Name: short-term free-floating slice cultures from the adult human brain
Uploaded: 2019-11-05T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain at JoVE.com

Эта работа поддерживается ФАПЕСП (Грант 25681-3/2017 as), CAPES (Пост-докторская стипендия PNPD/INCT-HSM для А.Ф. и додокторской стипендий н.д.М.) и FAEPA. G.M.A. имеет стипендию магистра от FAPESP (MS 2018/06614-4). N.G.C. имеет научно-исследовательскую стипендию CNPq. Мы благодарим пациентов и их семьи за пожертвование резецированных тканей для этого исследования. Мы хотели бы отметить поддержку жителей, медсестер, техников и команды CIREP из клинической больницы в Медицинской школе Рибейран Прето, Университет Сан-Паулу, которые помогали на различных этапах этого процесса.

Ткани мозга живых взрослых были получены от пациентов, проходящих резецкую нейрохирургию для лечения фармакорезистентной эпилепсии височной доли(рисунок 1А). Все процедуры были одобрены Комитетом по этике из клиники больницы в Рибейран Прето медицинской школ...

Этот протокол для производства свободно плавающих, краткосрочных срезовых культур является альтернативным методом для культивирования взрослых человеческих неокортикальных ломтиков. Такой протокол для срезовых культур может быть поддается исследованиям по (но не ограничен) оптоге?...

Использование человеческих образцов в исследованиях однозначно отличный вариант для изучения патологий человеческого мозга, и современные методы открыли новые пути для надежных и этических экспериментов с использованием пациента полученных тканей. Такие методы, как organotypic / срез культур, подготовленных из взрослого человеческого мозга все чаще используются в парадигмы, такие как оптогенетика1, электрофизиология2,3,4,5, пластичность 6,7,8,9, нейротоксичность / нейропротекционистство10,11,12,13,клеточная терапия14, скрининг нанаркотики 15,16,17, генетика и редактирование генов12,18,19,20, среди других, как стратегия для лучшего понимание неврологических заболеваний во взрослом возрасте.
Понимание механизмов, лежащих в основе патологий человеческого мозга, зависит от экспериментальных стратегий, которые требуют большого количества испытуемых. И наоборот, в случае срезаных культур, хотя доступ к пробам человека по-прежнему затруднен, возможность генерации до 50 ломтиков из одного коркового образца частично обходит необходимость найма нескольких добровольцев за счет увеличения количество репликатов и выполненных анализов на собранную ткань21.
Несколько протоколов для мозга organotypic / срез культур были описаны, начиная от классических проектов oculo22,23 роликовой трубки24,25,26, полупроницаемые мембраны интерфейс27,28,29,30, и свободно плавающие ломтики31,32. В зависимости от особенностей экспериментального дизайна, каждая техника имеет свои преимущества и недостатки. Краткосрочные, свободно плавающие культуры ломтиков из мозга взрослого человека в некоторых случаях выгодно по сравнению с методом, используемым Stoppini и др.27, если учесть тот факт, что, хотя долгосрочные выживания клеток в пробирке, как правило, является серьезной проблемой при оценке культурный метод, во многих экспериментах только короткие периоды времени в культуре необходимы12,31,32,33,34,35. В этих условиях использование свободненских культур представляет собой преимущество более простого и экономичного, а также более точного напоминания первоначального состояния тканей человека, чем ломтики, хранящиеся в культуре в течение 2-3 недель.
Несмотря на потенциал среза культур к неврологии, исследования с использованием взрослых нервной ткани для подготовки таких культур по-прежнему скудны, особенно от человека. В этой статье описывается протокол об использовании собранной ткани мозга от живых человеческих доноров, представленных на резекцивную операцию на головном мозге для подготовки свободно плавающих культур среза. Процедуры для поддержания и выполнения биохимических и клеточных анализов биологии с использованием этих культур подробно. Этот протокол оказался ценным для анализа жизнеспособности и нейронной функции в исследованиях механизмов нейропатологии, связанных с взрослой жизнью.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1571px;" width="1570">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">2-Propanol</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td style="width:344px;">1096341000</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Acrylamide/Bis-Acrylamide, 30% solution</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">A3449&#160;</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Ammonium persulfate</td>
			<td style="width:200px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">A3678-25G</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Amphotericin B</td>
			<td style="width:200px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">15290-018</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Antibody anti-ERK 2 (rabbit)</td>
			<td>Santa Cruz Biotecnology</td>
			<td>sc-154</td>
			<td>Dilution 1:1,000 in BSA 2.5%</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Antibody anti-pERK (mouse)</td>
			<td>Santa Cruz Biotecnology</td>
			<td>sc-7383</td>
			<td>Dilution 1:1,000 in BSA 2.5%</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BDNF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SRP3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">A7906</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Bradford 1x Dye Reagent</td>
			<td style="width:200px;">BioRad</td>
			<td style="width:344px;">500-0205</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">EDTA</td>
			<td style="width:200px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">T3924</td>
			<td style="width:505px;">Used in RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hank&#39;s Balanced Salts</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H1387-10X1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hepes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td style="width:344px;">1003171000</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Hydrogen Peroxide (H2O2)</td>
			<td style="width:200px;">Vetec</td>
			<td align="right" style="width:344px;">194</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (anti-mouse)</td>
			<td style="width:200px;">GE</td>
			<td style="width:344px;">NA931-1ML</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">NaCl</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td align="right" style="width:344px;">1064041000</td>
			<td style="width:505px;">Used in RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Neurobasal A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10888-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Non-fat dry milk (Molico)</td>
			<td style="width:200px;">Nestl&#233;</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">Used for membrane blocking</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">PBS Buffer pH 7,2</td>
			<td>Laborclin</td>
			<td align="right">590338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicilin/Streptomicin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:521px;">Potassium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td align="right">1049361000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:521px;">Prime Western Blotting Detection Reagent</td>
			<td style="width:200px;">GE</td>
			<td style="width:344px;">RPN2232</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit)</td>
			<td>GE</td>
			<td>NA934-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:521px;">SDS</td>
			<td style="width:200px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">L5750</td>
			<td style="width:505px;">Used in RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:521px;">TEMED</td>
			<td style="width:200px;">GE</td>
			<td style="width:344px;">17-1312-01</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Tris</td>
			<td style="width:200px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">T-1378</td>
			<td style="width:505px;">Used in RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:521px;">Triton x-100</td>
			<td style="width:200px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">X100</td>
			<td style="width:505px;">Used in RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:521px;">Ultrapure Water</td>
			<td style="width:200px;">Millipore</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">Sterile water, derived from MiliQ water purification system</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:521px;">Equipment and Material</td>
			<td style="width:200px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:50px;">24-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CL S3526</td>
			<td>Flat Bottom with Lid</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;">Amersham Potran Premium (nitrocellulose membrane)&#160;</td>
			<td>GE</td>
			<td>29047575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:521px;">Carbogen Mixture</td>
			<td style="width:200px;">White Martins</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">95% O2, 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:46px;width:521px;">CO2 incubator</td>
			<td style="width:200px;">New Brunswick Scientific</td>
			<td style="width:344px;">CO-24</td>
			<td style="width:505px;">Incubation of slices 5% CO2, 36&#186;C</td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;width:521px;">Microplate Reader</td>
			<td style="width:200px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:521px;">Microtubes</td>
			<td style="width:200px;">Greiner</td>
			<td style="width:344px;">001608</td>
			<td style="width:505px;">1,5mL microtube</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:521px;">Motorized pestle</td>
			<td style="width:200px;">Kimble Chase</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:521px;">Plastic spoon</td>
			<td style="width:200px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">Size of a dessert spoon</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:521px;">Razor Blade</td>
			<td style="width:200px;">Bic</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">Chrome Platinum, used in slicing with vibratome</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:37px;width:521px;">Scalpel Blade</td>
			<td style="width:200px;">Becton Dickinson (BD)</td>
			<td style="width:344px;">Number 24</td>
			<td style="width:505px;">Used for slicing of tissue; recommended same size or smaller</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:34px;width:521px;">Superglue (Loctite Super Bonder)</td>
			<td style="width:200px;">Henkel</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">Composition: Etilcianoacrilato; 2-Propenoic acid; 6,6&#39;-di-terc-butil-2,2&#39;-metilenodi-p-cresol; homopolymer</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;">Vibratome&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14047235612 - VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:37px;width:521px;">Name of Material/ Equipment for Immunohistochemistry</td>
			<td style="width:200px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:41px;">Antibody anti-NeuN (mouse)</td>
			<td>Millipore&#160;</td>
			<td>MAB377</td>
			<td>Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:521px;">Antibody anti-GFAP (mouse)</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td style="width:344px;">MAB360</td>
			<td>Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Antibody anti-Iba1 (rabbit)</td>
			<td style="width:200px;">Abcam</td>
			<td style="width:344px;">EPR16588 - ab178846</td>
			<td>Dilution 1:2,000 in Phosphate Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Biotinylated anti-mouse IgG Antibody (H+L)</td>
			<td style="width:200px;">Vector</td>
			<td style="width:344px;">BA-9200</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">DAB</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">D-9015</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Entellan</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td align="right" style="width:344px;">107960</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Ethanol</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td style="width:344px;">1.00983.1000</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Gelatin</td>
			<td style="width:200px;">Synth</td>
			<td style="width:344px;">00G1002.02.AE</td>
			<td style="width:505px;">Used for coating slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SM2010R</td>
			<td>Equipped with Freezing Stage (BFS-10MP, Physiotemp), set to -40&#186;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal Donkey Serum</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">158127</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit)</td>
			<td>GE</td>
			<td>NA934-1ML</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Slides (Star Frost)</td>
			<td>Knittel Glaser</td>
			<td></td>
			<td>Gelatin coated slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td style="width:200px;">Vetec</td>
			<td>60REAVET017050</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Vectastain ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard)</td>
			<td style="width:200px;">Vector</td>
			<td style="width:344px;">PK-4000, Kit Standard</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Xylene</td>
			<td style="width:200px;">Synth</td>
			<td style="width:344px;">01X1001.01.BJ</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

short-term free-floating slice cultures from the adult human brain

Organotypic, или срез культур, были широко использованы для моделирования аспектов центральной нервной системы функционирования в пробирке. Несмотря на потенциал среза культур в неврологии, исследования с использованием взрослых нервной ткани для подготовки таких культур по-прежнему скудны, особенно из человеческих субъектов. Использование взрослых человеческих тканей для подготовки среза культур особенно привлекательна для углубления понимания человеческих нейропатологий, так как они имеют уникальные свойства, характерные для зрелого человеческого мозга, не хватает ломтиков, произведенных у грызунов (обычно неонатальных) нервной ткани. Этот протокол описывает, как использовать ткани мозга, собранные из живых человеческих доноров, представленных на резекцивную операцию на головном мозге, чтобы подготовить краткосрочные, свободно плавающие культуры среза. Также представлены процедуры поддержания и проведения биохимических и клеточных анализов биологии с использованием этих культур. Репрезентативные результаты показывают, что типичная ламинирование корковой линии человека сохраняется в ломтиках после 4 дней in vitro (DIV4), при ожидаемом присутствии основных типов нейронных клеток. Кроме того, ломтики на DIV4 проходят надежную гибель клеток, когда оспаривается с токсичным стимулом (H2O2), что свидетельствует о потенциале этой модели, чтобы служить в качестве платформы в анализсмерти смерти клеток. Этот метод, более простой и экономически эффективной альтернативой широко используемому протоколу с использованием мембранных вставок, в основном рекомендуется для проведения краткосрочных анализов, направленных на распутывание механизмов нейродегенерации за возрастными заболеваниями мозга. Наконец, хотя протокол посвящен использованию корковых тканей, собранных у пациентов, представленных на хирургическое лечение фармакорезистентной височной эпилепсии, утверждается, что ткани, собранные из других областей мозга / условий также должны быть рассматривается в качестве источников для производства аналогичных свободно плавающих срезовых культур.

Критическим аспектом для оценки качества и здоровья культивированных ломтиков является наличие и типичная морфология ожидаемых типов нервных клеток, нейронов и глиальных клеток. Типичная архитектура ламинирования корковой ламинирования человека наблюдалась в ломтике на DIV4, выявлен...

Watch this Scientific Journal Video about Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain at JoVE.com

Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain

Представлен протокол по подготовке свободно плавающих срезовых культур из мозга взрослого человека. Протокол представляет собой вариацию широко используемого метода культуры срезов с использованием мембранных вставок. Это простой, экономически эффективный, и рекомендуется для запуска краткосрочных анализов, направленных на разгадать механизмы нейродегенерации за возрастных заболеваний мозга.

Краткосрочные свободно плавающие культуры фрагмента от взрослого человеческого мозга

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of ...

Мы представляем протокол для подготовки свободно плавающих культур ломтик из ткани мозга, собранные из живых человеческих доноров, представленных на ресективную операцию на головном мозге. Эта культура является подменой для выполнения биохимических и клеточной биологии анализы или иммуногистохимии. Ожидается, что это будет способствовать выяснению механизма, лежащего в основе нейродегенерации при сопутствующих заболеваниях мозга.Основным преимуществом этой техники является то, что это более простая и экономически эффективная альтернатива классическому протоколу культуры срезов с использованием мембранных вставок. Хотя общий протокол не является сложным, некоторые шаги, такие как удаление ополчеек, приклеивание ткани к диску образца вибромы, и ресекция для иммуногистохимии лучше всего понять, когда продемонстрировали визуально. Помочь продемонстрировать процедуру будут Ниле Мендес и Глаусия Альмедиа, которые являются аспирантами, и Джованна Ногейра, еще один аспирант.Чтобы начать эту процедуру, добавьте соль в ведро со льдом. Перенесите нарезающий раствор в это ведро и дайте ему отдохнуть под карбогенной смесью, восходящей в течение по крайней мере 20 минут до использования. Затем приготовьте блок 3%agarose, который составляет около двух сантиметров на два сантиметра на два сантиметра.Супер клей агарозы блок вибромы образца диска для того, чтобы создать дополнительную механическую поддержку образца ткани во время нарезки. На виброме установите толщину сечения до 200 микрометров, частоту вибрации до 100 герц, и выберите скорость нарезки от 0,5 до 1,0 миллиметра в секунду. Затем заблокировать виброметр буфер лоток к базе вибромы и добавить лед, чтобы держать его в холодильнике до получения нарезки раствора и образца и на протяжении всей процедуры нарезки.Во-первых, создать транспортный аппарат, который состоит из портативного газового баллона, содержащего карбогенную смесь, соединенную с клапаном потока давления, который контролирует выход газа, подключенный к силиконовым трубам, который соединяет эту газовую продукцию с транспортным судном и транспортным судном, которое содержит транспортный раствор и лед для пробного охлаждения во время транспортировки. Сбор и транспортировка образца и транспортировки, как указано в текстовом протоколе. Перенесите образец в чашку Петри, содержащую нарезающий раствор.Используя тонкие хирургические инструменты, тщательно удалите как можно больше оставшихся око меньшего. Выберите лучшую ориентацию образца для производства ломтиков с особыми характеристиками экспериментального дизайна и используйте лезвие скальпеля номер 24, чтобы обрезать плоскую поверхность, чтобы быть основанием, которое будет приклеено к диску образца. Используя пластиковую ложку и тонкие кисти, соберите фрагмент из чашки Петри и высушите лишний раствор фильтровальной бумагой.Далее используйте супер клей, чтобы прикрепить ткань к виброме образца блюдо, пока он твердо придерживается блюдо и в контакте с блоком агарозы. Поместите диск образца вибромы в буферный лоток виброма. Заблокив держатель ножа на месте с лезвием бритвы прочно закреплены.Добавьте нарезающее решение и убедитесь, что оно покрывает как образец, так и лезвие. Затем начните нарезать образец на 200 микрометров ломтиками. Перенесите ломтики из буферного лотка в чашку Петри, содержащую нарезной раствор, и обрежьте любые свободные края и избыток белого вещества до доли примерно 70% коры и 30%белого вещества.В шкафу ламинарного потока добавьте 600 микролитров культуры среды к каждому колодец 24-хорошо пластины и инкубировать при 36 градусов по Цельсию с 5%углекислого газа, по крайней мере 20 минут до покрытия ломтиками. После этого используйте кисть, чтобы пластины один ломтик в каждом хорошо. Если в тарелке есть неиспользованные колодцы, заполните их 400 микролитров стерильной воды.Инкубировать при 36 градусах по Цельсию с 5%углекислым газом. Дополнение 10 миллилитров ранее подготовленной среды культуры с мозгом, полученным нейротрофическим фактором при концентрации 50 нанограмм на миллилитр. Через 8-16 часов удалите из каждой колодец 333 микролитров кондиционированной среды и добавьте 133 микролитров свежей BDNF дополненной среды.Заменить одну треть кондиционированной среды со свежим BDNF дополняется среды каждые 24 часа. Во-первых, перенесите ломтики из колодцев, содержащих культурную среду, на новую пластину из 24 скважин, содержащую PBS. Удалите PBS из каждой хорошо и заменить его на один миллилитр 4%paraformaldehyde.Инкубировать на ночь при четырех градусах по Цельсию. На следующий день осторожно удалите параформальдегид из скважин и замените его одним миллилитром 30%-ного раствора сахарозы. Инкубировать при четырех градусах по Цельсию в течение 48 часов.Через 48 часов установите замораживание микротома до минус 40 градусов по Цельсию. Подготовьте основание сахарозы на стадии микротома, где ломтики должны быть помещены. После того, как он полностью заморожен, вырезать некоторые из замороженных сахарозы производить плоскую поверхность, на которой ломтик будет помещен.Затем поместите каждый кусочек на растянутую пластиковую пленку и используйте кисть, чтобы сгладить ткани. За один ход перенесите растянутый кусочек на основание замороженной сахарозы. После того, как ломтик отдохнул в течение пяти-десяти минут, чтобы заморозить правильно, разрезать ломтик на 30 микрометровых секций.Перенесите 30-метровые секции в чашку Петри, содержащую PBS, и приступайте к гистологическому протоколу, адекватному экспериментальному проекту. При определении качества и здоровья культурных ломтиков, важнейшим аспектом для оценки является наличие и типичная морфология ожидаемых типов нервных клеток, нейронов и глиальных клеток. Типичная архитектура человеческого коркового ламинирования наблюдается в ломтике в день в пробирке четыре выявлены нейронального иммунолабеля.Кроме того, наблюдается ожидаемое присутствие микроглии и астроглии. Эти результаты показывают, что архитектура тканей не сильно зависит ни от хирургической процедуры, обработки образцов, ни от краткосрочного периода in vitro. Нейрональная реакция на деполяризацию хлорида калия также была количественно оценена в культурных ломтиках, следуя фосфорилированию ERK.Интересно, что явное увеличение фосфорилирования ERK наблюдается в хлорид калия обработанных ломтиков в день в пробирке четыре. Наконец, реакция ломтиков в день в пробирке четыре токсичных вызов оценивается с известным окислительным стрессом индуктор перекиси водорода. Разоблачение ломтиков до 300 миллимолейных перекиси водорода в течение 24 часов привело к сильному снижению МТТ.Взятые вместе, массовая гибель клеток наблюдается в день в пробирке пять ломтиков после перекиси водорода вызов и хлорид калия индуцированных результатов деполяризации указывают на сохраненное общее состояние здоровья ломтиков в день в пробирке четыре, которые реагируют на токсичные стимулы, такие как окислительный стресс. Этот протокол в основном посвящен исследованиям, основанным на анализах продолжительностью более одной недели, таких как исследование молекулярных механизмов нейротоксичности и нейропротектории препаратами-кандидатами. Хотя этот протокол посвящен использованию корковых тканей, собранных у пациентов, представленных на хирургическое лечение для микрорезистентной эпилепсии височной доли, вполне вероятно, что ткани, собранные из других областей мозга или условий также могут быть источниками для производства свободно плавающих культур ломтик.Нарезка культур из взрослого человеческого мозга может быть ключевым в продвижении нашего понимания невропатологии человека из-за их уникальной клеточной схемы и молекулярной техники не хватает ломтиков, производимых из мозга грызунов.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

Органотипической гиппокампа культур фрагмент

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Анализ Пуркинье морфологии дендритных клеток в органотипической культур Slice

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Lineage-перепрограммирование перицитов клеток, полученных из взрослых мозга человека в индуцированные нейронов

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Анализ нейрососудистой ремоделирования в Entorhino-гиппокампа культуры Органотипической Slice

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Slice It Hot: Acute Adult Brain Slicing in Physiological Temperature

Slice It Hot: Острая взрослом мозге нарезки в физиологической температуре

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

Получение первичных смешанных глиальных культур от взрослых спинного мозга мыши ткани

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors

Выведение лептоменинкс эксплантата культур от посмертных доноров человеческого мозга

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

Простая генерация высокой урожайности культуры искусственных нейронов из фибробластов кожи взрослого человека

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures

Подготовка и иммуноокрашивания Myelinating Organotypic мозжечка ломтик культур

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical ...

Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay

Ориентация Альфа Синуклеин Агрегаты в кожных периферных нервных волокон по свободно плавающей иммунофлуоресценции Анализ

To date, for most neurodegenerative diseases only a post-mortem histopathological definitive diagnosis is available. For Parkinson&#39;s disease (PD), the ...