Name: short-term free-floating slice cultures from the adult human brain
Uploaded: 2019-11-05T13:30:00
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この作品は、FAPESP(グラント25681-3/2017からAS)、CAPES(ポストドクターフェローシップPNPD/INCT-HSMからA.F.、博士前フェローシップからN.D.M.)、FAEPAによってサポートされています。G.M.A.はFAPESP(MS 2018/06614-4)から修士号を取得しています。N.G.C.はCNPqリサーチフェローシップを開催しています。我々は、この研究のために切除された組織を寄付してくれた患者とその家族に感謝する。サンパウロ大学リベイラン・プレト医科大学臨床病院の住民、看護師、技術者、CIREPチームの支援を受け付けています。

生きた成人脳組織は、薬剤耐性側頭葉てんかんの治療のために切除神経外科手術を受けている患者から得られた(図1A)。すべての手続きは、リベイラン・プレト医科大学(17578/2015)の診療所病院の倫理委員会によって承認され、患者(またはその法的責任者)は、インフォームド・コンセント条項に同意し、署名しました。組織の収集は、てんかん手術センター(C...

自由浮遊、短期スライス培養物を製造するためのこのプロトコルは、成人ヒトネオコルチカルスライスを培養するための代替方法である。スライス培養のためのこのようなプロトコルは、光遺伝学1、44、45、電気生理学2、3、4、5に関する研究に適している可能性があります。<sup...

研究におけるヒトサンプルの使用は、人間の脳の病理を研究するための素晴らしい選択肢であり、現代の技術は、患者由来の組織を使用して堅牢かつ倫理的な実験のための新しい方法を開きました。成人の人間の脳から調製されたオルガノチピック/スライス培養のような方法は、光遺伝学1、電気生理学2、3、4、5、可塑性などのパラダイムでますます使用されている6,7,8,9, 神経毒性/神経保護10,11,12,13, 細胞療法14,薬物スクリーニング15,16,17, 遺伝学と遺伝子編集12,18,19,20, とりわけ、 より良い戦略として成人期の神経疾患を理解する。
ヒト脳病理の根底にあるメカニズムの理解は、多数の被験者を必要とする実験戦略に依存する。逆に、スライス培養の場合、ヒトサンプルへのアクセスは依然として困難であるが、単一の皮質サンプルから最大50個のスライスを生成する可能性は、複数のボランティアを募集する必要性を部分的に回避する。収集された組織21当たりの複製および実行アッセイの数。
脳の組織学的/スライス培養のためのいくつかのプロトコルが記載されています,古典的なオキュロドラフト22,23,ローラーチューブ24,25,26, 半透過性膜インターフェイス 27、28、29、30、およびフリーフローティングスライス31、32。実験計画の特異性に応じて、各手法には独自の長所と短所があります。成人ヒト脳からの短期、自由浮遊スライス培養は、Stoppiniら27で使用される方法よりも有利な場合もあるが、インビトロでの長期細胞生存は通常、評価する際に大きな関心事であるという事実を考慮すると培養方法では、多くの実験において、培養中の短期間のみが必要である12、31、32、33、34、35。これらの条件下で、自由浮遊培養物の使用は、よりシンプルで費用対効果が高いという利点を提示するだけでなく、2〜3週間にわたって培養中に保持されるスライスよりも、元のヒト組織の状態に正確に似ています。
スライス培養が神経科学に及む可能性があるにもかかわらず、成人の神経組織を用いてこのような培養物を調製する研究は、特にヒトの被験者からはまだ不足している。この記事では、切除脳手術に提出された生きているヒトドナーから収集した脳組織を使用して、自由浮遊スライス培養を準備するプロトコルについて説明する。これらの培養物を用いた生化学的および細胞生物学アッセイを維持・実行する手順を詳しく説明する。このプロトコルは、成人期に関連する神経病理学のメカニズムに関する研究において、生存率および神経機能を分析するために貴重であることが証明されている。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1571px;" width="1570">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">2-Propanol</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td style="width:344px;">1096341000</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Acrylamide/Bis-Acrylamide, 30% solution</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">A3449&#160;</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Ammonium persulfate</td>
			<td style="width:200px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">A3678-25G</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Amphotericin B</td>
			<td style="width:200px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">15290-018</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Antibody anti-ERK 2 (rabbit)</td>
			<td>Santa Cruz Biotecnology</td>
			<td>sc-154</td>
			<td>Dilution 1:1,000 in BSA 2.5%</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Antibody anti-pERK (mouse)</td>
			<td>Santa Cruz Biotecnology</td>
			<td>sc-7383</td>
			<td>Dilution 1:1,000 in BSA 2.5%</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BDNF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SRP3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">A7906</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Bradford 1x Dye Reagent</td>
			<td style="width:200px;">BioRad</td>
			<td style="width:344px;">500-0205</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">EDTA</td>
			<td style="width:200px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">T3924</td>
			<td style="width:505px;">Used in RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hank&#39;s Balanced Salts</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H1387-10X1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hepes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td style="width:344px;">1003171000</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Hydrogen Peroxide (H2O2)</td>
			<td style="width:200px;">Vetec</td>
			<td align="right" style="width:344px;">194</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (anti-mouse)</td>
			<td style="width:200px;">GE</td>
			<td style="width:344px;">NA931-1ML</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">NaCl</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td align="right" style="width:344px;">1064041000</td>
			<td style="width:505px;">Used in RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Neurobasal A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10888-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Non-fat dry milk (Molico)</td>
			<td style="width:200px;">Nestl&#233;</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">Used for membrane blocking</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">PBS Buffer pH 7,2</td>
			<td>Laborclin</td>
			<td align="right">590338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicilin/Streptomicin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:521px;">Potassium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td align="right">1049361000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:521px;">Prime Western Blotting Detection Reagent</td>
			<td style="width:200px;">GE</td>
			<td style="width:344px;">RPN2232</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit)</td>
			<td>GE</td>
			<td>NA934-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:521px;">SDS</td>
			<td style="width:200px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">L5750</td>
			<td style="width:505px;">Used in RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:521px;">TEMED</td>
			<td style="width:200px;">GE</td>
			<td style="width:344px;">17-1312-01</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Tris</td>
			<td style="width:200px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">T-1378</td>
			<td style="width:505px;">Used in RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:521px;">Triton x-100</td>
			<td style="width:200px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">X100</td>
			<td style="width:505px;">Used in RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:521px;">Ultrapure Water</td>
			<td style="width:200px;">Millipore</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">Sterile water, derived from MiliQ water purification system</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:521px;">Equipment and Material</td>
			<td style="width:200px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:50px;">24-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CL S3526</td>
			<td>Flat Bottom with Lid</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;">Amersham Potran Premium (nitrocellulose membrane)&#160;</td>
			<td>GE</td>
			<td>29047575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:521px;">Carbogen Mixture</td>
			<td style="width:200px;">White Martins</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">95% O2, 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:46px;width:521px;">CO2 incubator</td>
			<td style="width:200px;">New Brunswick Scientific</td>
			<td style="width:344px;">CO-24</td>
			<td style="width:505px;">Incubation of slices 5% CO2, 36&#186;C</td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;width:521px;">Microplate Reader</td>
			<td style="width:200px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:521px;">Microtubes</td>
			<td style="width:200px;">Greiner</td>
			<td style="width:344px;">001608</td>
			<td style="width:505px;">1,5mL microtube</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:521px;">Motorized pestle</td>
			<td style="width:200px;">Kimble Chase</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:521px;">Plastic spoon</td>
			<td style="width:200px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">Size of a dessert spoon</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:521px;">Razor Blade</td>
			<td style="width:200px;">Bic</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">Chrome Platinum, used in slicing with vibratome</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:37px;width:521px;">Scalpel Blade</td>
			<td style="width:200px;">Becton Dickinson (BD)</td>
			<td style="width:344px;">Number 24</td>
			<td style="width:505px;">Used for slicing of tissue; recommended same size or smaller</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:34px;width:521px;">Superglue (Loctite Super Bonder)</td>
			<td style="width:200px;">Henkel</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">Composition: Etilcianoacrilato; 2-Propenoic acid; 6,6&#39;-di-terc-butil-2,2&#39;-metilenodi-p-cresol; homopolymer</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;">Vibratome&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14047235612 - VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:37px;width:521px;">Name of Material/ Equipment for Immunohistochemistry</td>
			<td style="width:200px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:41px;">Antibody anti-NeuN (mouse)</td>
			<td>Millipore&#160;</td>
			<td>MAB377</td>
			<td>Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:521px;">Antibody anti-GFAP (mouse)</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td style="width:344px;">MAB360</td>
			<td>Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Antibody anti-Iba1 (rabbit)</td>
			<td style="width:200px;">Abcam</td>
			<td style="width:344px;">EPR16588 - ab178846</td>
			<td>Dilution 1:2,000 in Phosphate Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Biotinylated anti-mouse IgG Antibody (H+L)</td>
			<td style="width:200px;">Vector</td>
			<td style="width:344px;">BA-9200</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">DAB</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">D-9015</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Entellan</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td align="right" style="width:344px;">107960</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Ethanol</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td style="width:344px;">1.00983.1000</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Gelatin</td>
			<td style="width:200px;">Synth</td>
			<td style="width:344px;">00G1002.02.AE</td>
			<td style="width:505px;">Used for coating slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SM2010R</td>
			<td>Equipped with Freezing Stage (BFS-10MP, Physiotemp), set to -40&#186;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal Donkey Serum</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">158127</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit)</td>
			<td>GE</td>
			<td>NA934-1ML</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Slides (Star Frost)</td>
			<td>Knittel Glaser</td>
			<td></td>
			<td>Gelatin coated slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td style="width:200px;">Vetec</td>
			<td>60REAVET017050</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Vectastain ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard)</td>
			<td style="width:200px;">Vector</td>
			<td style="width:344px;">PK-4000, Kit Standard</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Xylene</td>
			<td style="width:200px;">Synth</td>
			<td style="width:344px;">01X1001.01.BJ</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

short-term free-floating slice cultures from the adult human brain

オルガオティピック、またはスライス培養物は、インビトロで機能する中枢神経系の側面をモデル化するために広く採用されている。神経科学におけるスライス培養の可能性にもかかわらず、成人の神経組織を用いた研究は、特にヒトの被験者からのもので、そのような培養物を調製する研究はまだ少ない。スライス培養を調製するための成人ヒト組織の使用は、げっ歯類(通常新生児)から産生されるスライスに欠ける成熟したヒト脳の典型的な特性を保持するので、ヒト神経病理学の理解を高めるために特に魅力的である神経組織。このプロトコルは、切除脳外科手術に提出された生きているヒトドナーから採取された脳組織を使用して、短期的な自由浮遊スライス培養を準備する方法を記述する。これらの培養物を用いた生化学的および細胞生物学アッセイを維持・実行する手順も提示される。代表的な結果は、典型的なヒト皮質積層がインビトロ(DIV4)で4日後にスライスに保存され、主要な神経細胞型の存在が予想されることを示す。さらに、DIV4のスライスは、有毒刺激(H2O2)に挑戦すると堅牢な細胞死を受け、このモデルが細胞死アッセイのプラットフォームとして機能する可能性を示します。この方法は、膜挿入物を使用して広く使用されているプロトコルに代わる、よりシンプルで費用対効果の高い代替手段であり、主に年齢に関連する脳疾患の背後にある神経変性のメカニズムを解明することを目的とした短期アッセイを実行するために推奨される。最後に、プロトコルは、薬剤耐性側頭葉てんかんの外科的治療に提出された患者から採取された皮質組織を使用することに専念しているが、他の脳領域/状態から採取された組織もすべきであると主張されている。同様のフリーフローティングスライスカルチャーを生成するためのソースとみなされます。

培養スライスの品質と健康を評価する重要な側面は、予想される神経細胞型、ニューロン、およびグリア細胞の存在と典型的な形態である。ヒト皮質積層の典型的なアーキテクチャはDIV4のスライスで観察され、神経免疫標識によって明らかになった(図2D)。また、ミクログリアおよびアストログリア(図2B,C)の存在も認めら?...

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Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain

成人の人間の脳から自由に浮遊するスライス培養を準備するプロトコルが提示される。このプロトコルは、膜挿入物を用いた広く用いられているスライス培養法のバリエーションである。これは、シンプルで費用対効果が高く、年齢に関連する脳疾患の背後にある神経変性のメカニズムを解明することを目的とした短期アッセイを実行するために推奨されます。

成人人間の脳からの短期自由浮遊スライス培養

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of ...

我々は、切除脳外科手術に提出された生きているヒトドナーから採取された脳組織から自由に浮遊スライス培養を準備するためのプロトコルを提示する。この培養は、生化学的および細胞生物学のアッセイまたは免疫細胞化学を行うのもよい。関連する脳疾患における神経変性の根底にあるメカニズムの解明に寄与することが期待される。この技術の主な利点は、膜挿入物を使用して古典的なスライス培養プロトコルに代わる、よりシンプルで費用対効果の高い方法です。全体的なプロトコルは複雑ではありませんが、髄液の除去、ビブラートメ試料ディスクへの組織の接着、免疫組織化学の切除などのいくつかのステップが、視覚的に実証されたときに最もよく理解されます。この手順のデモンストレーションを手伝うのは、卒業生であるニール・メンデスとグラウシア・アルメディアと、もう一人の卒業生であるジョヴァンナ・ノゲイラです。この手順を開始するには、氷のバケツに塩を加えます。スライス溶液をこのバケットに移し、使用前に少なくとも20分間、カルボゲン混合物バブリングの下で休ませます。次に、約2センチメートル×2センチメートル×2センチメートルの3%アガロースのブロックを準備します。スーパーは、スライス中に組織サンプルに追加の機械的サポートを作成するために、ビブラートメ標本ディスクにアガロースブロックを接着します。ビブラートオームでは、断面の厚さを200マイクロメートル、振動周波数を100ヘルツに設定し、毎秒0.5~1.0ミリメートルのスライス速度を選択します。その後、ビブラートメバッファートレイをビブラートメベースにロックし、スライス溶液とサンプルを受け取る前に冷蔵し、スライス手順全体を通して冷蔵保つために氷を追加します。まず、輸送中のサンプル冷却用の輸送液と氷を含む輸送船と輸送容器に接続されたシリコーンチューブに接続されたガス出力を制御する圧力フラックスバルブに接続されたカルボゲン混合物を含む携帯用ガスボンベを設置する。テキストプロトコルで概説されているように、標本と輸送を収集し、輸送します。スライス溶液を含むペトリ皿に標本を移します。細かい外科用具を使用して、残りの髄をできるだけ慎重に取り除いてください。実験計画の特定の特性を持つスライスを製造するための最良の標本の向きを選択し、数24メスの刃を使用して、試料ディスクに接着されるベースとなる平らな表面をトリミングします。廃棄プラスチックスプーンと繊細なペイントブラシを使用して、ペトリ皿から断片を収集し、濾紙で余分な溶液を乾燥させます。次に、スーパー接着剤を使用して、ビブラートメの標本皿に組織をしっかりと付着させ、アガロースブロックに接触するまで組織を取り付けます。ビブラートメの試料ディスクをビブラートメのバッファートレイに入れます。カミソリの刃をしっかりと固定して、ナイフホルダーを所定の位置にロックします。スライス溶液を追加し、それが標本とブレードの両方をカバーしていることを確認します。その後、200マイクロメートルのスライスに標本をスライスし始めます。バッファートレイからスライス溶液を含むペトリ皿にスライスを移し、緩いエッジと余分な白質を約70%皮質と30%の白質の割合にトリミングします。層流キャビネットでは、24ウェルプレートの各ウェルに600マイクロリットルの培養培地を加え、スライスをめっきする前に少なくとも20分間、5%の二酸化炭素を加えて摂氏36度でインキュベートします。この後、各ウェルに1つのスライスをプレートにペイントブラシを使用してください。プレートに未使用の井戸がある場合は、400マイクロリットルの無菌水で満たします。5%の二酸化炭素で摂氏36度でインキュベートする。1ミリリットル当たり50ナノグラムの濃度で脳由来の神経栄養因子を有する、以前に調製された培養培地の10ミリリットルを補う。8~16時間後、各ウェルから333マイクロリットルのコンディション培地を取り出し、133マイクロリットルの新鮮なBDNF補充培地を添加します。24時間ごとに、条件付き培地の3分の1を新鮮なBDNF補充培地に置き換えます。まず、培養培地を含むウェルからPBSを含む新しい24ウェルプレートにスライスを移す。各ウェルからPBSを取り出し、4%パラホルムアルデヒドの1ミリリットルに置き換えます。摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、慎重にウェルからパラホルムアルデヒドを除去し、30%スクロース溶液の1ミリリットルに置き換えます。摂氏4度で48時間インキュベートします。48時間後、凍結ミクロトームをマイナス40°Cに設定します。スライスを配置するミクロトームステージにスクロースベースを準備します。完全に凍結した後、冷凍スクロースの一部を切って、スライスが配置される平らな表面を作り出します。次に、各スライスを引き延ばしたプラスチックフィルムの上に置き、ペイントブラシを使用して組織を平らにします。1回の移動で、伸ばしたスライスを冷凍スクロースベースに移します。スライスが5〜10分間凍結した後、スライスを30マイクロメートルのセクションに切ります。30マイクロメートルの切片をPBSを含むペトリ皿に移し、実験計画に適した構造プロトコルに進みます。培養スライスの品質と健康を決定する際に、評価すべき重要な側面は、期待される神経細胞タイプ、ニューロンおよびグリア細胞の存在と典型的な形態である。ヒト皮質ラミネーションの典型的なアーキテクチャは、ニューロン免疫標識によって明らかにされた4日目のスライスで観察される。また、ミクログリアやアストログリアの存在も予想される。これらの結果は、組織アーキテクチャが外科的処置、サンプル処理、またはインビトロでの短期間のいずれによっても有意に影響を受けないことを示す。塩化カリウム誘導脱分極に対する神経細胞応答は、ERKリン酸化に従うことによって培養スライスでも定量化されている。興味深いことに、ERKリン酸化の明確な増加は、ビトロ4日に塩化カリウム処理スライスで見られます。最後に、毒性の課題に対するインビトロ4日目のスライスの反応は、過酸化水素を誘導する既知の酸化ストレス誘導体で評価される。スライスを過酸化水素300ミリモルに24時間曝露すると、MTT削減が堅調に減少した。まとめると、過酸化水素チャレンジ後の5つのスライスで1日に観察された巨大な細胞死と塩化カリウム誘導脱分極結果は、酸化ストレスなどの有毒刺激に応答する4日目のスライスの保存された一般的な健康状態を示しています。このプロトコルは、主に、候補薬物による神経毒性および神経保護の分子メカニズムの調査など、1週間以上続くアッセイに基づく研究に専念している。このプロトコルは、マイクロ耐性側頭葉てんかんの外科的治療に提出された患者から採取された皮質組織を使用することに専念しているが、他の脳領域または条件から採取された組織も自由浮遊スライス培養を生成する源となり得る可能性が高い。人間の脳からのスライス培養は、げっ歯類の脳から産生されるスライスに欠けている独自の細胞回路と分子機械のために、人間の神経病理学の理解を進める上で重要かもしれません。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

器官型海馬切片培養

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

器官切片培養におけるプルキンエ細胞の樹状突起の形態分析

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

誘導された神経細胞への成人の脳の周皮細胞由来細胞の系統の再プログラミング

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Entorhino海馬器官型スライス培養における神経血管リモデリングの解析

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Slice It Hot: Acute Adult Brain Slicing in Physiological Temperature

スライスこれホット：生理的温度における急性成人の脳スライス

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

成体マウスの脊髄組織からの初代混合グリア培養の調製

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors

死後ヒト脳ドナーから軟膜植片培養物の導出

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

ひと成人皮膚線維芽細胞から誘導される神経細胞の高収率文化の生成の単純です

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures

準備や髄脊髄小脳スライス培養の免疫染色

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical ...

Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay

自由浮遊免疫蛍光アッセイによる皮下末梢神経線維におけるアルファシヌクレイン凝集体の標的化

To date, for most neurodegenerative diseases only a post-mortem histopathological definitive diagnosis is available. For Parkinson&#39;s disease (PD), the ...