Name: short-term free-floating slice cultures from the adult human brain
Uploaded: 2019-11-05T13:30:00
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Este trabajo cuenta con el apoyo de FAPESP (Grant 25681-3/2017 to AS), CAPES (Post-Doctoral fellowship PNPD/INCT-HSM to A.F. y Pre-Doctoral fellowship to N.D.M.) y FAEPA. G.M.A. posee una beca de maestría de FAPESP (MS 2018/06614-4). N.G.C. tiene una beca de investigación CNPq. Agradecemos a los pacientes y sus familias por donar los tejidos resecados para este estudio. Nos gustaría reconocer el apoyo de los residentes, enfermeras, técnicos y el equipo del CIREP, del Hospital Clínico de la Escuela de Medicina Ribeir-o Preto, de la Universidad de Sao Paulo, quienes ayudaron en varias etapas del proceso.

Se obtuvieron tejidos cerebrales adultos vivos de pacientes sometidos a neurocirugía resectiva para el tratamiento de la epilepsia del lóbulo temporal farmacorresistente(Figura 1A). Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de ética del Hospital de Clínicas de la Escuela de Medicina Ribeir-o Preto (17578/2015), y los pacientes (o su persona legal responsable) aceptaron y firmaron los términos de consentimiento informado. La recolección del tejido fue rea...

Este protocolo para producir cultivos de sectores flotantes y a corto plazo es un método alternativo para el cultivo de rebanadas neocorticales humanas adultas. Tal protocolo para cultivos de sectores puede ser susceptible de estudios (pero no restringido a) optogenética1,44,45, electrofisiología2,3,4,5 <...

El uso de muestras humanas en la investigación es inequívocamente una gran opción para estudiar las patologías cerebrales humanas, y las técnicas modernas han abierto nuevas formas de experimentación robusta y ética utilizando tejido derivado del paciente. Métodos como cultivos organotípicos/rebanadas preparados a partir del cerebro humano adulto se han utilizado cada vez más en paradigmas como la optogenética1, la electrofisiología2,3,4,5, plasticidad 6,7,8,9, neurotoxicidad/neuroprotección10,11,12,13, terapia celular14, cribado de drogas15,16,17, genética y edición genética12,18,19,20, entre otros, como estrategia para mejorar la comprensión de las enfermedades neurológicas durante la edad adulta.
La comprensión de los mecanismos subyacentes a las patologías cerebrales humanas depende de estrategias experimentales que requieren un gran número de sujetos. Por el contrario, en el caso de los cultivos de rebanadas, aunque el acceso a muestras humanas sigue siendo difícil, la posibilidad de generar hasta 50 rebanadas a partir de una sola muestra cortical elude parcialmente el requisito de reclutar múltiples voluntarios número de réplicas y ensayos realizados por tejido recogido21.
Se han descrito varios protocolos para cultivos organotípicos y de corte cerebrales, que van desde los clásicos borradores de oculo22,23 hasta el tubo de rodillo24,25,26, membranas semipermeables interfaz27,28,29,30y rebanadas flotantes31,32. Dependiendo de las particularidades de un diseño experimental, cada técnica tiene sus propias ventajas y desventajas. Cultivos de rebanadas flotantes a corto plazo de cerebros humanos adultos es en algunos casos ventajoso sobre el método utilizado por Stoppini et al.27, si se tiene en cuenta el hecho de que aunque la supervivencia celular a largo plazo in vitro suele ser una preocupación importante a la hora de evaluar un método de cultivo, en muchos experimentos sólo se necesitan períodos cortos de tiempo en el cultivo12,31,32,33,34,35. En estas condiciones, el uso de cultivos flotantes presenta la ventaja de ser más simple y más rentable, así como se asemeja con mayor precisión a la condición original del tejido humano que las rodajas mantenidas en cultivo durante 2-3 semanas.
A pesar del potencial de los cultivos de rebanadas a la neurociencia, estudios que utilizan tejido nervioso adulto para preparar tales cultivos son todavía escasos, particularmente de los sujetos humanos. Este artículo describe un protocolo para usar el tejido cerebral recogido de donantes humanos vivos sometidos a cirugía cerebral resectiva para preparar cultivos de rebanadas flotantes libres. Se detallan los procedimientos para mantener y realizar ensayos bioquímicos y de biología celular utilizando estos cultivos. Este protocolo ha demostrado ser valioso para analizar la viabilidad y la función neuronal en investigaciones sobre los mecanismos de las neuropatologías vinculadas a la edad adulta.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1571px;" width="1570">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">2-Propanol</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td style="width:344px;">1096341000</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Acrylamide/Bis-Acrylamide, 30% solution</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">A3449&#160;</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Ammonium persulfate</td>
			<td style="width:200px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">A3678-25G</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Amphotericin B</td>
			<td style="width:200px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">15290-018</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Antibody anti-ERK 2 (rabbit)</td>
			<td>Santa Cruz Biotecnology</td>
			<td>sc-154</td>
			<td>Dilution 1:1,000 in BSA 2.5%</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Antibody anti-pERK (mouse)</td>
			<td>Santa Cruz Biotecnology</td>
			<td>sc-7383</td>
			<td>Dilution 1:1,000 in BSA 2.5%</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BDNF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SRP3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">A7906</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Bradford 1x Dye Reagent</td>
			<td style="width:200px;">BioRad</td>
			<td style="width:344px;">500-0205</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">EDTA</td>
			<td style="width:200px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">T3924</td>
			<td style="width:505px;">Used in RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hank&#39;s Balanced Salts</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H1387-10X1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hepes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td style="width:344px;">1003171000</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Hydrogen Peroxide (H2O2)</td>
			<td style="width:200px;">Vetec</td>
			<td align="right" style="width:344px;">194</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (anti-mouse)</td>
			<td style="width:200px;">GE</td>
			<td style="width:344px;">NA931-1ML</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">NaCl</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td align="right" style="width:344px;">1064041000</td>
			<td style="width:505px;">Used in RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Neurobasal A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10888-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Non-fat dry milk (Molico)</td>
			<td style="width:200px;">Nestl&#233;</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">Used for membrane blocking</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">PBS Buffer pH 7,2</td>
			<td>Laborclin</td>
			<td align="right">590338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicilin/Streptomicin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:521px;">Potassium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td align="right">1049361000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:521px;">Prime Western Blotting Detection Reagent</td>
			<td style="width:200px;">GE</td>
			<td style="width:344px;">RPN2232</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit)</td>
			<td>GE</td>
			<td>NA934-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:521px;">SDS</td>
			<td style="width:200px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">L5750</td>
			<td style="width:505px;">Used in RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:521px;">TEMED</td>
			<td style="width:200px;">GE</td>
			<td style="width:344px;">17-1312-01</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:521px;">Tris</td>
			<td style="width:200px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">T-1378</td>
			<td style="width:505px;">Used in RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:521px;">Triton x-100</td>
			<td style="width:200px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">X100</td>
			<td style="width:505px;">Used in RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:521px;">Ultrapure Water</td>
			<td style="width:200px;">Millipore</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">Sterile water, derived from MiliQ water purification system</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:521px;">Equipment and Material</td>
			<td style="width:200px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:50px;">24-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CL S3526</td>
			<td>Flat Bottom with Lid</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;">Amersham Potran Premium (nitrocellulose membrane)&#160;</td>
			<td>GE</td>
			<td>29047575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:521px;">Carbogen Mixture</td>
			<td style="width:200px;">White Martins</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">95% O2, 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:46px;width:521px;">CO2 incubator</td>
			<td style="width:200px;">New Brunswick Scientific</td>
			<td style="width:344px;">CO-24</td>
			<td style="width:505px;">Incubation of slices 5% CO2, 36&#186;C</td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;width:521px;">Microplate Reader</td>
			<td style="width:200px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:521px;">Microtubes</td>
			<td style="width:200px;">Greiner</td>
			<td style="width:344px;">001608</td>
			<td style="width:505px;">1,5mL microtube</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:521px;">Motorized pestle</td>
			<td style="width:200px;">Kimble Chase</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:521px;">Plastic spoon</td>
			<td style="width:200px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">Size of a dessert spoon</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:521px;">Razor Blade</td>
			<td style="width:200px;">Bic</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">Chrome Platinum, used in slicing with vibratome</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:37px;width:521px;">Scalpel Blade</td>
			<td style="width:200px;">Becton Dickinson (BD)</td>
			<td style="width:344px;">Number 24</td>
			<td style="width:505px;">Used for slicing of tissue; recommended same size or smaller</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:34px;width:521px;">Superglue (Loctite Super Bonder)</td>
			<td style="width:200px;">Henkel</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;">Composition: Etilcianoacrilato; 2-Propenoic acid; 6,6&#39;-di-terc-butil-2,2&#39;-metilenodi-p-cresol; homopolymer</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;">Vibratome&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14047235612 - VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:37px;width:521px;">Name of Material/ Equipment for Immunohistochemistry</td>
			<td style="width:200px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:41px;">Antibody anti-NeuN (mouse)</td>
			<td>Millipore&#160;</td>
			<td>MAB377</td>
			<td>Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:521px;">Antibody anti-GFAP (mouse)</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td style="width:344px;">MAB360</td>
			<td>Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Antibody anti-Iba1 (rabbit)</td>
			<td style="width:200px;">Abcam</td>
			<td style="width:344px;">EPR16588 - ab178846</td>
			<td>Dilution 1:2,000 in Phosphate Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Biotinylated anti-mouse IgG Antibody (H+L)</td>
			<td style="width:200px;">Vector</td>
			<td style="width:344px;">BA-9200</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">DAB</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">D-9015</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Entellan</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td align="right" style="width:344px;">107960</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Ethanol</td>
			<td style="width:200px;">Merck</td>
			<td style="width:344px;">1.00983.1000</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Gelatin</td>
			<td style="width:200px;">Synth</td>
			<td style="width:344px;">00G1002.02.AE</td>
			<td style="width:505px;">Used for coating slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SM2010R</td>
			<td>Equipped with Freezing Stage (BFS-10MP, Physiotemp), set to -40&#186;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal Donkey Serum</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:200px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">158127</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit)</td>
			<td>GE</td>
			<td>NA934-1ML</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Slides (Star Frost)</td>
			<td>Knittel Glaser</td>
			<td></td>
			<td>Gelatin coated slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td style="width:200px;">Vetec</td>
			<td>60REAVET017050</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Vectastain ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard)</td>
			<td style="width:200px;">Vector</td>
			<td style="width:344px;">PK-4000, Kit Standard</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:521px;">Xylene</td>
			<td style="width:200px;">Synth</td>
			<td style="width:344px;">01X1001.01.BJ</td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

short-term free-floating slice cultures from the adult human brain

Las culturas organotípicas, o de rebanadas, se han empleado ampliamente para modelar aspectos del sistema nervioso central que funcionan in vitro. A pesar del potencial de los cultivos de rebanadas en neurociencia, estudios que utilizan tejido nervioso adulto para preparar tales cultivos son todavía escasos, particularmente los de sujetos humanos. El uso de tejido humano adulto para preparar cultivos de rebanadas es particularmente atractivo para mejorar la comprensión de las neuropatologías humanas, ya que poseen propiedades únicas típicas del cerebro humano maduro que carece de rodajas producidas a partir de roedores (generalmente neonatales) tejido nervioso. Este protocolo describe cómo utilizar el tejido cerebral recogido de donantes humanos vivos sometidos a cirugía cerebral resectiva para preparar cultivos de rebanadas a corto plazo y flotantes. También se presentan procedimientos para mantener y realizar ensayos bioquímicos y de biología celular utilizando estos cultivos. Los resultados representativos demuestran que la laminación cortical humana típica se conserva en rodajas después de 4 días in vitro (DIV4), con la presencia esperada de los principales tipos de células neurales. Además, las rodajas en DIV4 se someten a una muerte celular robusta cuando se les reta con un estímulo tóxico (H2O2), lo que indica el potencial de este modelo para servir como plataforma en los ensayos de muerte celular. Este método, una alternativa más simple y rentable al protocolo ampliamente utilizado utilizando inserciones de membrana, se recomienda principalmente para ejecutar ensayos a corto plazo destinados a desentrañar mecanismos de neurodegeneración detrás de enfermedades cerebrales asociadas a la edad. Por último, aunque el protocolo se dedica al uso de tejido cortical recogido de pacientes sometidos a tratamiento quirúrgico de epilepsia del lóbulo temporal farmacorresistente, se argumenta que el tejido recogido de otras regiones/condiciones cerebrales también debe considerados como fuentes para producir cultivos similares de sectores flotantes.

Un aspecto crítico para evaluar la calidad y la salud de las rebanadas cultivadas es la presencia y morfología típica de los tipos de células neurales, neuronas y células gliales esperadas. La arquitectura típica de la laminación cortical humana se observó en una rebanada en DIV4, revelada por inmunoetiquetado neuronal (Figura 2D). Además, también se observó la presencia esperada de microglia y astroglia(Figura 2B,C)....

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Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain

Se presenta un protocolo para preparar cultivos de rebanadas flotantes a partir del cerebro humano adulto. El protocolo es una variación del método de cultivo de rebanadas ampliamente utilizado utilizando inserciones de membrana. Es simple, rentable y recomendado para ejecutar ensayos a corto plazo destinados a desentrañar mecanismos de neurodegeneración detrás de las enfermedades cerebrales asociadas a la edad.

Cultivos de rebanadas flotantes a corto plazo del cerebro humano adulto

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of ...

Presentamos un protocolo para preparar cultivos de rebanadas flotantes a partir de tejido cerebral recogido de donantes humanos vivos sometidos a cirugía cerebral resectiva. Este cultivo es susceptible de realizar ensayos bioquímicos y de biología celular o inmunohistoquímica. Se espera que contribuya a la esclareciación del mecanismo subyacente a la neurodegeneración en enfermedades cerebrales asociadas.La principal ventaja de esta técnica es que es una alternativa más simple y rentable al protocolo de cultivo de rebanadas clásica utilizando inserciones de membrana. Aunque el protocolo general no es complejo, algunos pasos como la eliminación de meninges, el encolado del tejido al disco de la muestra de vibratoma y la resección para la inmunohistoquímica se entienden mejor cuando se demuestra visualmente. Ayudar a demostrar el procedimiento serán Niele Mendes y Glaucia Almedia, que son estudiantes de posgrado, y Giovanna Nogueira, otra estudiante de posgrado.Para comenzar este procedimiento, agregue sal a un cubo de hielo. Transfiera la solución de corte a este cubo y déjela reposar bajo la mezcla de carbógeno burbujeando durante al menos 20 minutos antes de su uso. A continuación, preparar un bloque de 3% de agarosa que es de unos dos centímetros por dos centímetros por dos centímetros por dos centímetros.Súper pegar el bloque de agarosa al disco de muestra de vibratoma con el fin de crear soporte mecánico adicional a la muestra de tejido durante el corte. En el vibratome, ajuste el espesor de la sección a 200 micrómetros, la frecuencia de vibración a 100 hercios, y elija una velocidad de corte entre 0,5 y 1,0 milímetros por segundo. A continuación, bloquee la bandeja de búfer de vibratomo en la base del vibratomo y agregue hielo para mantenerla refrigerada antes de recibir la solución de corte y la muestra y durante todo el procedimiento de corte.En primer lugar, configure un aparato de transporte que consista en un cilindro de gas portátil que contenga una mezcla de carbógeno conectada a una válvula de flujo de presión que controle la salida de gas conectada a un tubo de silicona que conecte esa salida de gas con el buque de transporte y el buque de transporte que contiene la solución de transporte y el hielo para el enfriamiento de la muestra durante el transporte. Recoger y transportar el espécimen y el transporte como se describe en el protocolo de texto. Transfiera el espécimen a un plato de Petri que contenga solución de corte.Usando herramientas quirúrgicas finas, retire cuidadosamente la mayor cantidad de meninges restantes como sea posible. Elija la mejor orientación de la muestra para la producción de rodajas con las características particulares del diseño experimental y utilice una hoja de bisturí número 24 para recortar una superficie plana para ser la base que se pegará al disco de la muestra. Usando una cuchara de plástico de eliminación y pinceles delicados, recoja el fragmento de la placa Petri y seque el exceso de solución con papel de filtro.A continuación, utilice súper pegamento para unir el tejido al plato de la muestra de vibratoma hasta que se adhiera firmemente al plato y en contacto con el bloque de agarosa. Coloque el disco de muestra de vibratomo en la bandeja de búfer del vibratomo. Fije el portacuchillas en su lugar con la cuchilla de afeitar firmemente fijada.Agregue la solución de corte y asegúrese de que está cubriendo tanto la muestra como la hoja. A continuación, comience a cortar la muestra en rodajas de 200 micrómetros. Transfiera las rodajas de la bandeja tampón a una placa de Petri que contenga solución de corte y recorte los bordes sueltos y el exceso de materia blanca a una proporción de aproximadamente 70% de corteza y 30% de materia blanca.En un armario de flujo laminar, agregue 600 microlitros de medio de cultivo a cada pozo de una placa de 24 pozos e incubar a 36 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono durante al menos 20 minutos antes de enchapar las rodajas. Después de esto, usa un pincel para planchar una rebanada en cada pozo. Si hay pozos no utilizados en la placa, llénelos con 400 microlitros de agua estéril.Incubar a 36 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono. Suplemento 10 mililitros del medio de cultivo previamente preparado con factor neurotrófico derivado del cerebro a una concentración de 50 nanogramos por mililitro. Después de ocho a 16 horas, retire 333 microlitros del medio acondicionado de cada pozo y agregue 133 microlitros de medios frescos suplementados con BDNF.Sustituya un tercio del medio acondicionado por un medio fresco suplementado con BDNF cada 24 horas. En primer lugar, transfiera las rodajas de los pozos que contienen el medio de cultivo a una nueva placa de 24 pozos que contenga PBS. Retire el PBS de cada pozo y reemplácelo por un mililitro de 4%paraformaldehído.Incubar durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, retire cuidadosamente el paraformaldehído de los pozos y reemplácelo por un mililitro de solución de sacarosa al 30%. Incubar a cuatro grados centígrados durante 48 horas.Después de 48 horas, ajuste el microtoma de congelación a 40 grados Celsius negativos. Preparar una base de sacarosa en la etapa de microtomo donde se deben colocar las rodajas. Después de que se congela por completo, cortar parte de la sacarosa congelada para producir una superficie plana en la que se colocará la rebanada.A continuación, coloque cada rebanada sobre una película de plástico estirada y use un pincel para aplanar el tejido. En un solo movimiento, transfiera la rebanada estirada a la base de sacarosa congelada. Después de que la rebanada haya descansado durante cinco a 10 minutos para congelarse correctamente, corte la rebanada en secciones de 30 micrómetros.Transfiera las secciones de 30 micrómetros a un plato Petri que contenga PBS y proceda a un protocolo de histología adecuado para el diseño experimental. Al determinar la calidad y la salud de las rebanadas cultivadas, un aspecto crítico a evaluar es la presencia y morfología típica de los tipos de células neuronales, neuronas y células gliales esperados. La arquitectura típica de la laminación cortical humana se observa en una rebanada al día in vitro cuatro reveladas por inmunoetiquetado neuronal.Además, también se observa la presencia esperada de microglia y astroglia. Estos resultados demuestran que la arquitectura tisular no se ve afectada significativamente ni por el procedimiento quirúrgico, el procesamiento de la muestra o por el período a corto plazo in vitro. La respuesta neuronal a la despolarización inducida por cloruro de potasio también se ha cuantificado en rodajas cultivadas siguiendo la fosforilación ERK.Curiosamente, un claro aumento de la fosforilación ERK se observa en rodajas tratadas con cloruro de potasio al día in vitro cuatro. Finalmente, la respuesta de las rodajas al día in vitro cuatro a un desafío tóxico se evalúa con un conocido inductor de estrés oxidativo peróxido de hidrógeno. La exposición de las rodajas a 300 peróxidos de hidrógeno militrolares durante 24 horas condujo a una fuerte disminución en la reducción de MTT.En conjunto, la muerte celular masiva observada en el día in vitro cinco rebanadas después del desafío del peróxido de hidrógeno y los resultados de despolarización inducida por cloruro de potasio indican la salud general preservada de las rebanadas en el día in vitro cuatro que responden a un estímulo tóxico como el estrés oxidativo. Este protocolo se dedica principalmente a estudios basados en ensayos que duran más de una semana, como la investigación de mecanismos moleculares de neurotoxicidad y neuroprotección por fármacos candidatos. Aunque este protocolo se dedica al uso de tejido cortical recogido de pacientes sometidos a tratamiento quirúrgico para la epilepsia del lóbulo temporal microrresistente, es probable que el tejido recogido de otras regiones o condiciones cerebrales también podría ser fuente para producir cultivos de rebanadas flotantes.Cultivos de corte del cerebro humano adulto pueden ser clave para avanzar en nuestra comprensión de las neuropatologías humanas debido a su circuito celular único y maquinaria molecular carente de rebanadas producidas a partir de cerebros de roedores.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Neurociencias

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