Name: short-term free-floating slice cultures from the adult human brain
Uploaded: 2019-11-05T13:30:00
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Ce travail est soutenu par FAPESP (Grant 25681-3/2017 à AS), CAPES (Bourse postdoctorale PNPD/INCT-HSM à A.F. et Bourse prédoctorale à N.D.M.) et FAEPA. G.M.A. est titulaire d'une maîtrise du FAPESP (MS 2018/06614-4). N.G.C. est titulaire d'une bourse de recherche du CNPq. Nous remercions les patients et leurs familles d'avoir fait don des tissus réséqués pour cette étude. Nous tenons à souligner le soutien des résidents, des infirmières, des techniciens et de l'équipe du CIREP, de l'hôpital clinique de l'École de médecine Ribeiro Preto, université de Sao Paulo, qui ont aidé à diverses étapes du processus.

Des tissus cérébraux adultes vivants ont été obtenus à partir de patients subissant une neurochirurgie réséctive pour le traitement de l'épilepsie pharmacorésistante du lobe temporal(figure 1A). Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité d'éthique de l'hôpital des cliniques de l'école de médecine De Ribeiro Preto (17578/2015), et les patients (ou leur personne responsable légale) ont accepté et signé les conditions du consentement éclairé. ...

Ce protocole pour la production de cultures de tranches flottantes et à court terme est une méthode alternative pour la culture de tranches néocorticales humaines adultes. Un tel protocole pour les cultures de tranches peut être propice aux études sur (mais pas limité à) l'optogénétique1,44,45, l'électrophysiologie2,3,4,5...

L'utilisation d'échantillons humains dans la recherche est sans équivoque une excellente option pour étudier les pathologies du cerveau humain, et les techniques modernes ont ouvert de nouvelles voies pour l'expérimentation robuste et éthique en utilisant des tissus dérivés du patient. Des méthodes comme les cultures organotypic/slice préparées à partir du cerveau humain adulte ont été de plus en plus employées dans des paradigmes tels que l'optogénétique1, l'électrophysiologie2,3,4,5, plasticité 6,7,8,9, neurotoxicité/neuroprotection10,11,12,13, thérapie cellulaire14, dépistage des médicaments15,16,17, génétique et l'édition génétique12,18,19,20, entre autres, comme une stratégie pour mieux comprendre les maladies neurologiques à l'âge adulte.
La compréhension des mécanismes sous-jacents aux pathologies cérébrales humaines dépend de stratégies expérimentales qui nécessitent un grand nombre de sujets. Inversement, dans le cas des cultures de tranches, bien que l'accès aux échantillons humains soit encore difficile, la possibilité de générer jusqu'à 50 tranches à partir d'un seul échantillon cortical contourne partiellement l'exigence de recruter plusieurs volontaires en augmentant le nombre de répliques et d'essais effectués par tissu recueilli21.
Plusieurs protocoles pour les cultures organotypic/slice de cerveau ont été décrits, s'étendant des projets classiques d'oculo22,23 au tube de rouleau24,25,26, membranes semi-perméables interface27,28,29,30, et les tranches flottantes31,32. Selon les particularités d'un design expérimental, chaque technique a ses propres avantages et inconvénients. À court terme, les cultures de tranches flottantes libres du cerveau humain adulte est dans certains cas avantageuse par rapport à la méthode utilisée par Stoppini et coll.27, si l'on considère le fait que, bien que la survie cellulaire à long terme in vitro soit habituellement une préoccupation majeure lors de l'évaluation une méthode de culture, dans beaucoup d'expériences seulement de courtes périodes de temps dans la culture sont nécessaires12,31,32,33,34,35. Dans ces conditions, l'utilisation de cultures flottantes présente l'avantage d'être plus simple et plus rentable, ainsi que plus exactement ressemblant à l'état des tissus humains d'origine que les tranches maintenues en culture sur 2-3 semaines.
Malgré le potentiel des cultures de tranche à la neuroscience, les études utilisant le tissu nerveux adulte pour préparer de telles cultures sont encore rares, particulièrement des sujets humains. Cet article décrit un protocole pour employer le tissu de cerveau recueilli des donateurs humains vivants soumis à la chirurgie résective de cerveau pour préparer des cultures de tranche flottantes. Les procédures de maintien et d'exécution des tests biochimiques et de biologie cellulaire à l'aide de ces cultures sont détaillées. Ce protocole s'est avéré utile pour analyser la viabilité et la fonction neuronale dans les investigations sur les mécanismes des neuropathologies liées à l'âge adulte.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1571px;" width="1570">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">2-Propanol</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td style="width:344px;">1096341000</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Acrylamide/Bis-Acrylamide, 30% solution</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">A3449&#160;</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Ammonium persulfate</td>
			<td style="width:200px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">A3678-25G</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Amphotericin B</td>
			<td style="width:200px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">15290-018</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Antibody anti-ERK 2 (rabbit)</td>
			<td>Santa Cruz Biotecnology</td>
			<td>sc-154</td>
			<td>Dilution 1:1,000 in BSA 2.5%</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Antibody anti-pERK (mouse)</td>
			<td>Santa Cruz Biotecnology</td>
			<td>sc-7383</td>
			<td>Dilution 1:1,000 in BSA 2.5%</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BDNF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SRP3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">A7906</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Bradford 1x Dye Reagent</td>
			<td style="width:200px;">BioRad</td>
			<td style="width:344px;">500-0205</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">EDTA</td>
			<td style="width:200px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">T3924</td>
			<td style="width:505px;">Used in RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hank&#39;s Balanced Salts</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H1387-10X1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hepes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td style="width:344px;">1003171000</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Hydrogen Peroxide (H2O2)</td>
			<td style="width:200px;">Vetec</td>
			<td align="right" style="width:344px;">194</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (anti-mouse)</td>
			<td style="width:200px;">GE</td>
			<td style="width:344px;">NA931-1ML</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">NaCl</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td align="right" style="width:344px;">1064041000</td>
			<td style="width:505px;">Used in RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Neurobasal A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10888-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Non-fat dry milk (Molico)</td>
			<td style="width:200px;">Nestl&#233;</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">Used for membrane blocking</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">PBS Buffer pH 7,2</td>
			<td>Laborclin</td>
			<td align="right">590338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicilin/Streptomicin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:521px;">Potassium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td align="right">1049361000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:521px;">Prime Western Blotting Detection Reagent</td>
			<td style="width:200px;">GE</td>
			<td style="width:344px;">RPN2232</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit)</td>
			<td>GE</td>
			<td>NA934-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:521px;">SDS</td>
			<td style="width:200px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">L5750</td>
			<td style="width:505px;">Used in RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:521px;">TEMED</td>
			<td style="width:200px;">GE</td>
			<td style="width:344px;">17-1312-01</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Tris</td>
			<td style="width:200px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">T-1378</td>
			<td style="width:505px;">Used in RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:521px;">Triton x-100</td>
			<td style="width:200px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">X100</td>
			<td style="width:505px;">Used in RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:521px;">Ultrapure Water</td>
			<td style="width:200px;">Millipore</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">Sterile water, derived from MiliQ water purification system</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:521px;">Equipment and Material</td>
			<td style="width:200px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:50px;">24-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CL S3526</td>
			<td>Flat Bottom with Lid</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;">Amersham Potran Premium (nitrocellulose membrane)&#160;</td>
			<td>GE</td>
			<td>29047575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:521px;">Carbogen Mixture</td>
			<td style="width:200px;">White Martins</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">95% O2, 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:46px;width:521px;">CO2 incubator</td>
			<td style="width:200px;">New Brunswick Scientific</td>
			<td style="width:344px;">CO-24</td>
			<td style="width:505px;">Incubation of slices 5% CO2, 36&#186;C</td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;width:521px;">Microplate Reader</td>
			<td style="width:200px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:521px;">Microtubes</td>
			<td style="width:200px;">Greiner</td>
			<td style="width:344px;">001608</td>
			<td style="width:505px;">1,5mL microtube</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:521px;">Motorized pestle</td>
			<td style="width:200px;">Kimble Chase</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:521px;">Plastic spoon</td>
			<td style="width:200px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">Size of a dessert spoon</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:521px;">Razor Blade</td>
			<td style="width:200px;">Bic</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">Chrome Platinum, used in slicing with vibratome</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:37px;width:521px;">Scalpel Blade</td>
			<td style="width:200px;">Becton Dickinson (BD)</td>
			<td style="width:344px;">Number 24</td>
			<td style="width:505px;">Used for slicing of tissue; recommended same size or smaller</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:34px;width:521px;">Superglue (Loctite Super Bonder)</td>
			<td style="width:200px;">Henkel</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">Composition: Etilcianoacrilato; 2-Propenoic acid; 6,6&#39;-di-terc-butil-2,2&#39;-metilenodi-p-cresol; homopolymer</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;">Vibratome&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14047235612 - VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:37px;width:521px;">Name of Material/ Equipment for Immunohistochemistry</td>
			<td style="width:200px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:41px;">Antibody anti-NeuN (mouse)</td>
			<td>Millipore&#160;</td>
			<td>MAB377</td>
			<td>Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:521px;">Antibody anti-GFAP (mouse)</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td style="width:344px;">MAB360</td>
			<td>Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Antibody anti-Iba1 (rabbit)</td>
			<td style="width:200px;">Abcam</td>
			<td style="width:344px;">EPR16588 - ab178846</td>
			<td>Dilution 1:2,000 in Phosphate Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Biotinylated anti-mouse IgG Antibody (H+L)</td>
			<td style="width:200px;">Vector</td>
			<td style="width:344px;">BA-9200</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">DAB</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">D-9015</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Entellan</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td align="right" style="width:344px;">107960</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Ethanol</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td style="width:344px;">1.00983.1000</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Gelatin</td>
			<td style="width:200px;">Synth</td>
			<td style="width:344px;">00G1002.02.AE</td>
			<td style="width:505px;">Used for coating slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SM2010R</td>
			<td>Equipped with Freezing Stage (BFS-10MP, Physiotemp), set to -40&#186;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal Donkey Serum</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">158127</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit)</td>
			<td>GE</td>
			<td>NA934-1ML</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Slides (Star Frost)</td>
			<td>Knittel Glaser</td>
			<td></td>
			<td>Gelatin coated slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td style="width:200px;">Vetec</td>
			<td>60REAVET017050</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Vectastain ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard)</td>
			<td style="width:200px;">Vector</td>
			<td style="width:344px;">PK-4000, Kit Standard</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Xylene</td>
			<td style="width:200px;">Synth</td>
			<td style="width:344px;">01X1001.01.BJ</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

short-term free-floating slice cultures from the adult human brain

Organotypic, ou cultures de tranche, ont été largement employés pour modéliser des aspects du système nerveux central fonctionnant in vitro. Malgré le potentiel des cultures de tranches en neurosciences, les études utilisant le tissu nerveux adulte pour préparer de telles cultures sont encore rares, en particulier celles des sujets humains. L'utilisation de tissus humains adultes pour préparer les cultures de tranches est particulièrement attrayante pour améliorer la compréhension des neuropathologies humaines, car elles contiennent des propriétés uniques typiques du cerveau humain mature manquant de tranches produites à partir de rongeurs (généralement néonatales) tissu nerveux. Ce protocole décrit comment utiliser les tissus cérébraux recueillis auprès de donneurs humains vivants soumis à une chirurgie réséctive du cerveau pour préparer des cultures de tranches à court terme et flottantes. Des procédures pour maintenir et effectuer des essais biochimiques et de biologie cellulaire utilisant ces cultures sont également présentées. Les résultats représentatifs démontrent que le lamination corticale humain typique est préservé en tranches après 4 jours in vitro (DIV4), avec la présence prévue des principaux types de cellules neurales. En outre, les tranches de DIV4 subissent une mort cellulaire robuste lorsqu'elles sont confrontées à un stimulus toxique (H2O2), indiquant le potentiel de ce modèle pour servir de plate-forme dans les tests de mort cellulaire. Cette méthode, une alternative plus simple et rentable au protocole largement utilisé utilisant des inserts membranaires, est principalement recommandée pour exécuter des essais à court terme visant à démêler les mécanismes de neurodégénérescence derrière les maladies du cerveau associées à l'âge. Enfin, bien que le protocole soit consacré à l'utilisation de tissus corticaux prélevés sur des patients soumis à un traitement chirurgical de l'épilepsie pharmacorésistante du lobe temporal, on fait valoir que les tissus prélevés dans d'autres régions ou conditions cérébrales devraient également être comme sources pour produire des cultures de tranches flottantes similaires.

Un aspect critique pour évaluer la qualité et la santé des tranches cultivées est la présence et la morphologie typique des types de cellules neurales, des neurones, et des cellules gliales prévus. L'architecture typique du lamination corticale humain a été observée dans une tranche à DIV4, révélée par l'immunolabeling neuronal (Figure 2D). De plus, on a également observé la présence prévue de microglies et d'astroglia(figure 2<...

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Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain

Un protocole pour préparer les cultures de tranches flottantes à partir du cerveau humain adulte est présenté. Le protocole est une variante de la méthode de culture de tranches largement utilisée à l'aide d'inserts membranaires. Il est simple, rentable et recommandé pour les essais à court terme visant à démêler les mécanismes de neurodégénérescence derrière les maladies du cerveau associées à l'âge.

Cultures à court terme de tranches flottantes du cerveau humain adulte

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of ...

Nous présentons un protocole pour préparer des cultures de tranches flottantes à partir de tissus cérébraux prélevés sur des donneurs humains vivants soumis à la chirurgie cérébrale réséctive. Cette culture est agréable à effectuer des analyses biochimiques et cellulaires de biologie ou de l’immunohistochimie. On s’attend à ce qu’il contribue à l’élucidation du mécanisme sous-jacent à la neurodégénérescence dans les maladies cérébrales associées.Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit d’une alternative plus simple et rentable au protocole classique de culture des tranches à l’aide d’inserts membranaires. Bien que le protocole global ne soit pas complexe, certaines étapes telles que l’enlèvement des méninges, le collage du tissu au disque de spécimen vibratome, et la résection pour l’immunohistochimie sont mieux comprises une fois démontrées visuellement. Niele Mendes et Glaucia Almedia, qui sont des étudiants diplômés, et Giovanna Nogueira, une autre étudiante diplômée, contribueront à démontrer la procédure.Pour commencer cette procédure, ajouter du sel à un seau de glace. Transférer la solution de tranchage dans ce seau et laisser reposer sous le mélange de carbogen bouillonnant pendant au moins 20 minutes avant l’utilisation. Ensuite, préparez un bloc de 3% agarose qui est d’environ deux centimètres par deux centimètres par deux centimètres.Super collez le bloc d’agarose au disque de spécimen vibratome afin de créer le soutien mécanique additionnel à l’échantillon de tissu pendant le tranchage. Sur le vibratome, réglez l’épaisseur de la section à 200 micromètres, la fréquence des vibrations à 100 hertz, et choisissez une vitesse de coupe comprise entre 0,5 et 1,0 millimètre par seconde. Verrouillez ensuite le plateau tampon vibratome à la base vibratoire et ajoutez de la glace pour la garder au réfrigérateur avant de recevoir la solution de tranchage et l’échantillon et tout au long de la procédure de tranchage.Tout d’abord, mettre en place un appareil de transport qui se compose d’une bouteille de gaz portative contenant un mélange de carbogen relié à une soupape de flux de pression qui contrôle la sortie de gaz reliée à des tubes en silicone qui relie cette sortie de gaz au navire de transport et au navire de transport qui contient la solution de transport et la glace pour le refroidissement de l’échantillon pendant le transport. Recueillir et transporter le spécimen et le transport tel que décrit dans le protocole de texte. Transférer le spécimen dans une boîte de Pétri contenant une solution de tranchage.À l’aide d’outils chirurgicaux fins, retirez soigneusement autant de méninges restantes que possible. Choisissez la meilleure orientation de spécimen pour produire des tranches avec les caractéristiques particulières de la conception expérimentale et utilisez une lame de scalpel numéro 24 pour couper une surface plane pour être la base qui sera collée au disque de spécimen. À l’aide d’une cuillère en plastique d’élimination et de pinceaux délicats, recueillir le fragment de la boîte de Pétri et sécher l’excès de solution avec du papier filtre.Ensuite, utilisez de la colle super pour attacher le tissu au plat du spécimen vibratome jusqu’à ce qu’il soit fermement collé au plat et en contact avec le bloc agarose. Placez le disque de spécimen vibratome dans le plateau tampon vibratome. Verrouillez le porte-couteau en place avec la lame de rasoir fermement fixée.Ajouter la solution de tranchage et s’assurer qu’elle couvre à la fois le spécimen et la lame. Ensuite, commencez à trancher le spécimen en tranches de 200 micromètres. Transférer les tranches du plateau tampon dans une boîte de Pétri contenant une solution de tranchage et couper les bords lâches et l’excès de matière blanche à une proportion d’environ 70% cortex et 30% de matière blanche.Dans une armoire à écoulement laminaire, ajouter 600 microlitres de culture moyenne à chaque puits d’une plaque de 24 puits et incuber à 36 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant au moins 20 minutes avant le placage des tranches. Après cela, utilisez un pinceau pour plaquer une tranche dans chaque puits. S’il y a des puits inutilisés dans la plaque, remplissez-les de 400 microlitres d’eau stérile.Incuber à 36 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Compléter 10 millilitres du milieu de culture précédemment préparé avec le facteur neurotrophique dérivé du cerveau à une concentration de 50 nanogrammes par millilitre. Après huit à 16 heures, retirer 333 microlitres du milieu conditionné de chaque puits et ajouter 133 microlitres de milieu frais complété par BDNF.Remplacer un tiers du milieu conditionné par un milieu frais complété par bdnf toutes les 24 heures. Tout d’abord, transférer les tranches des puits contenant du milieu de culture à une nouvelle plaque de 24 puits contenant du PBS. Retirez le PBS de chaque puits et remplacez-le par un millilitre de paraformaldéhyde de 4 %.Incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, retirez soigneusement le paraformaldéhyde des puits et remplacez-le par une millilitre de solution de saccharose à 30 %. Incuber à quatre degrés Celsius pendant 48 heures.Après 48 heures, réglez la microtome de congélation à 40 degrés Celsius négatifs. Préparer une base de saccharose sur le stade de microtome où les tranches doivent être placées. Après avoir complètement gelé, couper une partie du saccharose congelé pour produire une surface plane sur laquelle la tranche sera placée.Ensuite, placez chaque tranche sur un film plastique étiré et utilisez un pinceau pour aplatir le tissu. En un seul mouvement, transférer la tranche étirée à la base congelée de saccharose. Une fois la tranche reposée de cinq à dix minutes pour bien congeler, couper la tranche en 30 sections de micromètres.Transférez les sections de 30 micromètres dans une boîte de Pétri contenant du PBS et passez à un protocole d’histologie adéquat pour la conception expérimentale. Lors de la détermination de la qualité et de la santé des tranches de culture, un aspect critique à évaluer est la présence et la morphologie typique des types de cellules neurales attendues, des neurones et des cellules gliales. L’architecture typique de la lamination corticale humaine est observée dans une tranche à la journée in vitro quatre révélée par immunolabeling neuronal.En outre, la présence prévue de microglies et d’astroglies est également observée. Ces résultats démontrent que l’architecture tissulaire n’est pas significativement affectée ni par la procédure chirurgicale, ni par le traitement de l’échantillon, ni par la période in vitro à court terme. La réponse neuronale à la dépolarisation induite par le chlorure de potassium a également été quantifiée dans les tranches de culture en suivant la phosphorylation d’ERK.Fait intéressant, une augmentation claire de la phosphorylation ERK est observée dans les tranches traitées au chlorure de potassium à la journée in vitro quatre. Enfin, la réponse des tranches à la journée in vitro quatre à un défi toxique est évaluée avec un peroxyde d’hydrogène oxydatif connu d’incitation d’effort. L’exposition des tranches au peroxyde d’hydrogène de 300 millimlaires pendant 24 heures a entraîné une forte diminution de la réduction du MTT.Pris ensemble, la mort cellulaire massive observée dans la journée in vitro cinq tranches après le défi du peroxyde d’hydrogène et les résultats de dépolarisation induits par le chlorure de potassium indiquent la santé générale préservée des tranches à la journée in vitro quatre qui répondent à un stimulus toxique tel que le stress oxydatif. Ce protocole est principalement consacré à des études basées sur des analyses d’une durée de plus d’une semaine telles que l’étude des mécanismes moléculaires de neurotoxicité et de neuroprotection par les médicaments candidats. Bien que ce protocole soit consacré à l’utilisation de tissus corticals prélevés sur des patients soumis à un traitement chirurgical pour l’épilepsie microrésistante du lobe temporal, il est probable que les tissus prélevés dans d’autres régions ou affections du cerveau pourraient également être des sources pour produire des cultures de tranches flottantes.Les cultures de tranches provenant du cerveau humain adulte peuvent être essentielles pour faire progresser notre compréhension des neuropathologies humaines en raison de leurs circuits cellulaires uniques et de leurs machines moléculaires dépourvues de tranches produites à partir du cerveau des rongeurs.

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