Name: short-term free-floating slice cultures from the adult human brain
Uploaded: 2019-11-05T13:30:00
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이 작품은 FAPESP에 의해 지원된다 (그랜트 25681-3/2017 에 AS), CAPES (박사 후 펠로우십 PNPD / INCT-HSM A.F.와 N.D.M.에 박사 전 펠로우십) 및 FAEPA. G.M.A.는 FAPESP (MS 2018/06614-4)에서 석사 펠로우십을 보유하고 있습니다. N.G.C.는 CNPq 연구 펠로우십을 보유하고 있습니다. 우리는 이 연구 결과에 대한 절제된 조직을 기증해 준 환자와 그들의 가족에게 감사드립니다. 우리는 리베이라오 프레토 의과 대학, 상파울루 대학의 임상 병원에서 주민, 간호사, 기술자 및 CIREP 팀의 지원을 인정하고 싶습니다.

살아있는 성인 뇌 조직은 약전성 측두엽 간질치료를 위한 용단신경외과를 받은 환자로부터 수득하였다(도1A). 모든 절차는 리베이라오 프레토 의과 대학 (17578/2015)의 클리닉 병원에서 윤리위원회의 승인을 받았으며 환자 (또는 법적 책임자)는 정보에 입각한 동의 조건에 동의하고 서명했습니다. 조직의 수집은 간질 외과 센터에서 신경 외과 팀에 의해 수행되었?...

자유 부동, 단기 슬라이스 배양을 생산하기위한이 프로토콜은 성인 인간 신피질 조각을 배양하기위한 대체 방법입니다. 슬라이스 배양에 대한 이러한 프로토콜은 광유전학1,44,45,전기 생리학2,3,4,5에 대한 연구에 적합할 수 있습니다. <...

연구에서 인간 샘플의 사용은 명백하게 인간의 뇌 병리학을 연구할 수있는 좋은 옵션이며, 현대 기술은 환자 유래 조직을 사용하여 강력하고 윤리적 인 실험을위한 새로운 방법을 열었습니다. 성인 인간의 뇌에서 준비 된 organotypic / 슬라이스 문화와 같은 방법은 광유전학1,전기 생리학2,3,4,5,가소성과 같은 패러다임에서 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 6,7,8,9,신경 독성 / 신경 보호10,11,12,13,세포 치료14, 약물 스크리닝15,16,17,유전학 및 유전자 편집12,18,19,20,다른 사람의 사이에서, 더 나은 전략으로 성인기 동안 신경 질환을 이해.
인간의 뇌 병리의 근본적인 메커니즘의 이해는 많은 수의 과목을 필요로하는 실험 전략에 달려 있습니다. 반대로, 슬라이스 배양의 경우, 인간 샘플에 대한 접근은 여전히 어렵지만 단일 피질 샘플에서 최대 50 개의 조각을 생성 할 가능성은 부분적으로 증가하여 여러 자원 봉사자를 모집하는 요구 사항을 우회합니다. 수집된 조직당 복제 및 수행된비수치(21).
뇌 organotypic / 슬라이스 문화에 대한 몇 가지 프로토콜은 고전 oculo 초안22,23에서 롤러 튜브24, 25,26,반 투과성 멤브레인에 이르기까지 설명되었습니다. 인터페이스27,28,29,30, 자유 부동 슬라이스31,32. 실험 설계의 특수성에 따라 각 기술에는 고유한 장점과 단점이 있습니다. 성인 인간의 뇌에서 단기, 자유 부동 슬라이스 배양은 경우에 따라 Stoppini 등27에의해 사용되는 방법에 비해 유리하다, 사실 고려하면 시험관내에서 장기 세포 생존은 일반적으로 평가 할 때 주요 관심사입니다 배양 방법은, 많은 실험에서 배양에서 짧은 기간만 이들에게12,31,32,33,34,35가필요하다. 이러한 조건하에서, 자유 부동 배양의 사용은 2-3 주 동안 배양에 보관 된 조각보다 원래의 인간 조직 상태를 보다 정확하게 닮은 더 간단하고 비용 효율적인 장점을 제시한다.
신경 과학에 슬라이스 문화의 잠재력에도 불구 하 고, 이러한 문화를 준비 하는 성인 신경 조직을 사용 하 여 연구는 여전히 부족, 특히 인간의 과목에서. 이 문서는 자유 부동 슬라이스 문화를 준비하기 위해 절제 뇌 수술에 제출 살아있는 인간 기증자에서 수집 된 뇌 조직을 사용하는 프로토콜을 설명합니다. 이러한 배양을 사용하여 생화학 및 세포 생물학 분석을 유지하고 수행하는 절차는 상세히 설명되어 있다. 이 프로토콜은 성인기에 연결된 신경 병리학의 메커니즘에 대한 조사에서 생존력과 신경 기능을 분석하는 데 유용하다는 것이 입증되었습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1571px;" width="1570">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">2-Propanol</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td style="width:344px;">1096341000</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Acrylamide/Bis-Acrylamide, 30% solution</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">A3449&#160;</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Ammonium persulfate</td>
			<td style="width:200px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">A3678-25G</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Amphotericin B</td>
			<td style="width:200px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">15290-018</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Antibody anti-ERK 2 (rabbit)</td>
			<td>Santa Cruz Biotecnology</td>
			<td>sc-154</td>
			<td>Dilution 1:1,000 in BSA 2.5%</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Antibody anti-pERK (mouse)</td>
			<td>Santa Cruz Biotecnology</td>
			<td>sc-7383</td>
			<td>Dilution 1:1,000 in BSA 2.5%</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BDNF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SRP3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">A7906</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Bradford 1x Dye Reagent</td>
			<td style="width:200px;">BioRad</td>
			<td style="width:344px;">500-0205</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">EDTA</td>
			<td style="width:200px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">T3924</td>
			<td style="width:505px;">Used in RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hank&#39;s Balanced Salts</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H1387-10X1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hepes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td style="width:344px;">1003171000</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Hydrogen Peroxide (H2O2)</td>
			<td style="width:200px;">Vetec</td>
			<td align="right" style="width:344px;">194</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (anti-mouse)</td>
			<td style="width:200px;">GE</td>
			<td style="width:344px;">NA931-1ML</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">NaCl</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td align="right" style="width:344px;">1064041000</td>
			<td style="width:505px;">Used in RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Neurobasal A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10888-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Non-fat dry milk (Molico)</td>
			<td style="width:200px;">Nestl&#233;</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">Used for membrane blocking</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">PBS Buffer pH 7,2</td>
			<td>Laborclin</td>
			<td align="right">590338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicilin/Streptomicin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:521px;">Potassium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td align="right">1049361000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:521px;">Prime Western Blotting Detection Reagent</td>
			<td style="width:200px;">GE</td>
			<td style="width:344px;">RPN2232</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit)</td>
			<td>GE</td>
			<td>NA934-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:521px;">SDS</td>
			<td style="width:200px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">L5750</td>
			<td style="width:505px;">Used in RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:521px;">TEMED</td>
			<td style="width:200px;">GE</td>
			<td style="width:344px;">17-1312-01</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Tris</td>
			<td style="width:200px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">T-1378</td>
			<td style="width:505px;">Used in RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:521px;">Triton x-100</td>
			<td style="width:200px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">X100</td>
			<td style="width:505px;">Used in RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:521px;">Ultrapure Water</td>
			<td style="width:200px;">Millipore</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">Sterile water, derived from MiliQ water purification system</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:521px;">Equipment and Material</td>
			<td style="width:200px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:50px;">24-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CL S3526</td>
			<td>Flat Bottom with Lid</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;">Amersham Potran Premium (nitrocellulose membrane)&#160;</td>
			<td>GE</td>
			<td>29047575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:521px;">Carbogen Mixture</td>
			<td style="width:200px;">White Martins</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">95% O2, 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:46px;width:521px;">CO2 incubator</td>
			<td style="width:200px;">New Brunswick Scientific</td>
			<td style="width:344px;">CO-24</td>
			<td style="width:505px;">Incubation of slices 5% CO2, 36&#186;C</td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;width:521px;">Microplate Reader</td>
			<td style="width:200px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:521px;">Microtubes</td>
			<td style="width:200px;">Greiner</td>
			<td style="width:344px;">001608</td>
			<td style="width:505px;">1,5mL microtube</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:521px;">Motorized pestle</td>
			<td style="width:200px;">Kimble Chase</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:521px;">Plastic spoon</td>
			<td style="width:200px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">Size of a dessert spoon</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:521px;">Razor Blade</td>
			<td style="width:200px;">Bic</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">Chrome Platinum, used in slicing with vibratome</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:37px;width:521px;">Scalpel Blade</td>
			<td style="width:200px;">Becton Dickinson (BD)</td>
			<td style="width:344px;">Number 24</td>
			<td style="width:505px;">Used for slicing of tissue; recommended same size or smaller</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:34px;width:521px;">Superglue (Loctite Super Bonder)</td>
			<td style="width:200px;">Henkel</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">Composition: Etilcianoacrilato; 2-Propenoic acid; 6,6&#39;-di-terc-butil-2,2&#39;-metilenodi-p-cresol; homopolymer</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;">Vibratome&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14047235612 - VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:37px;width:521px;">Name of Material/ Equipment for Immunohistochemistry</td>
			<td style="width:200px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:41px;">Antibody anti-NeuN (mouse)</td>
			<td>Millipore&#160;</td>
			<td>MAB377</td>
			<td>Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:521px;">Antibody anti-GFAP (mouse)</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td style="width:344px;">MAB360</td>
			<td>Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Antibody anti-Iba1 (rabbit)</td>
			<td style="width:200px;">Abcam</td>
			<td style="width:344px;">EPR16588 - ab178846</td>
			<td>Dilution 1:2,000 in Phosphate Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Biotinylated anti-mouse IgG Antibody (H+L)</td>
			<td style="width:200px;">Vector</td>
			<td style="width:344px;">BA-9200</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">DAB</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">D-9015</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Entellan</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td align="right" style="width:344px;">107960</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Ethanol</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td style="width:344px;">1.00983.1000</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Gelatin</td>
			<td style="width:200px;">Synth</td>
			<td style="width:344px;">00G1002.02.AE</td>
			<td style="width:505px;">Used for coating slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SM2010R</td>
			<td>Equipped with Freezing Stage (BFS-10MP, Physiotemp), set to -40&#186;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal Donkey Serum</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">158127</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit)</td>
			<td>GE</td>
			<td>NA934-1ML</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Slides (Star Frost)</td>
			<td>Knittel Glaser</td>
			<td></td>
			<td>Gelatin coated slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td style="width:200px;">Vetec</td>
			<td>60REAVET017050</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Vectastain ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard)</td>
			<td style="width:200px;">Vector</td>
			<td style="width:344px;">PK-4000, Kit Standard</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Xylene</td>
			<td style="width:200px;">Synth</td>
			<td style="width:344px;">01X1001.01.BJ</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

short-term free-floating slice cultures from the adult human brain

Organotypic, 또는 슬라이스 문화, 널리 생체 외에서 작동 하는 중추 신 경계의 측면을 모델링 하기 위해 사용 되었습니다. 신경 과학에 슬라이스 문화의 잠재력에도 불구 하 고, 이러한 문화를 준비 하는 성인 신경 조직을 사용 하 여 연구는 여전히 부족, 특히 인간 과목에서 그. 슬라이스 배양을 준비하기 위해 성인 인간 조직의 사용은 설치류에서 생산 된 조각 (일반적으로 신생아)에서 생산 된 성숙한 인간의 뇌의 전형적인 독특한 특성을 보유하기 때문에 인간의 신경 병리학에 대한 이해를 향상시키는 데 특히 매력적입니다. 신경 조직. 이 프로토콜은 단기, 자유 부동 슬라이스 문화를 준비하기 위해 절제 뇌 수술에 제출 살아있는 인간 기증자에서 수집 된 뇌 조직을 사용하는 방법을 설명합니다. 이러한 배양을 사용하여 생화학및 세포 생물학 분석을 유지하고 수행하는 절차도 제시된다. 대표적인 결과는 전형적인 인간 피질 적층이 시험관내(DIV4)에서 4일 후에 슬라이스로 보존되고, 주요 신경 세포 유형의 예상 존재와 함께 입증된다. 더욱이, DIV4의 슬라이스는 독성자극(H2O2)에도전할 때 강력한 세포 사멸을 겪으며, 이는 세포 사멸 법제에서 플랫폼역할을 하는 이 모델의 잠재력을 나타낸다. 이 방법은, 막 삽입을 사용하여 널리 사용되는 프로토콜에 대한 간단하고 비용 효율적인 대안, 주로 연령과 관련된 뇌 질환 뒤에 신경 변성의 메커니즘을 해명하기위한 단기 분석법을 실행하는 것이 좋습니다. 마지막으로, 프로토콜은 약리성 측두엽 간질의 외과 적 치료에 제출 된 환자에서 수집 된 피질 조직을 사용하는 데 전념하지만, 다른 뇌 영역 / 조건에서 수집 된 조직도해야한다고 주장한다. 유사한 자유 부동 슬라이스 문화원을 생성하는 소스로 간주됩니다.

배양된 슬라이스의 품질 및 건강을 평가하는 중요한 양상은 예상되는 신경 세포 유형, 뉴런 및 신경교 세포의 존재 및 전형적인 형태이다. 인간 피질 적층의 전형적인 구조는 DIV4에서 슬라이스에서 관찰되었고, 뉴런 면역 표지에 의해밝혀졌다(도 2D). 또한, 마이크로글리아 및 아스트로글리아의 예상존재(도 2B,C)도관찰되었다. ?...

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Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain

성인 인간의 뇌에서 자유롭게 떠있는 슬라이스 문화를 준비하는 프로토콜이 제시된다. 상기 프로토콜은 멤브레인 인서트를 이용한 널리 사용되는 슬라이스 배양 방법의 변형이다. 그것은 간단 하 고, 비용 효율적인, 그리고 단기 측정 을 실행 하기 위한 권장 연령 관련 된 뇌 질환 뒤에 신경 변성의 메커니즘을 해명 하는 것을 목표로.

성인 인간의 뇌에서 단기 자유 부동 슬라이스 문화

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of ...

우리는 절제된 두뇌 수술에 제출된 살아있는 인간 기증자에게서 집합된 두뇌 조직에서 자유로운 떠있는 슬라이스 문화를 준비하는 프로토콜을 제시합니다. 이 배양은 생화학 및 세포 생물학 분석 또는 면역 히스토케를 수행 할 수 있습니다. 그것은 관련 된 뇌 질환에 신경 변성의 기본 메커니즘의 해명에 기여할 것으로 예상 된다.이 기술의 주요 장점은 멤브레인 삽입을 사용하여 고전적인 슬라이스 배양 프로토콜에 대한 보다 간단하고 비용 효율적인 대안이라는 것입니다. 전반적인 프로토콜은 복잡하지 않지만, 수막 제거, 진동편 디스크에 조직을 접착, 면역조직화학에 대한 절제 와 같은 몇 가지 단계는 시각적으로 입증될 때 가장 잘 이해된다. 이 절차를 시연하는 데 도움이 되는 것은 졸업생인 닐 멘데스와 글라우샤 알메디아, 또 다른 졸업생인 조반나 노게이라입니다.이 절차를 시작하려면 얼음 양동이에 소금을 추가합니다. 슬라이스 용액을 이 양동이로 옮기고 사용 전에 적어도 20분 동안 카보겐 혼합물버블링 아래에 놓아 둡니다. 다음으로, 2센티미터x2센티미터에 달하는 3%의 아가로즈 블록을 준비한다.수퍼 접착제아가로스 블록을 진동기시편 디스크에 접착제로 하여 슬라이스 하는 동안 조직 샘플에 추가 기계적 지원을 생성한다. 진동에서 단면 두께를 200 마이크로미터로 설정하고 진동 주파수를 100 헤르츠로 설정하고 초당 0.5 ~1.0밀리미터 사이의 슬라이스 속도를 선택합니다. 그런 다음 진동 용액과 시료를 받기 전에 및 슬라이스 절차 전반에 걸쳐 냉장 보관하기 위해 진동 완충 트레이를 진동 베이스에 잠그고 얼음을 추가합니다.먼저, 수송시 시 시냉각을 위한 수송용 용액및 얼음을 포함하는 수송용기 및 수송용기에 가스 출력을 연결하는 실리콘 튜브에 연결된 가스 출력을 제어하는 압력 플럭스 밸브에 연결된 카보겐 혼합물을 포함하는 휴대용 가스 실린더로 구성된 운송 장치를 설치한다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 표본및 전송을 수집하고 전송합니다. 시편을 슬라이스 용액이 함유된 페트리 접시로 옮기습니다.미세 한 수술 도구를 사용 하 여, 신중 하 게 가능한 한 나머지 수막의 많은 제거. 실험 설계의 특정 특성을 가진 슬라이스를 생산하기위한 최고의 표본 방향을 선택하고 표본 디스크에 접착 될 베이스로 평평한 표면을 트리밍하는 숫자 24 메스 블레이드를 사용합니다. 폐기 플라스틱 숟가락과 섬세한 페인트 브러시를 사용하여 페트리 접시에서 조각을 수집하고 필터 용지로 과도한 용액을 건조시십시오.다음으로, 슈퍼 접착제를 사용하여 접시에 단단히 부착되고 아가로즈 블록과 접촉할 때까지 진동편 접시에 조직을 부착합니다. 진동성 시편 디스크를 진동 완충 트레이에 넣습니다. 면도날을 단단히 고정한 칼 홀더를 제자리에 고정시하십시오.슬라이스 용액을 추가하고 시편과 블레이드를 모두 덮고 있는지 확인합니다. 그런 다음 표본을 200 마이크로미터 슬라이스로 자르기 시작합니다. 버퍼 트레이에서 슬라이스용 슬라이스가 포함된 페트리 접시에 옮기고 느슨한 모서리와 과도한 흰색 물질을 약 70%의 피질과 30%의 흰색 물질로 다듬습니다.라미나르 유량 캐비닛에는 24웰 플레이트의 각 웰에 600 마이크로리터의 배양 배지를 추가하고 슬라이스를 도금하기 전에 최소 20분 동안 5%의 이산화탄소를 36도에 배양합니다. 그 후 페인트 브러시를 사용하여 각 우물에 한 조각을 플레이트합니다. 접시에 사용하지 않은 우물이 있으면 멸균 수400 마이크로리터로 채웁니다.이산화탄소 5%와 섭씨 36도에서 배양합니다. 보충 10 밀리 리터의 이전에 준비 된 배양 매체의 밀리 리터 뇌 파생 된 neurotrophic 요인의 농도50 밀리 리터 당 나노 그램. 8~16시간 후, 각 우물에서 조건부 배지의 마이크로리터 333개를 제거하고 신선한 BDNF 보충 배지 133마이크로리터를 추가합니다.24시간마다 조건부 배지의 3분의 1을 신선한 BDNF 보충 배지로 교체하십시오. 먼저 배양 매체를 포함하는 우물에서 PBS를 포함하는 새로운 24웰 플레이트로 슬라이스를 옮는다. 각 우물에서 PBS를 제거하고 4 %의 파라 포름 알데히드의 1 밀리리터로 대체합니다.섭씨 4도에서 하룻밤 을 배양하십시오. 다음 날, 조심스럽게 우물에서 파라 포름 알데히드를 제거하고 30 %의 자당 용액의 1 밀리리터로 대체. 48시간 동안 섭씨 4도에서 배양하세요.48 시간 후, 마이너스 섭씨 40도에 동결 마이크로 토메를 설정합니다. 슬라이스를 배치해야 하는 마이크로톤 스테이지에서 자당베이스를 준비합니다. 완전히 고정된 후, 냉동 자당 중 일부를 잘라 슬라이스가 배치되는 평평한 표면을 생성합니다.다음으로 각 조각을 늘어난 플라스틱 필름 위에 놓고 페인트 브러시를 사용하여 조직을 평평하게 합니다. 한 번의 이동으로 늘어난 슬라이스를 얼어 붙은 자당 베이스로 옮길 수 있습니다. 슬라이스가 제대로 얼어 붙은 지 5~10분 간 휴식을 취하면 슬라이스를 30마이크로미터 섹션으로 자른다.30 마이크로미터 섹션을 PBS가 함유된 페트리 접시로 옮기고 실험 설계에 적합한 조직학 프로토콜로 진행한다. 배양 된 조각의 품질과 건강을 결정할 때, 평가하는 중요한 측면은 예상 신경 세포 유형, 뉴런 및 신경교 세포의 존재와 전형적인 형태입니다. 인간 피질 적층의 전형적인 아키텍처는 신경 면역 라벨링에 의해 드러난 체외 4에서 하루 에 슬라이스에서 관찰된다.또한, 마이크로글리아와 천체글리아의 예상 존재도 관찰된다. 이러한 결과는 조직 아키텍처가 외과 적 시술, 샘플 처리 또는 시험관 내단기 기간에 의해 크게 영향을받지 않는다는 것을 보여줍니다. 염화칼륨에 대한 신경 반응은 또한 ERK 인산화를 따라 배양된 슬라이스에서 정량화되었다.흥미롭게도, ERK 인산화의 명확한 증가는 체외 4에서 날염화 처리 된 칼륨에서 볼 수 있습니다. 마지막으로, 체외 4에서 슬라이스의 반응은 과산화수소수소를 유도하는 알려진 산화 스트레스로 평가된다. 슬라이스를 과산화수소 300밀리머에 24시간 동안 노출하면 MTT 감소가 크게 감소했습니다.종합하면, 과산화수소 도전 후 체외5슬라이스에서 관찰된 대규모 세포사멸과 염화칼륨 유발 탈극성 결과 산화 스트레스와 같은 독성 자극에 반응하는 체외 4에서 슬라이스의 보존된 일반 건강을 나타낸다. 이 프로토콜은 주로 후보 약물에 의한 신경 독성 및 신경 보호의 분자 메커니즘의 조사와 같은 1 주일 이상 지속되는 분석서에 기초한 연구에 전념합니다. 이 프로토콜은 미세 저항측두엽 간질을 위한 외과 치료에 제출된 환자에게서 집합된 피질 조직을 사용하는 데 전념하고 있더라도, 그밖 두뇌 지구 또는 조건에서 집합된 조직은 또한 자유 부동 슬라이스 문화를 생성하는 근원일 수 있었다는 것을 확률이 높습니다.성인 인간의 뇌에서 슬라이스 배양 설치류 두뇌에서 생산 하는 조각에 부족 한 그들의 독특한 세포 회로 와 분자 기계 때문에 인간의 신경 병 증의 우리의 이해를 발전에 중요 한 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

Organotypic Hippocampal 슬라이스 문화

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

연구

신경과학

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Organotypic 슬라이스 문화의 Purkinje 세포 수지상의 형태학의 분석

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

유도 된 신경 세포로 성숙한 인간 두뇌의 혈관 주위 세포에서 파생 된 세포의 리니지 - 프로그래밍

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

에서 신경 혈관 리모델링의 분석 Entorhino - 해마 Organotypic 슬라이스 문화

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Slice It Hot: Acute Adult Brain Slicing in Physiological Temperature

슬라이스 뜨거운 것이 : 생리적 온도에서 급성 성인 뇌 슬라이스

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

성인 마우스 척수 조직에서 차 혼합 폐해 문화의 준비

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors

사후 인간의 두뇌 기증자로부터 Leptomeninges 이식편 문화의 유도

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

성인 인간 피부 섬유 아 세포에서 유도 된 신경의 고수익 문화의 간단한 세대

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures

준비 및 Immunostaining Myelinating Organotypic 소 뇌 조각 문화

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical ...

Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay

자유 부동 면역 형광 분석에 의하여 절단 말초 신경 섬유에 있는 알파 Synuclein 응집체를 표적으로 하는

To date, for most neurodegenerative diseases only a post-mortem histopathological definitive diagnosis is available. For Parkinson&#39;s disease (PD), the ...