Name: short-term free-floating slice cultures from the adult human brain
Uploaded: 2019-11-05T13:30:00
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Diese Arbeit wird unterstützt von FAPESP (Grant 25681-3/2017 to AS), CAPES (Post-Doctoral fellowship PNPD/INCT-HSM to A.F. and Pre-Doctoral fellowship to N.D.M.) und FAEPA. G.M.A. hält ein Master-Stipendium von FAPESP (MS 2018/06614-4). N.G.C. besitzt ein CNPq Research Fellowship. Wir danken den Patienten und ihren Familien für die Vermehrung der resezierten Gewebe für diese Studie. Wir möchten die Unterstützung von Bewohnern, Krankenschwestern, Technikern und dem CIREP-Team des Klinischen Krankenhauses der Ribeiréo Preto Medical School, Universität von Sao Paulo, würdigen, die in verschiedenen Phasen des Prozesses geholfen haben.

Lebende erwachsene Hirngewebe wurden von Patienten gewonnen, die sich einer resekttiven Neurochirurgie zur Behandlung einer pharmakoresistenten temporalen Lappenepilepsie unterziehen (Abbildung 1A). Alle Verfahren wurden von der Ethikkommission des Klinikkrankenhauses der Ribeiréo Preto Medical School (17578/2015) genehmigt, und die Patienten (oder ihre verantwortliche Person) stimmten zu und unterzeichneten die Vereinbarten Zustimmungsbedingungen. Die Entnahme des Gewebes ...

Dieses Protokoll zur Herstellung frei schwebender, kurzfristiger Scheibenkulturen ist eine alternative Methode zur Kultivierung erwachsener menschlicher neokortikaler Scheiben. Ein solches Protokoll für Scheibenkulturen kann für Studien über (aber nicht beschränkt auf) Optogenetik1,44,45, Elektrophysiologie2,3,4,<sup clas...

Die Verwendung menschlicher Proben in der Forschung ist eindeutig eine großartige Option, um menschliche Hirnpathologien zu untersuchen, und moderne Techniken haben neue Wege für robuste und ethische Experimente mit Patientengewebe eröffnet. Methoden wie organotypische/Slice-Kulturen aus erwachsenen menschlichen Gehirn wurden zunehmend in Paradigmen wie Optogenetik1, Elektrophysiologie2,3,4,5, Plastizität 6,7,8,9, Neurotoxizität/Neuroprotektion10,11,12,13, Zelltherapie14, Arzneimittelscreening15,16,17, Genetik und Genbearbeitung12,18,19,20, unter anderem als Strategie für eine bessere Neurologische Erkrankungen im Erwachsenenalter zu verstehen.
Das Verständnis der Mechanismen, die menschlichen Gehirnpathologien zugrunde liegen, hängt von experimentellen Strategien ab, die eine große Anzahl von Probanden erfordern. Umgekehrt umgeht bei Scheibenkulturen, obwohl der Zugang zu menschlichen Proben immer noch schwierig ist, die Möglichkeit, bis zu 50 Scheiben aus einer einzigen kortikalen Probe zu erzeugen, teilweise die Anforderung, mehrere Freiwillige zu rekrutieren, durch die Erhöhung der Anzahl der Repliken und durchgeführten Assays pro gesammeltem Gewebe21.
Es wurden mehrere Protokolle für Organotypische/Scheibenkulturen des Gehirns beschrieben, von den klassischen Oculo-Entwürfen22,23 bis hin zu Rollenrohr24,25,26, halbdurchlässigen Membranen Schnittstelle27,28,29,30und frei schwebende Slices31,32. Je nach den Besonderheiten eines experimentellen Designs hat jede Technik ihre eigenen Vor- und Nachteile. Kurzfristige, frei schwebende Scheibenkulturen aus erwachsenen menschlichen Gehirnen ist in einigen Fällen vorteilhaft gegenüber der von Stoppini et al.27verwendeten Methode, wenn man bedenkt, dass das langfristige Zellüberleben in vitro zwar in der Regel ein Hauptanliegen bei der Bewertung ist. eine Kulturmethode, in vielen Experimenten werden nur kurze Zeiträume in der Kultur benötigt12,31,32,33,34,35. Unter diesen Bedingungen bietet die Verwendung frei schwebender Kulturen den Vorteil, einfacher und kostengünstiger zu sein und dem ursprünglichen menschlichen Gewebezustand genauer zu ähneln als Scheiben, die in der Kultur über 2-3 Wochen aufbewahrt werden.
Trotz des Potenzials von Schnittkulturen für die Neurowissenschaften sind Studien, die erwachsenes Nervengewebe zur Vorbereitung solcher Kulturen verwenden, immer noch rar, insbesondere von menschlichen Probanden. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Verwendung von gesammeltem Hirngewebe von lebenden menschlichen Spendern, die sich einer resektierenden Gehirnchirurgie unterziehen, um frei schwebende Scheibenkulturen vorzubereiten. Die Verfahren zur Pflege und Durchführung biochemischer und zellbiologischer Assays mit diesen Kulturen sind detailliert. Dieses Protokoll hat sich als wertvoll für die Analyse der Lebensfähigkeit und neuronalen Funktion in Untersuchungen über die Mechanismen von Neuropathologien im Zusammenhang mit dem Erwachsenenalter erwiesen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1571px;" width="1570">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">2-Propanol</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td style="width:344px;">1096341000</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Acrylamide/Bis-Acrylamide, 30% solution</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">A3449&#160;</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Ammonium persulfate</td>
			<td style="width:200px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">A3678-25G</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Amphotericin B</td>
			<td style="width:200px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">15290-018</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Antibody anti-ERK 2 (rabbit)</td>
			<td>Santa Cruz Biotecnology</td>
			<td>sc-154</td>
			<td>Dilution 1:1,000 in BSA 2.5%</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Antibody anti-pERK (mouse)</td>
			<td>Santa Cruz Biotecnology</td>
			<td>sc-7383</td>
			<td>Dilution 1:1,000 in BSA 2.5%</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BDNF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SRP3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">A7906</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Bradford 1x Dye Reagent</td>
			<td style="width:200px;">BioRad</td>
			<td style="width:344px;">500-0205</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">EDTA</td>
			<td style="width:200px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">T3924</td>
			<td style="width:505px;">Used in RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hank&#39;s Balanced Salts</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H1387-10X1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hepes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td style="width:344px;">1003171000</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Hydrogen Peroxide (H2O2)</td>
			<td style="width:200px;">Vetec</td>
			<td align="right" style="width:344px;">194</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (anti-mouse)</td>
			<td style="width:200px;">GE</td>
			<td style="width:344px;">NA931-1ML</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">NaCl</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td align="right" style="width:344px;">1064041000</td>
			<td style="width:505px;">Used in RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Neurobasal A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10888-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Non-fat dry milk (Molico)</td>
			<td style="width:200px;">Nestl&#233;</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">Used for membrane blocking</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">PBS Buffer pH 7,2</td>
			<td>Laborclin</td>
			<td align="right">590338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicilin/Streptomicin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:521px;">Potassium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td align="right">1049361000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:521px;">Prime Western Blotting Detection Reagent</td>
			<td style="width:200px;">GE</td>
			<td style="width:344px;">RPN2232</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit)</td>
			<td>GE</td>
			<td>NA934-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:521px;">SDS</td>
			<td style="width:200px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">L5750</td>
			<td style="width:505px;">Used in RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:521px;">TEMED</td>
			<td style="width:200px;">GE</td>
			<td style="width:344px;">17-1312-01</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Tris</td>
			<td style="width:200px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">T-1378</td>
			<td style="width:505px;">Used in RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:521px;">Triton x-100</td>
			<td style="width:200px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">X100</td>
			<td style="width:505px;">Used in RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:521px;">Ultrapure Water</td>
			<td style="width:200px;">Millipore</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">Sterile water, derived from MiliQ water purification system</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:521px;">Equipment and Material</td>
			<td style="width:200px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:50px;">24-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CL S3526</td>
			<td>Flat Bottom with Lid</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;">Amersham Potran Premium (nitrocellulose membrane)&#160;</td>
			<td>GE</td>
			<td>29047575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:521px;">Carbogen Mixture</td>
			<td style="width:200px;">White Martins</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">95% O2, 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:46px;width:521px;">CO2 incubator</td>
			<td style="width:200px;">New Brunswick Scientific</td>
			<td style="width:344px;">CO-24</td>
			<td style="width:505px;">Incubation of slices 5% CO2, 36&#186;C</td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;width:521px;">Microplate Reader</td>
			<td style="width:200px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:521px;">Microtubes</td>
			<td style="width:200px;">Greiner</td>
			<td style="width:344px;">001608</td>
			<td style="width:505px;">1,5mL microtube</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:521px;">Motorized pestle</td>
			<td style="width:200px;">Kimble Chase</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:521px;">Plastic spoon</td>
			<td style="width:200px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">Size of a dessert spoon</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:521px;">Razor Blade</td>
			<td style="width:200px;">Bic</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">Chrome Platinum, used in slicing with vibratome</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:37px;width:521px;">Scalpel Blade</td>
			<td style="width:200px;">Becton Dickinson (BD)</td>
			<td style="width:344px;">Number 24</td>
			<td style="width:505px;">Used for slicing of tissue; recommended same size or smaller</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:34px;width:521px;">Superglue (Loctite Super Bonder)</td>
			<td style="width:200px;">Henkel</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">Composition: Etilcianoacrilato; 2-Propenoic acid; 6,6&#39;-di-terc-butil-2,2&#39;-metilenodi-p-cresol; homopolymer</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;">Vibratome&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14047235612 - VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:37px;width:521px;">Name of Material/ Equipment for Immunohistochemistry</td>
			<td style="width:200px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:41px;">Antibody anti-NeuN (mouse)</td>
			<td>Millipore&#160;</td>
			<td>MAB377</td>
			<td>Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:521px;">Antibody anti-GFAP (mouse)</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td style="width:344px;">MAB360</td>
			<td>Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Antibody anti-Iba1 (rabbit)</td>
			<td style="width:200px;">Abcam</td>
			<td style="width:344px;">EPR16588 - ab178846</td>
			<td>Dilution 1:2,000 in Phosphate Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Biotinylated anti-mouse IgG Antibody (H+L)</td>
			<td style="width:200px;">Vector</td>
			<td style="width:344px;">BA-9200</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">DAB</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">D-9015</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Entellan</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td align="right" style="width:344px;">107960</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Ethanol</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td style="width:344px;">1.00983.1000</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Gelatin</td>
			<td style="width:200px;">Synth</td>
			<td style="width:344px;">00G1002.02.AE</td>
			<td style="width:505px;">Used for coating slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SM2010R</td>
			<td>Equipped with Freezing Stage (BFS-10MP, Physiotemp), set to -40&#186;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal Donkey Serum</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">158127</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit)</td>
			<td>GE</td>
			<td>NA934-1ML</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Slides (Star Frost)</td>
			<td>Knittel Glaser</td>
			<td></td>
			<td>Gelatin coated slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td style="width:200px;">Vetec</td>
			<td>60REAVET017050</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Vectastain ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard)</td>
			<td style="width:200px;">Vector</td>
			<td style="width:344px;">PK-4000, Kit Standard</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Xylene</td>
			<td style="width:200px;">Synth</td>
			<td style="width:344px;">01X1001.01.BJ</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

short-term free-floating slice cultures from the adult human brain

Organotypische, oder Scheibenkulturen, wurden weit verbreitet verwendet, um Aspekte des zentralen Nervensystems zu modellieren, das in vitro funktioniert. Trotz des Potenzials von Schnittkulturen in der Neurowissenschaft sind Studien, die erwachsenes Nervengewebe zur Vorbereitung solcher Kulturen verwenden, immer noch rar, insbesondere solche von menschlichen Probanden. Die Verwendung von erwachsenem menschlichem Gewebe zur Vorbereitung von Scheibenkulturen ist besonders attraktiv, um das Verständnis menschlicher Neuropathologien zu verbessern, da sie einzigartige Eigenschaften besitzen, die typisch für das reife menschliche Gehirn sind, das an Scheiben aus Nagetieren fehlt (in der Regel neonatal) Nervengewebe. Dieses Protokoll beschreibt, wie Man Gehirngewebe von lebenden menschlichen Spendern gesammelt verwendet, um resekttive Gehirnchirurgie zur Vorbereitung kurzfristiger, frei schwebender Scheibenkulturen. Es werden auch Verfahren zur Aufrechterhaltung und Durchführung biochemischer und zellbiologischer Assays mit diesen Kulturen vorgestellt. Repräsentative Ergebnisse zeigen, dass die typische kortikale Kaschierung des Menschen nach 4 Tagen in vitro (DIV4) in Scheiben konserviert wird, wobei die Hauptanzahl der neuronalen Zelltypen zu erwarten ist. Darüber hinaus erleiden Scheiben bei DIV4 einen robusten Zelltod, wenn sie mit einem toxischen Reiz herausgefordert werden (H2O2), was auf das Potenzial dieses Modells hindeutet, als Plattform in Zelltod-Assays zu dienen. Diese Methode, eine einfachere und kostengünstigere Alternative zum weit verbreiteten Protokoll mit Membraneinsätzen, wird hauptsächlich für die Durchführung von kurzfristigen Assays empfohlen, die darauf abzielen, Mechanismen der Neurodegeneration hinter altersbedingten Hirnerkrankungen zu entwirren. Obwohl das Protokoll der Verwendung von kortikalem Gewebe gewidmet ist, das von Patienten gesammelt wurde, die zur chirurgischen Behandlung einer pharmakoresistenten temporalen Lappenepilepsie eingereicht wurden, wird argumentiert, dass Gewebe, das aus anderen Hirnregionen/-bedingungen gesammelt wurde, auch als Quellen betrachtet werden, um ähnliche frei schwebende Scheibenkulturen zu erzeugen.

Ein kritischer Aspekt, um die Qualität und Gesundheit von kultivierten Scheiben zu bewerten, ist das Vorhandensein und die typische Morphologie der erwarteten neuronalen Zelltypen, Neuronen und Gliazellen. Die typische Architektur der menschlichen kinetischen Laminierung wurde in einer Scheibe bei DIV4 beobachtet, die durch neuronale Immunlabelierung(Abbildung 2D) offenbart wurde. Darüber hinaus wurde auch das erwartete Vorhandensein von Mikroglia und Astroglia (<strong cl...

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Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain

Ein Protokoll zur Vorbereitung frei schwebender Scheibenkulturen aus dem erwachsenen menschlichen Gehirn wird vorgestellt. Das Protokoll ist eine Variation der weit verbreiteten Slice-Kultur-Methode mit Membraneinsätzen. Es ist einfach, kostengünstig und wird für die Durchführung von kurzfristigen Assays empfohlen, die darauf abzielen, Mechanismen der Neurodegeneration hinter altersbedingten Hirnerkrankungen zu entwirren.

Kurzfristig frei schwebende Scheibenkulturen aus dem erwachsenen menschlichen Gehirn

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of ...

Wir präsentieren ein Protokoll zur Vorbereitung frei schwebender Scheibenkulturen aus Hirngewebe, das von lebenden menschlichen Spendern gesammelt wurde, die einer resekttiven Gehirnoperation unterzogen wurden. Diese Kultur ist für biochemische und zellbiologische Assays oder Immunhistochemie geeignet. Es wird erwartet, dass zur Aufklärung des Mechanismus, der Neurodegeneration bei assoziierten Gehirnerkrankungen.Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie eine einfachere und kostengünstigere Alternative zum klassischen Slice-Kultur-Protokoll mit Membraneinsätzen ist. Obwohl das Gesamtprotokoll nicht komplex ist, lassen sich einige Schritte wie die Entfernung von Meningen, das Verkleben des Gewebes an der Vibram-Probenscheibe und die Resektion für die Immunhistochemie am besten verstehen, wenn sie visuell demonstriert werden. Mit helfen, das Verfahren zu demonstrieren, werden Niele Mendes und Glaucia Almedia, die Grad-Studenten sind, und Giovanna Nogueira, eine weitere Studentin.Um dieses Verfahren zu beginnen, fügen Sie Salz zu einem Eimer Eis hinzu. Übertragen Sie die Schneidlösung auf diesen Eimer und lassen Sie sie mindestens 20 Minuten vor dem Gebrauch unter Carbogen-Mischung sprudeln. Als nächstes bereiten Sie einen Block von 3%Agarose, die etwa zwei Zentimeter mal zwei Zentimeter mal zwei Zentimeter ist.Super kleben Sie den Agarose-Block an die Vibram-Probenscheibe, um eine zusätzliche mechanische Unterstützung der Gewebeprobe beim Schneiden zu schaffen. Legen Sie beim Vibratom die Schnittdicke auf 200 Mikrometer, die Schwingungsfrequenz auf 100 Hertz fest, und wählen Sie eine Schnittgeschwindigkeit zwischen 0,5 und 1,0 Millimeter pro Sekunde. Verriegeln Sie dann die Vibram-Pufferschale an der Vibrammebasis und fügen Sie Eis hinzu, um sie vor Erhalt der Schneidlösung und der Probe und während des gesamten Schneidvorgangs gekühlt zu halten.Richten Sie zunächst ein Transportgerät ein, das aus einer tragbaren Gasflasche besteht, die ein Anmischgemisch mit Carbogen enthält, das mit einem Druckflussventil verbunden ist, das die Gasleistung steuert, die mit Silikonschläuchen verbunden ist, die diese Gasleistung mit dem Transportbehälter und dem Transportbehälter verbinden, der die Transportlösung und das Eis für die Probenkühlung während des Transports enthält. Sammeln und transportieren Sie das Exemplar und transportieren Sie, wie im Textprotokoll beschrieben. Die Probe in eine Petrischale mit Schneidlösung geben.Mit feinen chirurgischen Werkzeugen, sorgfältig entfernen Sie so viel der verbleibenden Meningen wie möglich. Wählen Sie die beste Probenausrichtung für die Herstellung von Scheiben mit den besonderen Eigenschaften des experimentellen Designs und verwenden Sie eine Skalpellklinge mit der Nummer 24, um eine flache Oberfläche als Basis zu trimmen, die auf die Probenscheibe geklebt wird. Mit einem Entsorgungslöffel und filigranen Pinsel, sammeln Sie das Fragment aus der Petrischale und trocknen überschüssige Lösung mit Filterpapier.Als nächstes verwenden Sie Superkleber, um das Gewebe an der Vibram-Probenschale zu befestigen, bis es fest an der Schale und in Kontakt mit dem Agarose-Block befestigt ist. Legen Sie die Vibram-Probenscheibe in die Vibratom-Pufferschale. Verriegeln Sie den Messerhalter mit fest fest an der Rasierklinge.Fügen Sie eine Schneidlösung hinzu und stellen Sie sicher, dass sie sowohl die Probe als auch die Klinge bedeckt. Dann beginnen Sie, die Probe in 200 Mikrometer Scheiben zu schneiden. Übertragen Sie die Scheiben aus der Pufferschale in eine Petrischale, die eine Schneidlösung enthält, und schneiden Sie lose Kanten und überschüssige weiße Materie auf einen Anteil von ca. 70% Kortex und 30% weißer Materie.In einem laminaren Strömungsschrank 600 Mikroliter Kulturmedium zu jedem Brunnen einer 24-Well-Platte hinzufügen und bei 36 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid mindestens 20 Minuten vor dem Beschichten der Scheiben brüten. Danach verwenden Sie einen Pinsel, um eine Scheibe in jedem Brunnen zu verblechen. Wenn sich ungenutzte Brunnen in der Platte befinden, füllen Sie sie mit 400 Mikroliter sterilem Wasser.Inkubieren Bei 36 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Ergänzen Sie 10 Milliliter des zuvor vorbereiteten Kulturmediums mit einem neurotrophen Faktor des Gehirns bei einer Konzentration von 50 Nanogramm pro Milliliter. Nach acht bis 16 Stunden 333 Mikroliter des konditionierten Mediums aus jedem Brunnen entfernen und 133 Mikroliter frisches BDNF-Ergänzungsmedium hinzufügen.Ersetzen Sie alle 24 Stunden ein Drittel des konditionierten Mediums durch frisches BDNF-Ergänzungsmedium. Übertragen Sie zunächst die Scheiben aus den Brunnen, die Kulturmedium enthalten, auf eine neue 24-Well-Platte, die PBS enthält. Entfernen Sie die PBS aus jedem Brunnen und ersetzen Sie sie durch einen Milliliter 4%Paraformaldehyd.Über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Am nächsten Tag das Paraformaldehyd vorsichtig aus den Brunnen entfernen und durch einen Milliliter 30%Saccharoselösung ersetzen. 48 Stunden lang bei vier Grad Celsius inkubieren.Nach 48 Stunden stellen Sie das gefrierende Mikrotome auf negative 40 Grad Celsius. Bereiten Sie eine Saccharosebasis auf der Mikrotome-Stufe vor, auf der die Scheiben platziert werden sollen. Nachdem es vollständig eingefroren ist, schneiden Sie einen Teil der gefrorenen Saccharose, um eine flache Oberfläche zu produzieren, auf der die Scheibe platziert wird.Als nächstes legen Sie jede Scheibe über eine gestreckte Kunststofffolie und verwenden Sie einen Pinsel, um das Gewebe abzuflachen. Übertragen Sie die gestreckte Scheibe in einem zugweise auf die gefrorene Saccharosebasis. Nachdem die Scheibe fünf bis zehn Minuten zum Einfrieren ausgeruht ist, schneiden Sie die Scheibe in 30 Mikrometer Abschnitte.Übertragen Sie die 30 Mikrometer-Abschnitte auf eine Petrischale, die PBS enthält, und fahren Sie mit einem Histologieprotokoll fort, das für das experimentelle Design geeignet ist. Bei der Bestimmung der Qualität und Gesundheit von kultivierten Scheiben ist ein kritischer Aspekt, der zu bewerten ist, das Vorhandensein und die typische Morphologie der erwarteten neuronalen Zelltypen, Neuronen und Gliazellen. Die typische Architektur der menschlichen kortikalen Laminierung wird in einer Scheibe am Tag in vitro vier durch neuronale Immunlabeling offenbart beobachtet.Darüber hinaus wird auch die erwartete Anwesenheit von Mikroglia und Astroglia beobachtet. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Gewebearchitektur weder durch den chirurgischen Eingriff, die Probenverarbeitung noch durch die kurzfristige Phase in vitro signifikant beeinflusst wird. Die neuronale Reaktion auf Kaliumchlorid-induzierte Depolarisation wurde auch in kultivierten Scheiben nach ERK-Phosphorylierung quantifiziert.Interessanterweise ist eine deutliche Zunahme der ERK-Phosphorylierung in Kaliumchlorid-behandelten Scheiben am Tag in vitro vier zu beobachten. Schließlich wird die Reaktion von Scheiben am Tag in vitro vier auf eine toxische Herausforderung mit einem bekannten oxidativen Stressinduktor Wasserstoffperoxid bewertet. Die Exposition der Scheiben in 300 Millimolar Wasserstoffperoxid für 24 Stunden führte zu einer robusten Abnahme der MTT-Reduktion.Zusammengenommen deuten der massive Zelltod, der in Tag in vitro fünf Scheiben nach der Wasserstoffperoxid-Herausforderung beobachtet wurde, und die Ergebnisse der Kaliumchlorid-induzierten Depolarisation auf die erhaltene allgemeine Gesundheit von Scheiben am Tag in vitro vier, die auf einen toxischen Reiz wie oxidativen Stress reagieren. Dieses Protokoll ist hauptsächlich Studien gewidmet, die auf Mehr-Wochen-Tests basieren, wie z. B. der Untersuchung molekularer Mechanismen der Neurotoxizität und des Neuroprotektionsmechanismus durch Kandidatenmedikamente. Obwohl dieses Protokoll der Verwendung von kortikalem Gewebe gewidmet ist, das von Patienten gesammelt wurde, die einer chirurgischen Behandlung für mikroresistente temporale Lappenepilepsie unterzogen wurden, ist es wahrscheinlich, dass Gewebe, das aus anderen Hirnregionen oder -bedingungen gesammelt wird, auch Quellen sein könnte, um frei schwebende Scheibenkulturen zu produzieren.Slice-Kulturen aus erwachsenen menschlichen Gehirn kann schlüsselin sein, um unser Verständnis der menschlichen Neuropathologien aufgrund ihrer einzigartigen zellulären Schaltung und molekularen Maschinerie fehlt in Scheiben aus Nagetier Gehirn produziert.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Forschung

Neurowissenschaften

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