomicin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:521px;">Potassium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td align="right">1049361000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:521px;">Prime Western Blotting Detection Reagent</td>
			<td style="width:200px;">GE</td>
			<td style="width:344px;">RPN2232</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit)</td>
			<td>GE</td>
			<td>NA934-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:521px;">SDS</td>
			<td style="width:200px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">L5750</td>
			<td style="width:505px;">Used in RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:521px;">TEMED</td>
			<td style="width:200px;">GE</td>
			<td style="width:344px;">17-1312-01</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Tris</td>
			<td style="width:200px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">T-1378</td>
			<td style="width:505px;">Used in RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:521px;">Triton x-100</td>
			<td style="width:200px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">X100</td>
			<td style="width:505px;">Used in RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:521px;">Ultrapure Water</td>
			<td style="width:200px;">Millipore</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">Sterile water, derived from MiliQ water purification system</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:521px;">Equipment and Material</td>
			<td style="width:200px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:50px;">24-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CL S3526</td>
			<td>Flat Bottom with Lid</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;">Amersham Potran Premium (nitrocellulose membrane)&#160;</td>
			<td>GE</td>
			<td>29047575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:521px;">Carbogen Mixture</td>
			<td style="width:200px;">White Martins</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">95% O2, 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:46px;width:521px;">CO2 incubator</td>
			<td style="width:200px;">New Brunswick Scientific</td>
			<td style="width:344px;">CO-24</td>
			<td style="width:505px;">Incubation of slices 5% CO2, 36&#186;C</td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;width:521px;">Microplate Reader</td>
			<td style="width:200px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:521px;">Microtubes</td>
			<td style="width:200px;">Greiner</td>
			<td style="width:344px;">001608</td>
			<td style="width:505px;">1,5mL microtube</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:521px;">Motorized pestle</td>
			<td style="width:200px;">Kimble Chase</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:521px;">Plastic spoon</td>
			<td style="width:200px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">Size of a dessert spoon</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:521px;">Razor Blade</td>
			<td style="width:200px;">Bic</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">Chrome Platinum, used in slicing with vibratome</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:37px;width:521px;">Scalpel Blade</td>
			<td style="width:200px;">Becton Dickinson (BD)</td>
			<td style="width:344px;">Number 24</td>
			<td style="width:505px;">Used for slicing of tissue; recommended same size or smaller</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:34px;width:521px;">Superglue (Loctite Super Bonder)</td>
			<td style="width:200px;">Henkel</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">Composition: Etilcianoacrilato; 2-Propenoic acid; 6,6&#39;-di-terc-butil-2,2&#39;-metilenodi-p-cresol; homopolymer</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;">Vibratome&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14047235612 - VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:37px;width:521px;">Name of Material/ Equipment for Immunohistochemistry</td>
			<td style="width:200px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:41px;">Antibody anti-NeuN (mouse)</td>
			<td>Millipore&#160;</td>
			<td>MAB377</td>
			<td>Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:521px;">Antibody anti-GFAP (mouse)</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td style="width:344px;">MAB360</td>
			<td>Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Antibody anti-Iba1 (rabbit)</td>
			<td style="width:200px;">Abcam</td>
			<td style="width:344px;">EPR16588 - ab178846</td>
			<td>Dilution 1:2,000 in Phosphate Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Biotinylated anti-mouse IgG Antibody (H+L)</td>
			<td style="width:200px;">Vector</td>
			<td style="width:344px;">BA-9200</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">DAB</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">D-9015</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Entellan</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td align="right" style="width:344px;">107960</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Ethanol</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td style="width:344px;">1.00983.1000</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Gelatin</td>
			<td style="width:200px;">Synth</td>
			<td style="width:344px;">00G1002.02.AE</td>
			<td style="width:505px;">Used for coating slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SM2010R</td>
			<td>Equipped with Freezing Stage (BFS-10MP, Physiotemp), set to -40&#186;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal Donkey Serum</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">158127</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit)</td>
			<td>GE</td>
			<td>NA934-1ML</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Slides (Star Frost)</td>
			<td>Knittel Glaser</td>
			<td></td>
			<td>Gelatin coated slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td style="width:200px;">Vetec</td>
			<td>60REAVET017050</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Vectastain ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard)</td>
			<td style="width:200px;">Vector</td>
			<td style="width:344px;">PK-4000, Kit Standard</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Xylene</td>
			<td style="width:200px;">Synth</td>
			<td style="width:344px;">01X1001.01.BJ</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

short-term free-floating slice cultures from the adult human brain

Organotypiske, eller skive kulturer, er blevet bredt anvendt til at modellere aspekter af det centrale nervesystem fungerer in vitro. På trods af potentialet i Skive kulturer i neurovidenskab, undersøgelser ved hjælp af voksne nervevæv til at forberede sådanne kulturer er stadig knappe, især dem fra menneskelige. Brugen af voksne menneskelige væv til at forberede skive kulturer er særligt attraktivt at forbedre forståelsen af humane neuropatiologier, da de har unikke egenskaber typisk for den modne menneskelige hjerne mangler i skiver fremstillet af gnaver (normalt neonatal) nervevæv. Denne protokol beskriver, hvordan man bruger hjernevæv indsamlet fra levende menneskelige donorer indsendt til resective hjernekirurgi til at forberede kortsigtede, fritflydende skive kulturer. Procedurer til at vedligeholde og udføre biokemiske og cellebiologi assays ved hjælp af disse kulturer er også præsenteret. Repræsentative resultater viser, at den typiske humane kortikale laminering bevares i skiver efter 4 dage in vitro (DIV4), med forventet tilstedeværelse af de vigtigste neurale celletyper. Desuden, skiver på DIV4 undergår robust celledød, når udfordret med en giftig stimulus (H2O2), hvilket indikerer potentialet i denne model til at fungere som en platform i celledød assays. Denne metode, et enklere og omkostningseffektivt alternativ til den udbredte protokol ved hjælp af membran skær, anbefales primært til at kørekort varige assays, der har til formål at opklare mekanismer af neurodegeneration bag aldersrelaterede hjernesygdomme. Endelig, selv om protokollen er afsat til anvendelse af kortikale væv indsamlet fra patienter indsendt til kirurgisk behandling af farmakoresistant temporale lobe epilepsi, det hævdes, at væv indsamlet fra andre hjerneregioner/betingelser bør også være betragtes som kilder til at producere lignende fritflydende udsnit kulturer.

Et kritisk aspekt for at evaluere kvaliteten og sundheden af dyrkede skiver er tilstedeværelsen og typiske morfologi af de forventede neurale celletyper, neuroner, og gliaceller celler. Den typiske arkitektur af den menneskelige kortikale laminering blev observeret i en skive på DIV4, afsløret af neuronal immunolabeling (figur 2D). Desuden blev den forventede tilstedeværelse af microglia og astroglia (figur 2B, C) også obse...

Watch this Scientific Journal Video about Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain at JoVE.com

Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain

En protokol til at forberede fritflydende skive kulturer fra voksne menneskelige hjerne er præsenteret. Protokollen er en variation af den udbredte skive kultur metode ved hjælp af membran skær. Det er simpelt, omkostningseffektivt, og anbefales til at kørekort sigtede assays sigter mod at opklare mekanismer af neurodegeneration bag aldersrelaterede hjernesygdomme.

Kortsigtede fritflydende udsnit kulturer fra den voksne menneskelige hjerne

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of ...

Vi præsenterer en protokol til at forberede fritflydende skive kulturer fra hjernevæv indsamlet fra levende menneskelige donorer forelagt resective hjernekirurgi. Denne kultur er modtagelig for at udføre biokemiske og cellebiologi assays eller immunohistochemistry. Det forventes at bidrage til belysningen af den mekanisme, der ligger til grund for neurodegeneration i tilknyttede hjernesygdomme.Den største fordel ved denne teknik er, at det er et enklere og omkostningseffektivt alternativ til den klassiske skive kultur protokol ved hjælp af membran skær. Selv om den overordnede protokol ikke er kompleks, forstås nogle trin såsom fjernelse af meninges, limning af vævet til vibratome prøvedisken og resektion for immunhistokkemi bedst, når det demonstreres visuelt. Bidrage til at demonstrere proceduren vil være Niele Mendes og Glaucia Almedia, der er grad studerende, og Giovanna Nogueira, en anden grad studerende.For at begynde denne procedure, tilsæt salt til en spand is. Overfør udskæringsopløsningen til denne spand, og lad den hvile under carbogen-blandingen, der bobler i mindst 20 minutter før brug. Dernæst forberede en blok på 3% agarose, der er omkring to centimeter med to centimeter med to centimeter.Super lim agaroseblokken til vibratome prøveskiven for at skabe yderligere mekanisk støtte til vævsprøven under udskæringen. På vibratome, indstille afsnittet tykkelse til 200 mikrometer, vibration frekvens til 100 hertz, og vælg en udskæring hastighed mellem 0,5 og 1,0 millimeter per sekund. Lås derefter vibratombufferbakken til vibratombunden, og tilsæt is for at holde den nedkølet, før du modtager udskæringsopløsningen og prøven og under hele udskæringsproceduren.Først skal der oprettes et transportapparat, der består af en bærbar gasflaske, der indeholder en carbogen-blanding, der er forbundet med en trykffluxventil, der styrer den gasudgang, der er forbundet med silikonerør, der forbinder gasproduktionen med transportfartøjet og det transportfartøj, der indeholder transportløsningen og isen til prøvekøling under transport. Indsaml og transporter prøven og transporten som beskrevet i tekstprotokollen. Prøven overføres til en petriskål indeholdende snitopløsning.Ved hjælp af fine kirurgiske værktøjer, omhyggeligt fjerne så meget af de resterende meninges som muligt. Vælg den bedste prøveretning til fremstilling af skiver med de særlige karakteristika ved forsøgsdesignet, og brug en skalpelklinge nummer 24 til at trimme en flad overflade, der skal være den base, der limes til prøveskiven. Ved hjælp af en bortskaffelse plastske og sarte pensler, indsamle fragmentet fra Petriskålen og tørre overskydende opløsning med filterpapir.Brug derefter superlim til at fastgøre vævet til vibratomprøveskålen, indtil den er fast til bunds i skålen og i kontakt med agaroseblokken. Anbring vibratomprøveskiven i vibratombufferbakken. Lås knivholderen på plads med barberbladet solidt fastgjort.Der tilsættes snitopløsning, og sørg for, at den dækker både prøven og klingen. Begynd derefter at skære prøven i 200 mikrometerskiver. Overfør skiverne fra bufferbakken til en petriskål, der indeholder udskæringsopløsning, og trim eventuelle løse kanter og overskydende hvidt stof til en andel på ca. 70 % cortex og 30 % hvidt stof.I et laminar flow kabinet, tilsæt 600 mikroliter af kultur medium til hver brønd af en 24-brønd plade og inkubere ved 36 grader Celsius med 5% kuldioxid i mindst 20 minutter før plating skiverne. Efter dette, skal du bruge en pensel til plade en skive i hver brønd. Hvis der er ubrugte brønde i pladen, fyldes de med 400 mikroliter sterilt vand.Inkubere ved 36 grader Celsius med 5% kuldioxid. Supplere 10 milliliter af den tidligere forberedte kultur medium med hjernen afledt neurotrofisk faktor ved en koncentration på 50 nanogram per milliliter. Efter otte til 16 timer fjernes 333 mikroliter af det konditionerede medium fra hver brønd og tilsættes 133 mikroliter frisk BDNF suppleret medium.Udskift en tredjedel af det betingede medium med frisk BDNF suppleret medium hver 24 timer. Først overføres skiverne fra brøndene, der indeholder kulturmedium, til en ny 24-brøndplade, der indeholder PBS. Fjern PBS fra hver brønd og erstatte det med en milliliter 4% paraformaldehyd.Inkuber natten over ved fire grader Celsius. Den næste dag fjernes paraformaldehyderne forsigtigt fra brøndene og udskiftes med en milliliter 30% saccharoseopløsning. Inkubere ved fire grader Celsius i 48 timer.Efter 48 timer indstilles frysemikrotomen til negative 40 grader Celsius. Forbered en saccharose base på mikrotome fase, hvor skiverne skal placeres. Når det er frosset helt, skæres nogle af de frosne saccharose for at producere en flad overflade, hvorpå skiven vil blive placeret.Dernæst placere hver skive over en strakt plastfolie og bruge en pensel til at flade vævet. I et enkelt træk overføres den strakte skive til den frosne saccharosebase. Når skiven har hvilet i fem til 10 minutter for at fryse ordentligt, skæres skiven i 30 mikrometersektioner.De 30 mikrometersektioner overføres til en petriskål, der indeholder PBS, og videre til en histologiprotokol, der er tilstrækkelig til forsøgsdesignet. Ved bestemmelse af kvaliteten og sundheden af dyrkede skiver, et kritisk aspekt at vurdere, er tilstedeværelsen og den typiske morfologi af de forventede neurale celletyper, neuroner og gliaceller. Den typiske arkitektur af den menneskelige kortikale laminering er observeret i en skive på dag in vitro fire afsløret ved neuronal immunmærkning.Desuden observeres den forventede tilstedeværelse af mikroglia og astroglia. Disse resultater viser, at vævsarkitektur ikke påvirkes væsentligt af hverken den kirurgiske procedure, prøvebehandlingen eller af den kortsigtede periode in vitro. Den neuronale respons på kaliumchlorid-induceret depolarisering er også blevet kvantificeret i dyrkede skiver ved at følge ERK fosforylering.Interessant, en klar stigning i ERK fosforylering ses i kaliumchlorid-behandlede skiver på dag in vitro fire. Endelig evalueres reaktionen fra skiver på dag in vitro fire på en giftig udfordring med en kendt oxidativ stressanter hydrogenperoxid. At udsætte skiverne for 300 millimolar hydrogenperoxid i 24 timer førte til et robust fald i MTT-reduktionen.Samlet set viser den massive celledød, der blev observeret i dag in vitro fem skiver efter hydrogenperoxidudfordringen og de kaliumchloridinducerede depolariseringsresultater, den bevarede generelle sundhed af skiver på dag in vitro fire, som reagerer på en giftig stimulus såsom oxidativstress. Denne protokol er primært afsat til undersøgelser baseret på analyser varer end en uge, såsom undersøgelse af molekylære mekanismer af neurotoksicitet og neuroprotection af kandidat narkotika. Selv om denne protokol er afsat til brug af kortikale væv indsamlet fra patienter indsendt til kirurgisk behandling for mikroresistent temporal lap epilepsi, er det sandsynligt, at væv indsamlet fra andre hjerneregioner eller betingelser også kunne være kilder til at producere fritflydende skive kulturer.Slice kulturer fra voksne menneskelige hjerne kan være nøglen til at fremme vores forståelse af menneskelige neuropatologier på grund af deres unikke cellulære kredsløb og molekylære maskiner mangler i skiver fremstillet af gnaver hjerner.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Lineage-omprogrammering af pericyt-afledte Celler af Voksen Menneskelige hjerne til Inducerede Neuroner

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Analysen af ​​neurovaskulære Remodeling i Entorhino-hippocampus organotypisk skivekulturer

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Slice It Hot: Acute Adult Brain Slicing in Physiological Temperature

Slice It Hot: Akut voksne hjerne Slicing i fysiologisk temperatur

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

Udarbejdelse af Primære Mixed Glia kulturer fra Voksen Mouse Spinal Cord Tissue

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors

Udledning af leptomeninges eksplantatkulturer fra Postmortem menneskehjerne donorer

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

Simpel Generation af højtydende kultur af inducerede neuroner fra menneskelige voksen hud fibroblaster

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures

Forberedelse og immunfarvning af Myelinating Organotypic cerebellare skive kulturer

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical ...

Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay

Målretning Alpha Synuclein aggregater i kutane perifer nerve fibre af Free-flydende immunofluorescens analyse

To date, for most neurodegenerative diseases only a post-mortem histopathological definitive diagnosis is available. For Parkinson&#39;s disease (PD), the ...