Name: short-term free-floating slice cultures from the adult human brain
Uploaded: 2019-11-05T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי FAPESP (גרנט 25681-3/2017 ל-AS), גלימות (פוסט דוקטורט מלגת PNPD/INCT-HSM כדי A.F. ו-דוקטורט מלגת N.D.M.) ו FAEPA. G.M.A. מחזיקה מלגת מאסטר מ FAPESP (MS 2018/06614-4). N.G.C. מחזיקה מלגת מחקר CNPq. אנו מודים למטופלים ולמשפחותיהם על תרומת הרקמה החוזרת למחקר זה. היינו רוצים להכיר בתמיכה של תושבים, אחיות, טכנאים, וצוות CIREP, מבית החולים הקליני בבית הספר לרפואה-ריבייראו פרטו, אוניברסיטת סאו פאולו, מי עזר בשלבים שונים של התהליך.

מבוגרים לחיות רקמות המוח הושגו מחולים שעברו כירורגי resective לטיפול של אפילפסיה האונה הרקתית הטמפורלית (איור 1א). כל ההליכים אושרו על ידי ועדת האתיקה מבית החולים לקליניקות בבית הספר לרפואה-ריבייראו פרטו (17578/2015), וחולים (או האדם האחראי עליהם) הסכימו וחתמו על תנאי ההסכמ?...

פרוטוקול זה להפקת תרבות פרוסה בחינם, לטווח קצר, היא שיטה חלופית לפרוסות בוגרות של האדם האנושי. פרוטוקול כזה עבור תרבויות פרוסה עשוי להיות קל למחקרים על (אבל לא מוגבל) אלקטרואופטיקה1,44,45, אלקטרופיזיולוגיה2,3<su...

השימוש בדגימות אנושיות במחקר הוא באופן חד-משמעי אפשרות גדולה ללמוד פתווגיות המוח האנושי, טכניקות מודרניות פתחו דרכים חדשות לניסויים חזקים ומוסריים באמצעות רקמת החולה הנגזר. שיטות כמו תרבויות אורגאוטימית/פרוסה שהוכנו ממוח אנושי מבוגר שימשו יותר ויותר בתבניות כגון אלקטרואופטיקה1, אלקטרופיזיולוגיה2,3,4,5, פלסטיות 6,7,8,9, רעילות נוירו/הגנהעצבית 10,11,12,13, טיפול בתאים14, הקרנת סמים15,16,17, גנטיקה, ועריכת גנים12,18,19,20, בין היתר, כאסטרטגיה לטוב יותר הבנת מחלות נוירולוגיות במהלך הבגרות.
הבנת המנגנונים המשמשים לפתווגיות המוח האנושי תלויה באסטרטגיות נסיוניות הדורשות מספר רב של נושאים. לעומת זאת, במקרה של תרבויות פרוסה, למרות הגישה לדגימות אנושיות עדיין קשה, את האפשרות של הפקת עד 50 פרוסות ממדגם קליפת גוף אחת באופן חלקי הדרישה של גיוס מתנדבים מרובים על ידי הגדלת ה מספר המשכפלת והביצוע המתבצע לפי רקמה21.
מספר פרוטוקולים לתרביות ממוח/פרוסה מתוארים, החל בטיוטות קלאסיות של האוליים22,23 לצינור רולר24,25,26, ממברנות למחצה , ממשק27,28,29,30. ופרוסות חופשיות31,32 בהתאם לקצוות של תכנון ניסיוני, לכל טכניקה יש יתרונות וחסרונות משלה. לטווח קצר, תרבויות חופשיות צפה מהמוח האנושי הוא במקרים מסוימים יתרון על השיטה בשימוש על ידי Stoppini ואח '27, אם בהתחשב בעובדה כי למרות הישרדות תאים ארוכי טווח בתוך מבחנה היא בדרך כלל דאגה עיקרית בעת הערכת שיטת תרבות, בניסויים רבים רק פרקי זמן קצרים בתרבות נדרשים12,31,32,33,34,35. בתנאים אלה, השימוש בתרבויות חופשיות-צף מציג את היתרון של להיות פשוט יותר וחסכוני יותר, כמו גם מדויק יותר הדומה למצב רקמת האדם המקורי מאשר פרוסות שנשמרו בתרבות במשך 2-3 שבועות.
למרות הפוטנציאל של תרבויות הפרוסה למדעי המוח, מחקרים המשתמשים ברקמת העצבים הבוגרת להכנת התרבויות הללו עדיין נדירים, בעיקר מנושאים אנושיים. מאמר זה מתאר פרוטוקול להשתמש ברקמת המוח שנאסף מתורמים אנושיים חיים שהוגשו לניתוח מוח מחדש כדי להכין תרבויות הפרוסה צף חופשי. הליכים לתחזוקה ולביצוע ביולוגיה ביוכימית ובביולוגיה תאית מפורטים באמצעות התרבויות הללו. פרוטוקול זה הוכח ערך לניתוח כדאיות ותפקוד עצבי בחקירות על מנגנונים של נוירופתוגיות המקושרים לבגרות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1571px;" width="1570">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">2-Propanol</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td style="width:344px;">1096341000</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Acrylamide/Bis-Acrylamide, 30% solution</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">A3449&#160;</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Ammonium persulfate</td>
			<td style="width:200px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">A3678-25G</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Amphotericin B</td>
			<td style="width:200px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">15290-018</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Antibody anti-ERK 2 (rabbit)</td>
			<td>Santa Cruz Biotecnology</td>
			<td>sc-154</td>
			<td>Dilution 1:1,000 in BSA 2.5%</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Antibody anti-pERK (mouse)</td>
			<td>Santa Cruz Biotecnology</td>
			<td>sc-7383</td>
			<td>Dilution 1:1,000 in BSA 2.5%</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BDNF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SRP3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">A7906</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Bradford 1x Dye Reagent</td>
			<td style="width:200px;">BioRad</td>
			<td style="width:344px;">500-0205</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">EDTA</td>
			<td style="width:200px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">T3924</td>
			<td style="width:505px;">Used in RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hank&#39;s Balanced Salts</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H1387-10X1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hepes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td style="width:344px;">1003171000</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Hydrogen Peroxide (H2O2)</td>
			<td style="width:200px;">Vetec</td>
			<td align="right" style="width:344px;">194</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (anti-mouse)</td>
			<td style="width:200px;">GE</td>
			<td style="width:344px;">NA931-1ML</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">NaCl</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td align="right" style="width:344px;">1064041000</td>
			<td style="width:505px;">Used in RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Neurobasal A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10888-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Non-fat dry milk (Molico)</td>
			<td style="width:200px;">Nestl&#233;</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">Used for membrane blocking</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">PBS Buffer pH 7,2</td>
			<td>Laborclin</td>
			<td align="right">590338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicilin/Streptomicin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:521px;">Potassium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td align="right">1049361000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:521px;">Prime Western Blotting Detection Reagent</td>
			<td style="width:200px;">GE</td>
			<td style="width:344px;">RPN2232</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit)</td>
			<td>GE</td>
			<td>NA934-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:521px;">SDS</td>
			<td style="width:200px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">L5750</td>
			<td style="width:505px;">Used in RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:521px;">TEMED</td>
			<td style="width:200px;">GE</td>
			<td style="width:344px;">17-1312-01</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Tris</td>
			<td style="width:200px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">T-1378</td>
			<td style="width:505px;">Used in RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:521px;">Triton x-100</td>
			<td style="width:200px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">X100</td>
			<td style="width:505px;">Used in RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:521px;">Ultrapure Water</td>
			<td style="width:200px;">Millipore</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">Sterile water, derived from MiliQ water purification system</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:521px;">Equipment and Material</td>
			<td style="width:200px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:50px;">24-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CL S3526</td>
			<td>Flat Bottom with Lid</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;">Amersham Potran Premium (nitrocellulose membrane)&#160;</td>
			<td>GE</td>
			<td>29047575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:521px;">Carbogen Mixture</td>
			<td style="width:200px;">White Martins</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">95% O2, 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:46px;width:521px;">CO2 incubator</td>
			<td style="width:200px;">New Brunswick Scientific</td>
			<td style="width:344px;">CO-24</td>
			<td style="width:505px;">Incubation of slices 5% CO2, 36&#186;C</td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;width:521px;">Microplate Reader</td>
			<td style="width:200px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:521px;">Microtubes</td>
			<td style="width:200px;">Greiner</td>
			<td style="width:344px;">001608</td>
			<td style="width:505px;">1,5mL microtube</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:521px;">Motorized pestle</td>
			<td style="width:200px;">Kimble Chase</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:521px;">Plastic spoon</td>
			<td style="width:200px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">Size of a dessert spoon</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:521px;">Razor Blade</td>
			<td style="width:200px;">Bic</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">Chrome Platinum, used in slicing with vibratome</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:37px;width:521px;">Scalpel Blade</td>
			<td style="width:200px;">Becton Dickinson (BD)</td>
			<td style="width:344px;">Number 24</td>
			<td style="width:505px;">Used for slicing of tissue; recommended same size or smaller</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:34px;width:521px;">Superglue (Loctite Super Bonder)</td>
			<td style="width:200px;">Henkel</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">Composition: Etilcianoacrilato; 2-Propenoic acid; 6,6&#39;-di-terc-butil-2,2&#39;-metilenodi-p-cresol; homopolymer</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;">Vibratome&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14047235612 - VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:37px;width:521px;">Name of Material/ Equipment for Immunohistochemistry</td>
			<td style="width:200px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:41px;">Antibody anti-NeuN (mouse)</td>
			<td>Millipore&#160;</td>
			<td>MAB377</td>
			<td>Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:521px;">Antibody anti-GFAP (mouse)</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td style="width:344px;">MAB360</td>
			<td>Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Antibody anti-Iba1 (rabbit)</td>
			<td style="width:200px;">Abcam</td>
			<td style="width:344px;">EPR16588 - ab178846</td>
			<td>Dilution 1:2,000 in Phosphate Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Biotinylated anti-mouse IgG Antibody (H+L)</td>
			<td style="width:200px;">Vector</td>
			<td style="width:344px;">BA-9200</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">DAB</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">D-9015</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Entellan</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td align="right" style="width:344px;">107960</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Ethanol</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td style="width:344px;">1.00983.1000</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Gelatin</td>
			<td style="width:200px;">Synth</td>
			<td style="width:344px;">00G1002.02.AE</td>
			<td style="width:505px;">Used for coating slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SM2010R</td>
			<td>Equipped with Freezing Stage (BFS-10MP, Physiotemp), set to -40&#186;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal Donkey Serum</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">158127</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit)</td>
			<td>GE</td>
			<td>NA934-1ML</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Slides (Star Frost)</td>
			<td>Knittel Glaser</td>
			<td></td>
			<td>Gelatin coated slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td style="width:200px;">Vetec</td>
			<td>60REAVET017050</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Vectastain ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard)</td>
			<td style="width:200px;">Vector</td>
			<td style="width:344px;">PK-4000, Kit Standard</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Xylene</td>
			<td style="width:200px;">Synth</td>
			<td style="width:344px;">01X1001.01.BJ</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

short-term free-floating slice cultures from the adult human brain

תרבויות אורגנוטיפקס, או פרוסות, הועסקו באופן נרחב בהיבטים של מערכת העצבים המרכזית הפועלת בתחומי החוץ הגופית. למרות הפוטנציאל של תרבויות הפרוסה במדעי המוח, מחקרים המשתמשים ברקמת העצבים הבוגרת כדי להכין תרבויות כאלה עדיין נדירים, בעיקר אלה מתוך הנתינים האנושיים. השימוש ברקמת האדם המבוגר להכנת תרבויות הפרוסה אטרקטיבי במיוחד כדי לשפר את ההבנה של הנוירולוגיה האנושית, כאשר הם מחזיקים במאפיינים ייחודיים האופייניים למוח האנושי הבוגר חסר בפרוסות מכרסמים (בדרך כלל בעלי חיים) רקמת העצבים פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש ברקמת המוח שנאספו מתורמים אנושיים חיים שהוגשו לניתוח מוח מחדש כדי להכין את התרבויות לטווח קצר, בחינם צף תרביות פרוסה. הליכים לתחזוקה וביצוע ביולוגיה ביוכימית ובביולוגיה סלולרית מוצגים גם הם. התוצאות הייצוגיות מדגימות כי הדבקת קליפת הגוף האנושית הטיפוסית נשמרת בפרוסות לאחר 4 ימים במבחנה (DIV4), עם הנוכחות הצפויה של סוגי התא העצבי הראשי. יתר על כן, פרוסות ב DIV4 לעבור מוות תאים חזקים כאשר מאותגרים עם גירוי רעיל (H2O2), המציין את הפוטנציאל של מודל זה לשמש פלטפורמה במוות תאים assays. שיטה זו, חלופה פשוטה וחסכונית לפרוטוקול בשימוש נרחב באמצעות מוסיף ממברנה, מומלץ בעיקר להפעלת בחני לטווח קצר שמטרתו לפענח מנגנונים של ניוון שמאחורי הגיל מחלות המוח הקשורות. לבסוף, למרות הפרוטוקול מוקדש באמצעות רקמה קורטיקלית שנאסף מחולים שהוגשו טיפול כירורגי של אפילפסיה האונה הרקתית הטמפורלית, זה נטען כי הרקמה שנאספו מאזורים אחרים במוח/תנאים צריך גם להיות נחשבים למקורות להפקת תרביות פרוסה חופשיות דומות.

היבט קריטי כדי להעריך את האיכות והבריאות של פרוסות המתורבתות היא הנוכחות והמבנה האופייני של סוגי תאים עצביים צפוי, נוירונים, ותאי גליה. האדריכלות הטיפוסית של הדבקת קליפת הגוף האנושית נצפתה בפרוסה ב-DIV4, שנחשפה על ידי אימונוולטילינג עצבי (איור 2ד). בנוסף, הנוכחות הצפ...

Watch this Scientific Journal Video about Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain at JoVE.com

Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain

פרוטוקול להכין תרביות פרוסות חופשיות מן המוח האנושי המבוגר מוצג. הפרוטוקול הוא וריאציה של שיטת תרבות הפרוסה הנפוצה בשימוש באמצעות מוסיף ממברנה. זה פשוט, חסכוני, ומומלץ להפעלת בחני לטווח קצר שמטרתו לפענח מנגנונים של נוירוניוון מאחורי הגיל הקשורים מחלות המוח.

לטווח קצר-מתרבות פרוסה שצפה בחינם מהמוח האנושי המבוגר

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of ...

אנו מציגים פרוטוקול להכנת תותבי פרוסה צפים חופשיים מרקמה מוחית שנאספו מתורמים אנושיים חיים שהוגשו לניתוח מוח מכתשי. תרבות זו נוחה לביצוע בדיקות ביוכימיות וביולוגיה של התא או אימונוהיסטוכימיה. הוא צפוי לתרום להבהרה של המנגנון שבבסיס ניוון עצבי במחלות מוח הקשורות.היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שזה חלופה פשוטה וחסכונית לפרוטוקול תרבות פרוסה קלאסי באמצעות מוסיף קרום. למרות הפרוטוקול הכולל אינו מורכב, כמה צעדים כגון הסרת קרום המוח, הדבקת הרקמה לדיסק דגימת רטט, ו resection עבור immunohistochemistry מובנים בצורה הטובה ביותר כאשר הפגינו חזותית. עוזרים להדגים את ההליך יהיו ניל מנדס וגלאוסיה אלמדיה שהם סטודנטים לתואר שני, וג'ובאנה נוגיירה, סטודנטית נוספת לתואר שני.כדי להתחיל בהליך זה, מוסיפים מלח לדלי קרח. מעבירים את פתרון הסיום לדלי זה ולתת לו לנוח תחת תערובת קרבוגן מבעבע לפחות 20 דקות לפני השימוש. לאחר מכן, הכינו גוש של 3% על שני ס"מ בשני סנטימטרים בשני סנטימטרים.הדבק סופר בלוק אגרוז לדיסק דגימת רטט על מנת ליצור תמיכה מכנית נוספת לדגימת הרקמה במהלך חיתוך. על הרטט, הגדר את עובי החלק ל-200 מיקרומטר, את תדר הרטט ל-100 הרץ, ובחר מהירות חיתוך בין 0.5 ל-1.0 מילימטרים לשנייה. לאחר מכן נעל את מגש חיץ הרטט לבסיס הרטט והוסף קרח כדי לשמור אותו בקירור לפני קבלת פתרון ההפחתה ואת הדגימה ולאורך כל הליך ההפחתה.ראשית, להקים מנגנון תחבורה המורכב גליל גז נייד המכיל תערובת קרבוגן מחובר שסתום שטף לחץ השולט על תפוקת הגז מחובר צינורות סיליקון המחבר את תפוקת הגז לכלי התחבורה ואת כלי התחבורה המכיל את פתרון ההובלה וקרח לקירור מדגם במהלך ההובלה. אסוף והעבר את הדגימה וההובלה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. מעבירים את הדגימה לצלחת פטרי המכילה פתרון חיתוך.באמצעות כלים כירורגיים עדין, להסיר בזהירות כמה שיותר של קרום לב הנותרים ככל האפשר. בחר את כיוון הדגימה הטוב ביותר לייצור פרוסות עם המאפיינים הספציפיים של העיצוב הניסיוני ולהשתמש מספר 24 להב אזמל לקצץ משטח שטוח להיות הבסיס כי יהיה מודבק לדיסק הדגימה. בעזרת כף פלסטיק סילוק ומברשות צבע עדינות, אוספים את השבר מצלחת פטרי ומייבשים את התותב העודף בנייר סינון.לאחר מכן, השתמש דבק סופר כדי לחבר את הרקמה לצלחת דגימת רטט עד שהוא דבק היטב את המנה במגע עם בלוק אגרוז. מניחים את דיסק דגימת הרטט במגש מאגר הרטט. נעל את מחזיק הסכין במקום עם סכין הגילוח קבוע היטב.הוסף פתרון חיתוך וודא שהוא מכסה הן את הדגימה והן את הלהב. ואז להתחיל לחתוך את הדגימה לתוך 200 פרוסות מיקרומטר. מעבירים את הפרוסות ממגש החיץ לצלחת פטרי המכילה פתרון חיתוך וחותכים את כל הקצוות הרופפים ואת החומר הלבן העודף לחלק של כ-70% קליפת המוח ו-30% חומר לבן.בארון זרימה למינארי, מוסיפים 600 מיקרוליטרים של תרבות בינוניים לכל באר של צלחת 24 בארות ודגירה ב 36 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני לפחות 20 דקות לפני ציפוי הפרוסות. לאחר מכן, השתמשו במברשת צבע כדי לצבוע פרוסה אחת בכל באר. אם יש בארות שאינן שימוש בצלחת, למלא אותם עם 400 microliters של מים סטריליים.דגירה ב 36 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. תוספת 10 מיליליטר של מדיום תרבות שהוכן בעבר עם המוח נגזר גורם נוירוטרופי בריכוז של 50 ננוגרם למיליליטר. לאחר שמונה עד 16 שעות, הסר 333 מיקרוליטרים של המדיום הממוזג מכל באר והוסף 133 מיקרוליטרים של BDNF טרי בתוספת בינונית.החלף שליש מהמדיום המותנה במדיום BDNF טרי בתוספת BDNF כל 24 שעות. ראשית, מעבירים את הפרוסות מה בארות המכילות מדיום תרבות לצלחת חדשה בת 24 בארות המכילה PBS. הסר את PBS מכל באר ולהחליף אותו עם מיליליטר אחד של 4%paraformaldehyde.דגירה לילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, להסיר בזהירות את paraformaldehyde מן הבארים ולהחליף אותו עם מיליליטר אחד של 30% פתרון סוכרוז. דגירה בארבע מעלות צלזיוס במשך 48 שעות.לאחר 48 שעות, הגדר את המיקרוטום המקפיא ל-40 מעלות צלזיוס שליליות. הכינו בסיס סוכרוז על שלב המיקרוטום שבו יש להציב את הפרוסות. לאחר שהוא קפוא לחלוטין, לחתוך חלק סוכרוז קפוא לייצר משטח שטוח שעליו הפרוסה תונח.לאחר מכן, מניחים כל פרוסה על סרט פלסטיק מתוח ולהשתמש מכחול כדי לשטח את הרקמה. במהלך אחד, מעבירים את הפרוסה המתוחה לבסיס סוכרוז הקפוא. לאחר שהפרוסה נחה במשך חמש עד עשר דקות כדי להקפיא כראוי, חותכים את הפרוסה ל-30 מקטעי מיקרומטר.מעבירים את 30 חלקי המיקרומטר לצלחת פטרי המכילה PBS וממשיכות לפרוטוקול היסטולוגיה ההולם את התכנון הניסיוני. בעת קביעת האיכות והבריאות של פרוסות מתורבתות, היבט קריטי שיש להעריך הוא נוכחות ומורפולוגיה טיפוסית של סוגי התאים העצביים הצפויים, נוירונים ותאי גליה. הארכיטקטורה האופיינית של למינציה קליפת המוח האנושית נצפתה בפרוסה ביום במבחנה ארבע מתגלה על ידי immunolabeling עצבי.בנוסף, נוכחות צפויה של microglia ואסטרוגליה הוא ציין גם. תוצאות אלה מראות כי ארכיטקטורת רקמות אינה מושפעת באופן משמעותי גם על ידי ההליך הכירורגי, עיבוד המדגם, או על ידי תקופה לטווח קצר במבחנה. התגובה העצבית לדפולריזציה הנגרמת על ידי אשלגן כלורי כומתה גם בפרוסות מתורבתות על ידי מעקב אחר זרחון ERK.מעניין, עלייה ברורה זרחון ERK נראה פרוסות אשלגן כלורי מטופלים ביום במבחנה ארבע. לבסוף, התגובה של פרוסות ביום במבחנה ארבע לאתגר רעיל מוערך עם סטרס חמצוני ידוע inducer מי חמצן. חשיפת הפרוסות למי חמצן של 300 מילימולאר למשך 24 שעות הובילה לירידה חזקה בהפחתת MTT.יחד, המוות התאי המסיבי שנצפה ביום במבחנה חמש פרוסות לאחר אתגר מי חמצן ואת תוצאות depolarization הנגרמת אשלגן כלורי להצביע על הבריאות הכללית השתמר של פרוסות ביום במבחנה ארבע אשר מגיבים לגירוי רעיל כגון מתח חמצוני. פרוטוקול זה מוקדש בעיקר למחקרים המבוססים על בדיקות הנמשך יותר משבוע כגון חקירת מנגנונים מולקולריים של נוירוטוקסיות והגנה עצבית על ידי תרופות מועמדות. למרות פרוטוקול זה מוקדש לשימוש ברקמה קליפת המוח שנאספו מחולים שהוגשו לטיפול כירורגי עבור אפילפסיה האונה הרקתית עמיד מיקרו, סביר להניח כי רקמות שנאספו מאזורים אחרים במוח או תנאים יכול להיות גם מקורות לייצר תרבות פרוסה צף חופשי.תרבויות פרוסה מהמוח האנושי הבוגר עשויות להיות המפתח לקידום ההבנה שלנו של נוירופתולוגיות אנושיות בשל המעגלים התאיים הייחודיים שלהם ומכונות מולקולריות חסרות פרוסות המופקות ממוח מכרסמים.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

Organotypic Slice תרבויות בהיפוקמפוס

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

הניתוח של מורפולוגיה דנדריטים סלולרי פורקינג&#39; בתרבויות Slice Organotypic

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

שושלת תכנות מחדש של תאי שמקורם בpericyte של המוח האנושי למבוגרים לנוירונים מושרה

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

תרבויות Organotypic Slice ניתוח של עצבים וכלי דם שיפוץ בEntorhino-היפוקמפוס

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Slice It Hot: Acute Adult Brain Slicing in Physiological Temperature

פורסים אותו חם: אקוטי למבוגרים מוח חיתוך בטמפרטורה פיזיולוגית

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

הכנת תרבויות גליה מעורבת ראשיים מרקמות קורד למבוגרים עכבר השדרה

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors

תורם גזירת תרבויות Leptomeninges explant מן לאחר מות המוח האנושי

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

דור פשוטה של תרבות תשואה גבוהה של נוירונים המושרה מ Fibroblasts עור מבוגר

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures

Immunostaining של Myelinating Organotypic פרוסה אסטרוציטומה תרבויות והכנה

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical ...

Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay

מיקוד אלפא Synuclein אגרגטים בתוך עורית היקפיים סיבים עצביים על ידי Free-צפה אימונוofלואונסנציה החופשית

To date, for most neurodegenerative diseases only a post-mortem histopathological definitive diagnosis is available. For Parkinson&#39;s disease (PD), the ...