Name: short-term free-floating slice cultures from the adult human brain
Uploaded: 2019-11-05T13:30:00
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Este trabalho é apoiado pela FAPESP (Grant 25681-3/2017 para AS), CAPES (Bolsa de Pós-Doutorado PNPD/INCT-HSM para A.F. e bolsa de pré-doutorado para N.D.M.) e FAEPA. A G.M.A. possui uma bolsa de mestrado da FAPESP (MS 2018/06614-4). N.G.C. é dona de uma Bolsa de Pesquisa cnpq. Agradecemos aos pacientes e suas famílias por doarem os tecidos ressecados para este estudo. Gostaríamos de reconhecer o apoio de moradores, enfermeiros, técnicos e da equipe do CIREP, do Hospital Clínico da Faculdade de Medicina Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, que ajudou em diversas etapas do processo.

Tecidos cerebrais adultos vivos foram obtidos de pacientes submetidos a neurocirurgia resectiva para o tratamento da epilepsia do lobo temporal farmacoresistente (Figura 1A). Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética do Hospital de Clínicas da Faculdade de Medicina Ribeirão Preto (17578/2015), e os pacientes (ou sua pessoa responsável legal) concordaram e assinaram os termos de consentimento informado. A coleta do tecido foi feita pela equipe de neuroc...

Este protocolo para a produção de culturas de fatias de curto prazo flutuantes e de curto prazo é um método alternativo para cultivar fatias neocorticas humanas adultas. Tal protocolo para culturas de fatia pode ser passível de estudos sobre (mas não restrito a) optogenética1,44,45, eletrofisiologia2,3,4,<sup class="xr...

O uso de amostras humanas na pesquisa é inequivocamente uma ótima opção para estudar patologias cerebrais humanas, e técnicas modernas abriram novas maneiras de experimentação robusta e ética usando tecido derivado do paciente. Métodos como culturas organotípicas/fatias preparadas a partir do cérebro humano adulto têm sido cada vez mais utilizados em paradigmas como optogenética1,eletrofisiologia2,3,4,5, plasticidade 6,7,8,9, neurotoxicidade/neuroproteção10,11,12,13,terapia celular14, triagem de drogas15,16,17, genética e edição de genes12,18,19,20,entre outros, como estratégia para melhor compreender doenças neurológicas durante a idade adulta.
A compreensão dos mecanismos subjacentes às patologias cerebrais humanas depende de estratégias experimentais que exigem um grande número de sujeitos. Por outro lado, no caso de culturas de fatias, embora o acesso a amostras humanas ainda seja difícil, a possibilidade de gerar até 50 fatias de uma única amostra corticana contorna parcialmente a exigência de recrutamento de múltiplos voluntários, aumentando número de réplicas e ensaios realizados por tecido coletado21.
Vários protocolos para culturas organotípicas/fatias cerebrais foram descritos, que vão desde os rascunhos clássicos de oculo22,23 até tubo de rolo24,25,26,membranas semipermeáveis interface27,28,29,30,e fatias flutuantes31,32. Dependendo das particularidades de um projeto experimental, cada técnica tem suas próprias vantagens e desvantagens. A curto prazo, as culturas de fatias de flutuação livre de cérebros humanos adultos é, em alguns casos, vantajosa sobre o método usado por Stoppini et al.27, se considerar o fato de que, embora a sobrevivência celular a longo prazo in vitro é geralmente uma grande preocupação ao avaliar um método de cultura, em muitos experimentos apenas curtos períodos de tempo na cultura são necessários12,31,32,33,34,35. Nestas circunstâncias, o uso de culturas free-floating apresenta a vantagem de ser mais simples e mais eficaz na redução de custos, assim como assemelhando-se mais exatamente à condição humana original do tecido do que as fatias mantidas na cultura sobre 2-3 semanas.
Apesar do potencial das culturas de fatia para a neurociência, estudos usando tecido nervoso adulto para preparar tais culturas ainda são escassos, particularmente de seres humanos. Este artigo descreve um protocolo para usar o tecido cerebral coletado de doadores humanos vivos submetidos a cirurgia cerebral ressectiva para preparar culturas de fatias flutuantes. Procedimentos para manter e realizar ensaios bioquímicos e de biologia celular usando essas culturas são detalhados. Este protocolo foi provado valioso para analisar a viabilidade e a função neuronal nas investigações nos mecanismos das neuropatologias lig à idade adulta.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1571px;" width="1570">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">2-Propanol</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td style="width:344px;">1096341000</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Acrylamide/Bis-Acrylamide, 30% solution</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">A3449&#160;</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Ammonium persulfate</td>
			<td style="width:200px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">A3678-25G</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Amphotericin B</td>
			<td style="width:200px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">15290-018</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Antibody anti-ERK 2 (rabbit)</td>
			<td>Santa Cruz Biotecnology</td>
			<td>sc-154</td>
			<td>Dilution 1:1,000 in BSA 2.5%</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Antibody anti-pERK (mouse)</td>
			<td>Santa Cruz Biotecnology</td>
			<td>sc-7383</td>
			<td>Dilution 1:1,000 in BSA 2.5%</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BDNF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SRP3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">A7906</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Bradford 1x Dye Reagent</td>
			<td style="width:200px;">BioRad</td>
			<td style="width:344px;">500-0205</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">EDTA</td>
			<td style="width:200px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">T3924</td>
			<td style="width:505px;">Used in RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hank&#39;s Balanced Salts</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H1387-10X1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hepes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td style="width:344px;">1003171000</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Hydrogen Peroxide (H2O2)</td>
			<td style="width:200px;">Vetec</td>
			<td align="right" style="width:344px;">194</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (anti-mouse)</td>
			<td style="width:200px;">GE</td>
			<td style="width:344px;">NA931-1ML</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">NaCl</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td align="right" style="width:344px;">1064041000</td>
			<td style="width:505px;">Used in RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Neurobasal A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10888-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Non-fat dry milk (Molico)</td>
			<td style="width:200px;">Nestl&#233;</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">Used for membrane blocking</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">PBS Buffer pH 7,2</td>
			<td>Laborclin</td>
			<td align="right">590338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicilin/Streptomicin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:521px;">Potassium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td align="right">1049361000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:521px;">Prime Western Blotting Detection Reagent</td>
			<td style="width:200px;">GE</td>
			<td style="width:344px;">RPN2232</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit)</td>
			<td>GE</td>
			<td>NA934-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:521px;">SDS</td>
			<td style="width:200px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">L5750</td>
			<td style="width:505px;">Used in RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:521px;">TEMED</td>
			<td style="width:200px;">GE</td>
			<td style="width:344px;">17-1312-01</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Tris</td>
			<td style="width:200px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">T-1378</td>
			<td style="width:505px;">Used in RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:521px;">Triton x-100</td>
			<td style="width:200px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">X100</td>
			<td style="width:505px;">Used in RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:521px;">Ultrapure Water</td>
			<td style="width:200px;">Millipore</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">Sterile water, derived from MiliQ water purification system</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:521px;">Equipment and Material</td>
			<td style="width:200px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:50px;">24-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CL S3526</td>
			<td>Flat Bottom with Lid</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;">Amersham Potran Premium (nitrocellulose membrane)&#160;</td>
			<td>GE</td>
			<td>29047575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:521px;">Carbogen Mixture</td>
			<td style="width:200px;">White Martins</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">95% O2, 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:46px;width:521px;">CO2 incubator</td>
			<td style="width:200px;">New Brunswick Scientific</td>
			<td style="width:344px;">CO-24</td>
			<td style="width:505px;">Incubation of slices 5% CO2, 36&#186;C</td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;width:521px;">Microplate Reader</td>
			<td style="width:200px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:521px;">Microtubes</td>
			<td style="width:200px;">Greiner</td>
			<td style="width:344px;">001608</td>
			<td style="width:505px;">1,5mL microtube</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:521px;">Motorized pestle</td>
			<td style="width:200px;">Kimble Chase</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:521px;">Plastic spoon</td>
			<td style="width:200px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">Size of a dessert spoon</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:521px;">Razor Blade</td>
			<td style="width:200px;">Bic</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">Chrome Platinum, used in slicing with vibratome</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:37px;width:521px;">Scalpel Blade</td>
			<td style="width:200px;">Becton Dickinson (BD)</td>
			<td style="width:344px;">Number 24</td>
			<td style="width:505px;">Used for slicing of tissue; recommended same size or smaller</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:34px;width:521px;">Superglue (Loctite Super Bonder)</td>
			<td style="width:200px;">Henkel</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">Composition: Etilcianoacrilato; 2-Propenoic acid; 6,6&#39;-di-terc-butil-2,2&#39;-metilenodi-p-cresol; homopolymer</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;">Vibratome&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14047235612 - VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:37px;width:521px;">Name of Material/ Equipment for Immunohistochemistry</td>
			<td style="width:200px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:41px;">Antibody anti-NeuN (mouse)</td>
			<td>Millipore&#160;</td>
			<td>MAB377</td>
			<td>Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:521px;">Antibody anti-GFAP (mouse)</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td style="width:344px;">MAB360</td>
			<td>Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Antibody anti-Iba1 (rabbit)</td>
			<td style="width:200px;">Abcam</td>
			<td style="width:344px;">EPR16588 - ab178846</td>
			<td>Dilution 1:2,000 in Phosphate Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Biotinylated anti-mouse IgG Antibody (H+L)</td>
			<td style="width:200px;">Vector</td>
			<td style="width:344px;">BA-9200</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">DAB</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">D-9015</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Entellan</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td align="right" style="width:344px;">107960</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Ethanol</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td style="width:344px;">1.00983.1000</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Gelatin</td>
			<td style="width:200px;">Synth</td>
			<td style="width:344px;">00G1002.02.AE</td>
			<td style="width:505px;">Used for coating slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SM2010R</td>
			<td>Equipped with Freezing Stage (BFS-10MP, Physiotemp), set to -40&#186;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal Donkey Serum</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">158127</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit)</td>
			<td>GE</td>
			<td>NA934-1ML</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Slides (Star Frost)</td>
			<td>Knittel Glaser</td>
			<td></td>
			<td>Gelatin coated slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td style="width:200px;">Vetec</td>
			<td>60REAVET017050</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Vectastain ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard)</td>
			<td style="width:200px;">Vector</td>
			<td style="width:344px;">PK-4000, Kit Standard</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Xylene</td>
			<td style="width:200px;">Synth</td>
			<td style="width:344px;">01X1001.01.BJ</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

short-term free-floating slice cultures from the adult human brain

Organotypic, ou culturas da fatia, foram empregados extensamente para modelar aspectos do sistema nervoso central que funciona in vitro. Apesar do potencial das culturas de fatias na neurociência, estudos usando tecido nervoso adulto para preparar tais culturas ainda são escassos, particularmente os de seres humanos. O uso do tecido humano adulto para preparar culturas da fatia é particular atrativo realçar a compreensão de neuropatologias humanas, porque prendem as propriedades originais típicas do cérebro humano maduro que falta nas fatias produzidas do roedor (geralmente neonatal) tecido nervoso. Este protocolo descreve como usar o tecido cerebral coletado de doadores humanos vivos submetidos a cirurgia cerebral ressectiva para preparar culturas de fatias de curto prazo e flutuantes. Procedimentos para manter e realizar ensaios bioquímicos e de biologia celular usando essas culturas também são apresentados. Os resultados representativos demonstram que a laminação cortical humana típica está preservada nas fatias após 4 dias in vitro (DIV4), com presença prevista dos tipos principais da pilha neural. Além disso, as fatias no DIV4 passam por uma morte celular robusta quando desafiadas com um estímulo tóxico (H2O2),indicando o potencial deste modelo para servir como uma plataforma em ensaios de morte celular. Este método, uma alternativa mais simples e econômica ao protocolo amplamente utilizado usando inserções de membrana, é recomendado principalmente para a execução de ensaios de curto prazo destinados a desvendar mecanismos de neurodegeneração por trás de doenças cerebrais associadas à idade. Finalmente, embora o protocolo seja dedicado ao uso de tecido cortical coletado de pacientes submetidos ao tratamento cirúrgico da epilepsia do lobo temporal farmacoresistente, argumenta-se que o tecido coletado de outras regiões/condições cerebrais também deve ser consideradas como fontes para produzir culturas similares da fatia livre-flutuando.

Um aspecto crítico para avaliar a qualidade e a saúde das fatias cultivadas é a presença e morfologia típica dos tipos esperados de células neurais, neurônios e células gliais. A arquitetura típica da laminação cortical humana foi observada em uma fatia em DIV4, revelada pela imunorotulagem neuronal (Figura 2D). Além disso, também foi observada a presença esperada de microglia e astroglia (Figura 2B,C). Esses resul...

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Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain

Um protocolo para preparar culturas de fatias flutuantes do cérebro humano adulto é apresentado. O protocolo é uma variação do método de cultura de fatia amplamente utilizado usando inserções de membrana. É simples, rentável, e recomendado para a execução de ensaios de curto prazo destinadas a desvendar mecanismos de neurodegeneração por trás de doenças cerebrais associadas à idade.

Culturas de fatias flutuantes de curto prazo do cérebro humano adulto

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of ...

Apresentamos um protocolo para preparar culturas de fatias flutuantes livres de tecido cerebral coletado de doadores humanos vivos submetidos a cirurgia cerebral ressectiva. Esta cultura é receptiva a realizar ensaios bioquímicos e de biologia celular ou imunohistoquímica. Espera-se que contribua para a elucidação do mecanismo de neurodegeneração subjacente em doenças cerebrais associadas.A principal vantagem dessa técnica é que é uma alternativa mais simples e econômica ao protocolo clássico de cultura de fatias usando pastilhas de membrana. Embora o protocolo geral não seja complexo, algumas etapas como a remoção de meninges, colação do tecido ao disco do espécime vibratome e a ressecção para a imunohistoquímica são melhor compreendidas quando demonstradas visualmente. Ajudando a demonstrar o procedimento estarão Niele Mendes e Glaucia Almedia, que são estudantes de pós-graduação, e Giovanna Nogueira, outra estudante de pós-graduação.Para começar este procedimento, adicione sal a um balde de gelo. Transfira a solução de fatiamento para este balde e deixe descansar sob a mistura de carbogen borbulhando por pelo menos 20 minutos antes de usar. Em seguida, prepare um bloco de 3% de agarose que é de cerca de dois centímetros por dois centímetros por dois centímetros.Super cola o bloco de agarose no disco da amostra de vibratome, a fim de criar suporte mecânico adicional à amostra de tecido durante o corte. No vibratome, ajuste a espessura da seção para 200 micrômetros, a frequência de vibração para 100 hertz, e escolha uma velocidade de corte entre 0,5 e 1,0 milímetros por segundo. Em seguida, bloqueie a bandeja de tampão de vibratome na base do vibratome e adicione gelo para mantê-lo refrigerado antes de receber a solução de corte e a amostra e durante todo o procedimento de corte.Primeiro, configure um aparelho de transporte que consiste em um cilindro de gás portátil contendo uma mistura de carbogen conectada a uma válvula de fluxo de pressão que controla a saída de gás conectada à tubulação de silicone que conecta a saída de gás ao navio de transporte e ao navio de transporte que contém a solução de transporte e gelo para resfriamento amostral durante o transporte. Recolher e transportar o espécime e o transporte conforme descrito no protocolo de texto. Transfira o espécime para uma placa de Petri contendo solução de corte.Utilizando ferramentas cirúrgicas finas, remova cuidadosamente o máximo possível de meninges restantes. Escolha a melhor orientação de espécime para produzir fatias com as características particulares do design experimental e use uma lâmina de bisturi número 24 para aparar uma superfície plana para ser a base que será colada ao disco da amostra. Utilizando uma colher de plástico de disposição e pincéis delicados, colete o fragmento da placa de Petri e seque a solução em excesso com papel filtro.Em seguida, use super cola para anexar o tecido ao prato da amostra de vibratome até que ele seja firmemente aderido ao prato e em contato com o bloco de agarose. Coloque o disco da amostra de vibratome na bandeja de tampão vibratome. Bloqueie o suporte da faca no lugar com a lâmina de barbear firmemente fixada.Adicione a solução de corte e certifique-se de que está cobrindo o espécime e a lâmina. Em seguida, comece a cortar o espécime em fatias de 200 micrômetros. Transfira as fatias da bandeja tampão para uma placa de Petri contendo solução de corte e corte todas as bordas soltas e excesso de matéria branca para uma proporção de aproximadamente 70% de córtex e 30% de matéria branca.Em um gabinete de fluxo laminar, adicione 600 microliters de cultura média a cada poço de uma placa de 24 poços e incubar a 36 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por pelo menos 20 minutos antes de emplacar as fatias. Depois disso, use um pincel para emplacar uma fatia em cada poço. Se houver algum poço nãoutado na placa, encha-os com 400 microliters de água estéril.Incubar a 36 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Suplementar 10 mililitros do meio de cultura previamente preparado com fator neurotrófico derivado do cérebro a uma concentração de 50 nanogramas por mililitro. Após oito a 16 horas, remova 333 microliters do meio condicionado de cada poço e adicione 133 microliters de meio fresco BDNF.Substitua um terço do meio condicionado por meio complementado BDNF fresco a cada 24 horas. Primeiro, transfira as fatias dos poços que contêm meio de cultura para uma nova placa de 24 poços contendo PBS. Remova o PBS de cada poço e substitua-o por um mililitro de 4%de paraformaldeído.Incubar durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, remova cuidadosamente o paraformaldeído dos poços e substitua-o por um mililitro de solução de 30% de sacarose. Incubar a 4 graus Celsius por 48 horas.Depois de 48 horas, coloque o microtome congelante em 40 graus Celsius negativo. Prepare uma base de sacarose no estágio do microtome onde as fatias devem ser colocadas. Depois de completamente congelado, corte parte da sacarose congelada para produzir uma superfície plana na qual a fatia será colocada.Em seguida, coloque cada fatia sobre uma película de plástico esticada e use um pincel para achatar o tecido. Em um único movimento, transfira a fatia esticada para a base de sacarose congelada. Depois que a fatia tiver descansado por cinco a 10 minutos para congelar corretamente, corte a fatia em seções de 30 micrômetros.Transfira as seções de 30 micrômetros para uma placa de Petri contendo PBS e prossiga para um protocolo de histologia adequado para o projeto experimental. Ao determinar a qualidade e a saúde das fatias cultivadas, um aspecto crítico a ser avaliado é a presença e a morfologia típica dos tipos de células neurais esperadas, neurônios e células gliais. A arquitetura típica da laminação cortical humana é observada em uma fatia no dia in vitro quatro revelada pelo imunolabelamento neuronal.Além disso, observa-se também a presença esperada de microglia e astroglia. Esses resultados demonstram que a arquitetura tecidual não é significativamente afetada nem pelo procedimento cirúrgico, pelo processamento da amostra, ou pelo curto período in vitro. A resposta neuronal à despolarização induzida pelo cloreto de potássio também foi quantificada em fatias cultivadas seguindo a fosforilação ERK.Curiosamente, um claro aumento na fosforilação ERK é visto em fatias tratadas com cloreto de potássio no dia quatro in vitro. Finalmente, a resposta de fatias no dia 4 a um desafio tóxico é avaliada com um conhecido peróxido de hidrogênio indutora de estresse oxidativo. Expor as fatias a peróxido de hidrogênio de 300 mililitros por 24 horas levou a uma redução robusta na redução de MTT.Juntos, a morte celular maciça observada no dia in vitro cinco fatias após o desafio do peróxido de hidrogênio e os resultados de despolarização induzidos pelo cloreto de potássio indicam a saúde geral preservada das fatias no dia 4 in vitro que respondem a um estímulo tóxico, como o estresse oxidativo. Este protocolo é dedicado principalmente a estudos baseados em ensaios com duração de uma semana, como a investigação de mecanismos moleculares de neurotoxicidade e neuroproteção por drogas candidatas. Embora este protocolo seja dedicado ao uso de tecido cortical coletado de pacientes submetidos ao tratamento cirúrgico para epilepsia do lobo temporal micro resistente, é provável que o tecido coletado de outras regiões ou condições cerebrais também possa ser fonte para produzir culturas de fatias flutuantes livres.Culturas de fatias do cérebro humano adulto podem ser fundamentais para avançar nossa compreensão das neuropatologias humanas devido aos seus circuitos celulares únicos e máquinas moleculares carentes de fatias produzidas a partir de cérebros de roedores.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

Organotípicas Hippocampal Culturas Slice

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Neurociência

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

A Análise de Purkinje Morfologia de células dendríticas em Culturas fatia organotípicas

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Lineage-reprogramação de células pericyte derivados do Adulto Cérebro Humano em neurônios induzidos

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

A Análise de Neurovascular Remodelação em Entorhino-hipocampal culturas Organotípicas Fatia

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Slice It Hot: Acute Adult Brain Slicing in Physiological Temperature

Slice It Hot: Agudo Adulto Cérebro Cortando na temperatura fisiológica

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

Preparação de culturas mista glial primários de rato adulto Spinal Cord Tissue

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors

Derivação de culturas leptomeninges explantes de Postmortem Cérebro humano Doadores

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of ...

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Simples geração de uma cultura de alto rendimento de neurônios induzidas de fibroblastos de pele humana adulta

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Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures

Preparação e imunocoloração de culturas de fatia cerebelar microambiental Organotypic

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical ...

Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay

Segmentação de agregados Alpha synuclein em fibras nervosas periféricas cutâneas por ensaio de imunofluorescência livre-flutuante

To date, for most neurodegenerative diseases only a post-mortem histopathological definitive diagnosis is available. For Parkinson&#39;s disease (PD), the ...