Name: short-term free-floating slice cultures from the adult human brain
Uploaded: 2019-11-05T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain at JoVE.com

Dit werk wordt ondersteund door FAPESP (Grant 25681-3/2017 to AS), CAPES (post-doctoraats Fellowship PNPD/INCT-HSM naar A.F. en pre-Doctoral Fellowship to N.D.M.) en FAEPA. G.M.A. bezit een Master Fellowship van FAPESP (MS 2018/06614-4). N.G.C. bezit een CNPq Research Fellowship. We danken de patiënten en hun families voor het doneren van de door de weefsels voor dit onderzoek. We willen de steun van bewoners, verpleegkundigen, technici en het CIREP-team erkennen, van het klinisch ziekenhuis van de medische school van Ribeirão Preto, de Universiteit van São Paulo, die in verschillende stadia van het proces heeft geholpen.

Levende volwassen hersenweefsels werden verkregen van patiënten die resectieve Neurochirurgie ondergingen voor de behandeling van pharmacoresistant temporale kwal epilepsie (Figuur 1A). Alle procedures werden goedgekeurd door de ethische commissie van het klinieken ziekenhuis op de medische school Ribeirão Preto (17578/2015), en patiënten (of hun juridisch verantwoordelijke persoon) spraken de voorwaarden voor geïnformeerde toestemming af en ondertekenden deze. De verzam...

Dit protocol voor het produceren van vrij zwevende, korte-termijn segment culturen is een alternatieve methode voor het kweken van volwassen menselijke neocorticale schijfjes. Een dergelijk protocol voor segment culturen kan vatbaar zijn voor studies over (maar niet beperkt tot) optogenetica1,44,45, elektrofysiologie2,3,4,<su...

Het gebruik van menselijke monsters in onderzoek is ondubbelzinnig een geweldige optie om menselijke hersen pathologieën te bestuderen, en moderne technieken hebben nieuwe manieren geopend voor robuuste en ethische experimenten met behulp van door de patiënt afgeleid weefsel. Methoden zoals organotypic/slice culturen bereid uit volwassen menselijk brein zijn steeds vaker gebruikt in paradigma's zoals optogenetica1, elektrofysiologie2,3,4,5, plasticiteit 6,7,8,9, neurotoxiciteit/neuroprotectie10,11,12,13, celtherapie14, screening van geneesmiddelen15,16,17, genetica en genbewerken12,18,19,20, onder andere, als een strategie voor betere het begrijpen van neurologische aandoeningen tijdens de volwassenheid.
Het begrip van mechanismen die ten grondslag liggen aan menselijke hersen pathologieën is afhankelijk van experimentele strategieën die een groot aantal onderwerpen vereisen. Omgekeerd is, in het geval van segment culturen, hoewel de toegang tot menselijke monsters nog steeds moeilijk is, de mogelijkheid om tot 50 schijfjes uit één enkel corticale monster te genereren gedeeltelijk de eis van het werven van meerdere vrijwilligers door het verhogen van de aantal replicaten en uitgevoerde assays per verzameld weefsel21.
Verschillende protocollen voor organotypische/segment culturen van de hersenen zijn beschreven, variërend van de klassieke Franceschetti-concepten22,23 tot de rolbuis24,25,26, semi-permeabele membranen interface27,28,29,30en vrij zwevende segmenten31,32. Afhankelijk van de bijzonderheden van een experimenteel ontwerp, heeft elke techniek zijn eigen voor-en nadelen. Op korte termijn, vrij zwevende segmenten culturen van volwassen menselijke hersenen is in sommige gevallen voordelig over de methode die wordt gebruikt door Stoppini et al.27, indien rekening houdend met het feit dat, hoewel lange termijn cel overleving in vitro is meestal een belangrijke zorg bij het evalueren van een cultuur methode, in veel experimenten slechts korte perioden in cultuur zijn nodig12,31,32,33,34,35. Onder deze omstandigheden presenteert het gebruik van vrij zwevende culturen het voordeel dat het eenvoudiger en kosteneffectiever is, en dat het nauwkeuriger lijkt op de oorspronkelijke menselijke weefsel aandoening dan op plakjes die gedurende 2-3 weken in cultuur worden gehouden.
Ondanks het potentieel van segment culturen aan de neurowetenschappen, zijn studies die gebruik maken van volwassen zenuwweefsel om dergelijke culturen voor te bereiden nog schaars, met name van menselijke proefpersonen. Dit artikel beschrijft een protocol voor het gebruik van verzamelde hersenweefsel van levende menselijke donoren ingediend bij recidiverend hersenchirurgie om vrij zwevende segment culturen te bereiden. Procedures voor het onderhouden en uitvoeren van biochemische en celbiologie testen met behulp van deze culturen zijn gedetailleerd. Dit protocol is bewezen waardevol voor het analyseren van de levensvatbaarheid en neuronale functie in onderzoeken naar de mechanismen van neuro pathologieën die verband houden met de volwassenheid.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1571px;" width="1570">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">2-Propanol</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td style="width:344px;">1096341000</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Acrylamide/Bis-Acrylamide, 30% solution</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">A3449&#160;</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Ammonium persulfate</td>
			<td style="width:200px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">A3678-25G</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Amphotericin B</td>
			<td style="width:200px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">15290-018</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Antibody anti-ERK 2 (rabbit)</td>
			<td>Santa Cruz Biotecnology</td>
			<td>sc-154</td>
			<td>Dilution 1:1,000 in BSA 2.5%</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Antibody anti-pERK (mouse)</td>
			<td>Santa Cruz Biotecnology</td>
			<td>sc-7383</td>
			<td>Dilution 1:1,000 in BSA 2.5%</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BDNF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SRP3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">A7906</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Bradford 1x Dye Reagent</td>
			<td style="width:200px;">BioRad</td>
			<td style="width:344px;">500-0205</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">EDTA</td>
			<td style="width:200px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">T3924</td>
			<td style="width:505px;">Used in RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hank&#39;s Balanced Salts</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H1387-10X1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hepes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td style="width:344px;">1003171000</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Hydrogen Peroxide (H2O2)</td>
			<td style="width:200px;">Vetec</td>
			<td align="right" style="width:344px;">194</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (anti-mouse)</td>
			<td style="width:200px;">GE</td>
			<td style="width:344px;">NA931-1ML</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">NaCl</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td align="right" style="width:344px;">1064041000</td>
			<td style="width:505px;">Used in RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Neurobasal A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10888-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Non-fat dry milk (Molico)</td>
			<td style="width:200px;">Nestl&#233;</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">Used for membrane blocking</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">PBS Buffer pH 7,2</td>
			<td>Laborclin</td>
			<td align="right">590338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicilin/Streptomicin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:521px;">Potassium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td align="right">1049361000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:521px;">Prime Western Blotting Detection Reagent</td>
			<td style="width:200px;">GE</td>
			<td style="width:344px;">RPN2232</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit)</td>
			<td>GE</td>
			<td>NA934-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:521px;">SDS</td>
			<td style="width:200px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">L5750</td>
			<td style="width:505px;">Used in RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:521px;">TEMED</td>
			<td style="width:200px;">GE</td>
			<td style="width:344px;">17-1312-01</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Tris</td>
			<td style="width:200px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">T-1378</td>
			<td style="width:505px;">Used in RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:521px;">Triton x-100</td>
			<td style="width:200px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">X100</td>
			<td style="width:505px;">Used in RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:521px;">Ultrapure Water</td>
			<td style="width:200px;">Millipore</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">Sterile water, derived from MiliQ water purification system</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:521px;">Equipment and Material</td>
			<td style="width:200px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:50px;">24-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CL S3526</td>
			<td>Flat Bottom with Lid</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;">Amersham Potran Premium (nitrocellulose membrane)&#160;</td>
			<td>GE</td>
			<td>29047575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:521px;">Carbogen Mixture</td>
			<td style="width:200px;">White Martins</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">95% O2, 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:46px;width:521px;">CO2 incubator</td>
			<td style="width:200px;">New Brunswick Scientific</td>
			<td style="width:344px;">CO-24</td>
			<td style="width:505px;">Incubation of slices 5% CO2, 36&#186;C</td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;width:521px;">Microplate Reader</td>
			<td style="width:200px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:521px;">Microtubes</td>
			<td style="width:200px;">Greiner</td>
			<td style="width:344px;">001608</td>
			<td style="width:505px;">1,5mL microtube</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:521px;">Motorized pestle</td>
			<td style="width:200px;">Kimble Chase</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:521px;">Plastic spoon</td>
			<td style="width:200px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">Size of a dessert spoon</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:521px;">Razor Blade</td>
			<td style="width:200px;">Bic</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">Chrome Platinum, used in slicing with vibratome</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:37px;width:521px;">Scalpel Blade</td>
			<td style="width:200px;">Becton Dickinson (BD)</td>
			<td style="width:344px;">Number 24</td>
			<td style="width:505px;">Used for slicing of tissue; recommended same size or smaller</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:34px;width:521px;">Superglue (Loctite Super Bonder)</td>
			<td style="width:200px;">Henkel</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">Composition: Etilcianoacrilato; 2-Propenoic acid; 6,6&#39;-di-terc-butil-2,2&#39;-metilenodi-p-cresol; homopolymer</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;">Vibratome&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14047235612 - VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:37px;width:521px;">Name of Material/ Equipment for Immunohistochemistry</td>
			<td style="width:200px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:41px;">Antibody anti-NeuN (mouse)</td>
			<td>Millipore&#160;</td>
			<td>MAB377</td>
			<td>Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:521px;">Antibody anti-GFAP (mouse)</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td style="width:344px;">MAB360</td>
			<td>Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Antibody anti-Iba1 (rabbit)</td>
			<td style="width:200px;">Abcam</td>
			<td style="width:344px;">EPR16588 - ab178846</td>
			<td>Dilution 1:2,000 in Phosphate Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Biotinylated anti-mouse IgG Antibody (H+L)</td>
			<td style="width:200px;">Vector</td>
			<td style="width:344px;">BA-9200</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">DAB</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">D-9015</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Entellan</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td align="right" style="width:344px;">107960</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Ethanol</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td style="width:344px;">1.00983.1000</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Gelatin</td>
			<td style="width:200px;">Synth</td>
			<td style="width:344px;">00G1002.02.AE</td>
			<td style="width:505px;">Used for coating slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SM2010R</td>
			<td>Equipped with Freezing Stage (BFS-10MP, Physiotemp), set to -40&#186;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal Donkey Serum</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">158127</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit)</td>
			<td>GE</td>
			<td>NA934-1ML</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Slides (Star Frost)</td>
			<td>Knittel Glaser</td>
			<td></td>
			<td>Gelatin coated slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td style="width:200px;">Vetec</td>
			<td>60REAVET017050</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Vectastain ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard)</td>
			<td style="width:200px;">Vector</td>
			<td style="width:344px;">PK-4000, Kit Standard</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Xylene</td>
			<td style="width:200px;">Synth</td>
			<td style="width:344px;">01X1001.01.BJ</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

short-term free-floating slice cultures from the adult human brain

Organotypische, of segment culturen, zijn op grote schaal gebruikt om aspecten van het centrale zenuwstelsel functioneren in vitro te modelleren. Ondanks het potentieel van segment culturen in de neurowetenschappen, zijn studies die gebruik maken van volwassen zenuwweefsel om dergelijke culturen voor te bereiden nog schaars, met name die van menselijke proefpersonen. Het gebruik van volwassen menselijk weefsel om segment culturen voor te bereiden is bijzonder aantrekkelijk om het begrip van menselijke neuropathologieën te verbeteren, omdat ze unieke eigenschappen hebben die kenmerkend zijn voor het volwassen menselijke brein dat ontbreekt in plakjes die worden geproduceerd door knaagdieren (meestal neonataal) zenuwweefsel. Dit protocol beschrijft hoe te gebruiken hersenweefsel verzameld van levende menselijke donoren voorgelegd aan recidiverend hersenchirurgie om te bereiden op korte termijn, vrij zwevende segment culturen. Er worden ook procedures gepresenteerd voor het onderhouden en uitvoeren van biochemische en celbiologie-testen met behulp van deze culturen. Representatieve resultaten tonen aan dat de typische menselijke corticale laminering wordt bewaard in plakjes na 4 dagen in vitro (DIV4), met de verwachte aanwezigheid van de belangrijkste neurale celtypen. Bovendien ondergaan plakjes bij DIV4 een robuuste celdood wanneer ze worden uitgedaagd met een toxische stimulus (H2O2), wat het potentieel van dit model aangeeft om als platform te dienen in celdood testen. Deze methode, een eenvoudiger en kosteneffectief alternatief voor het veelgebruikte protocol met behulp van membraan inserts, wordt vooral aanbevolen voor het uitvoeren van korte termijn testen die gericht zijn op het ontrafelen van mechanismen van neurodegeneratie achter leeftijdsgebonden hersenziekten. Ten slotte, hoewel het protocol is gewijd aan het gebruik van corticale weefsel verzameld van patiënten die worden voorgelegd aan de chirurgische behandeling van pharmacoresistant temporale kwal epilepsie, wordt aangevoerd dat weefsel verzameld uit andere hersengebieden/voorwaarden ook moet worden beschouwd als bronnen om soortgelijke vrij zwevende segment culturen te produceren.

Een kritisch aspect om de kwaliteit en de gezondheid van de gekweekte plakjes te evalueren is de aanwezigheid en typische morfologie van de verwachte neurale celtypen, neuronen en gliacellen. De typische architectuur van de menselijke corticale laminatie werd waargenomen in een segment op DIV4, onthuld door neuronale immunolabeling (Figuur 2D). Daarnaast werd ook de verwachte aanwezigheid van Microglia en astroglia (Figuur 2B, C...

Watch this Scientific Journal Video about Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain at JoVE.com

Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain

Een protocol om vrij zwevende segment culturen van volwassen menselijk brein voor te bereiden wordt gepresenteerd. Het protocol is een variatie van de veelgebruikte segment cultuurmethode met behulp van membraan inserts. Het is eenvoudig, kosteneffectief, en aanbevolen voor het uitvoeren van korte termijn testen gericht op het ontrafelen van mechanismen van neurodegeneratie achter de leeftijd geassocieerde hersenziekten.

Korte-termijn vrij zwevende segment culturen van het volwassen menselijk brein

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of ...

We presenteren een protocol voor te bereiden vrij zwevende slice culturen uit hersenweefsel verzameld van levende menselijke donoren voorgelegd aan resective hersenchirurgie. Deze cultuur is vatbaar voor het uitvoeren van biochemische en celbiologie testen of immunohistochemie. Het zal naar verwachting bijdragen aan de opheldering van het mechanisme dat ten grondslag ligt aan neurodegeneratie in geassocieerde hersenziekten.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een eenvoudiger en kosteneffectiever alternatief is voor het klassieke slice cultuur protocol met membraan inserts. Hoewel het algemene protocol niet complex is, zijn sommige stappen zoals het verwijderen van hersenvliezen, het lijmen van het weefsel aan de vibratome specimen schijf, en resectie voor immunohistochemie het best te begrijpen wanneer visueel aangetoond. Helpen om de procedure aan te tonen zullen Niele Mendes en Glaucia Almedia die grad studenten, en Giovanna Nogueira, een andere grad student.Om deze procedure te beginnen, voeg zout toe aan een emmer ijs. Breng de snijoplossing over op deze emmer en laat deze minstens 20 minuten rusten onder het carbogenmengsel dat voor gebruik borrelt. Bereid vervolgens een blok van 3% agarose dat is ongeveer twee centimeter door twee centimeter door twee centimeter.Super lijm de agarose blok aan de vibratome monster schijf om extra mechanische ondersteuning van het weefsel monster te creëren tijdens het snijden. Stel op het vibratome de sectiedikte in op 200 micrometer, de trillingsfrequentie op 100 hertz en kies een snijsnelheid tussen 0,5 en 1,0 millimeter per seconde. Vergrendel vervolgens de triombufferlade op de triomebasis en voeg ijs toe om het gekoeld te houden voordat de snijoplossing en het monster en tijdens de snijprocedure worden ontvangen.In de eerste plaats een transportapparaat opzetten dat bestaat uit een draagbare gasfles die een carbogenmengsel bevat dat is aangesloten op een drukfluxklep die de gasproductie regelt die is aangesloten op siliconenbuizen die die gasproductie verbinden met het transportschip en het transportschip dat de transportoplossing en ijs voor monsterkoeling tijdens het transport bevat. Verzamel en transport het monster en transport zoals beschreven in het tekstprotocol. Breng het monster over op een petrischaaltje met snijoplossing.Verwijder met behulp van fijne chirurgische hulpmiddelen voorzichtig zoveel mogelijk van de resterende hersenvliezen. Kies de beste monster oriëntatie voor het produceren van plakjes met de bijzondere kenmerken van het experimentele ontwerp en gebruik een nummer 24 scalpel blad om een plat oppervlak trim om de basis die zal worden gelijmd aan het monster schijf. Met behulp van een verwijdering plastic lepel en delicate kwasten, het verzamelen van het fragment uit de petrischaal en afdrogen overtollige oplossing met filterpapier.Gebruik vervolgens superlijm om het weefsel aan de vibratome specimen schotel te bevestigen totdat het stevig aan de schotel wordt bevestigd en in contact komt met het agaroseblok. Plaats de vibratome specimen disc in de vibratome buffer tray. Sluit de messenhouder op zijn plaats met het scheermesje stevig vast.Voeg de snijoplossing toe en zorg ervoor dat het zowel het monster als het mes bedekt. Dan beginnen snijden het monster in 200 micrometer plakjes. Breng de plakjes van de bufferlade naar een petrischaaltje met snijoplossing en snijd losse randen en overtollige witte stof bij tot een percentage van ongeveer 70% cortex en 30% witte stof.In een laminaire stroomkast, voeg 600 microliters van cultuur medium om elke put van een 24-put plaat en incubbate op 36 graden Celsius met 5% kooldioxide gedurende ten minste 20 minuten voorafgaand aan het plating van de plakjes. Gebruik hierna een kwast om in elke put een plakje te maken. Als er ongebruikte putten in de plaat zitten, vul ze dan met 400 microliter steriel water.Incubeer bij 36 graden Celsius met 5%kooldioxide. Supplement 10 milliliter van de eerder voorbereide cultuur medium met de hersenen afgeleide neurotrofe factor bij een concentratie van 50 nanogram per milliliter. Na acht tot 16 uur, verwijder 333 microliter van het geconditioneerde medium uit elke put en voeg 133 microliter vers BDNF aangevuld medium.Vervang een derde van het geconditioneerde medium elke 24 uur door vers BDNF-medium. Breng eerst de plakjes van de putten met kweekmedium over naar een nieuwe 24-putplaat met PBS. Verwijder de PBS uit elke put en vervang deze door een milliliter van 4%paraformaldehyde.Incubeer 's nachts bij vier graden Celsius. De volgende dag, voorzichtig verwijderen van de paraformaldehyde uit de putten en vervang het door een milliliter van 30% sacharose oplossing. Incubeer op vier graden Celsius gedurende 48 uur.Na 48 uur, zet het invriezen microtome op negatieve 40 graden Celsius. Bereid een sacharose basis op de microtome stadium waar de plakjes moeten worden geplaatst. Nadat het volledig is bevroren, snijd een deel van de bevroren sacharose om een vlakke ondergrond waarop de plak zal worden geplaatst te produceren.Plaats vervolgens elk plakje over een uitgerekte plastic folie en gebruik een penseel om het weefsel plat te maken. Breng in één beweging het uitgerekte segment over naar de bevroren sacharosebasis. Nadat het segment vijf tot tien minuten heeft rusten om goed te bevriezen, snijd u het plakje in secties van 30 micrometer.Breng de 30 micrometer secties over op een petrischaaltje met PBS en ga naar een histologieprotocol dat geschikt is voor het experimentele ontwerp. Bij het bepalen van de kwaliteit en gezondheid van gekweekte segmenten, een cruciaal aspect te evalueren is de aanwezigheid en typische morfologie van de verwachte neurale cel types, neuronen en gliacellen. De typische architectuur van de menselijke corticale laminatie wordt waargenomen in een segment op dag in vitro vier onthuld door neuronale immunolabeling.Daarnaast wordt ook de verwachte aanwezigheid van microglia en astroglia waargenomen. Deze resultaten tonen aan dat weefselarchitectuur niet significant wordt beïnvloed, noch door de chirurgische ingreep, de monsterverwerking of door de korte termijn periode in vitro. De neuronale respons op kaliumchloride-geïnduceerde depolarisatie zijn ook gekwantificeerd in gekweekte plakjes door het volgen van ERK fosforylatie.Interessant is dat een duidelijke toename van ERK-fosforylatie wordt gezien in met kaliumchloride behandelde plakjes op dag in vitro four. Ten slotte wordt de reactie van plakjes op dag in vitro vier op een toxische uitdaging geëvalueerd met een bekende oxidatieve stress inducer waterstofperoxide. Het blootstellen van de plakjes aan 300 millimolar waterstofperoxide gedurende 24 uur leidde tot een robuuste daling van de MTT-reductie.Samen, de massale celdood waargenomen in dag in vitro vijf plakjes na de waterstofperoxide uitdaging en de kaliumchloride-geïnduceerde depolarisatie resultaten geven de behouden algemene gezondheid van plakjes op dag in vitro vier die reageren op een toxische stimulus zoals oxidatieve stress. Dit protocol is voornamelijk gewijd aan studies op basis van tests van meer dan een week, zoals het onderzoek van moleculaire mechanismen van neurotoxiciteit en neuroprotectie door kandidaat-geneesmiddelen. Hoewel dit protocol is gewijd aan het gebruik van corticale weefsel verzameld van patiënten voorgelegd aan chirurgische behandeling voor micro-resistente temporale kwab epilepsie, is het waarschijnlijk dat weefsel verzameld uit andere hersengebieden of aandoeningen kunnen ook bronnen om vrij zwevende slice culturen te produceren.Slice culturen uit volwassen menselijke hersenen kan de sleutel zijn in het bevorderen van ons begrip van de menselijke neuropathologieën als gevolg van hun unieke cellulaire circuits en moleculaire machines ontbreekt in plakjes geproduceerd uit knaagdier hersenen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

Organotypische hippocampus Slice culturen

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

De Analyse van de Purkinje cel dendritische morfologie in organotypische slice culturen

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Lineage-herprogrammering van pericyte-afgeleide cellen van het volwassen menselijke hersenen in Induced Neuronen

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

De Analyse van Neurovascular Verbouwing in Entorhino-hippocampus Organotypische Slice Culturen

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Slice It Hot: Acute Adult Brain Slicing in Physiological Temperature

Slice It Hot: Acute volwassen hersenen Snijden in Fysiologische Temperatuur

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

Voorbereiding van de primaire Mixed glialculturen van volwassen muis Spinal Cord Tissue

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors

Afleiding van leptomeningen Explantatie culturen van postmortaal Human Brain Donors

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

Eenvoudige generatie van de cultuur van een hoog rendement van geïnduceerde neuronen van menselijke volwassen huid fibroblasten

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures

Voorbereiding en immunokleuring van Myelinating Organotypic cerebellaire segment culturen

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical ...

Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay

Targeting Alfa Synuclein aggregaten in cutane perifere zenuwvezels door Free-floating immunofluorescentie assay

To date, for most neurodegenerative diseases only a post-mortem histopathological definitive diagnosis is available. For Parkinson&#39;s disease (PD), the ...